Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health par le biais des numéros d’attribution de subvention R37-CA260223, R21CA246414. Nous remercions le noyau de cytométrie en flux du NCSU pour sa formation et ses conseils sur l’analyse de cytométrie en flux. Les schémas ont été créés avec Biorender.com

Toutes les procédures impliquant des cellules primitives humaines et des vecteurs rétroviraux ont été effectuées conformément aux directives de sécurité biologique de l’Université d’État de Caroline du Nord et approuvées par le Bureau de la santé et de la sécurité environnementales. Des cellules mononucléées du sang périphérique humain ont été achetées sous forme de couches leucocytaires auprès de sources commerciales. Les cellules humaines primaires doivent être isolées des fractions d’enve...

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	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma:+recent+clinical+advances+and+future+challenges.">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li><li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells.">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li><li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+CAR+T-cells+forward.">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cell+therapy:+current+limitations+and+potential+strategies.">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).</li><li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy:+A+new+era+in+cancer+immunotherapy.">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>Lee, H. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells.">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications.">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li><li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering.">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate:+properties+and+biomedical+applications.">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li><li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering:+part+1.+Structure,+gelation+rate+and+mechanical+properties.">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li><li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+nondairy+beverages.">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li><li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation,+tissue+retention+and+systemic+capture.">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li><li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence.">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li><li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots.">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy.">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells.">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li><li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells.">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li><li>. PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis.">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).</li><li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24</a> (2022)</li><li>Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

La thérapie cellulaire CAR-T continue de susciter de l’intérêt pour la recherche et les applications commerciales. Malgré le succès de la thérapie cellulaire CAR-T dans le traitement des cancers du sang, le coût élevé de la procédure limite son utilisation. Le protocole présenté ici introduit une nouvelle méthode pour le transfert de gènes viraux de lymphocytes T sans avoir besoin de spinoculation de plaques recouvertes de rétronectine. La production d’échafaudages d’alginate macroporeux secs pour f...

L’immunothérapie est devenue un paradigme révolutionnaire de traitement du cancer en raison de sa capacité à cibler spécifiquement les tumeurs, à limiter la cytotoxicité hors cible et à prévenir les rechutes. En particulier, la thérapie cellulaire à récepteur antigénique chimérique T (CAR-T) a gagné en popularité en raison de son succès dans le traitement des lymphomes et des leucémies. La FDA a approuvé la première thérapie cellulaire CAR-T en 2017 et, depuis lors, a approuvé quatre autres thérapies cellulaires CAR-T 1,2,3,4,5. Les CARs ont un domaine de reconnaissance d’antigène généralement constitué d’un fragment variable à chaîne unique d’un anticorps monoclonal spécifique d’un antigène associé à une tumeur 3,4. Lorsqu’un CAR interagit avec son antigène associé à la tumeur, les cellules CAR-T s’activent, entraînant une réponse antitumorale impliquant la libération de cytokines, la dégranulation cytolytique, l’expression du facteur de transcription et la prolifération des lymphocytes T. Pour produire des cellules CAR-T, le sang est prélevé sur le patient pour obtenir ses cellules T. Les CARs sont génétiquement ajoutés aux lymphocytes T du patient à l’aide d’un virus. Les cellules CAR-T sont cultivées in vitro et réinjectées au patient 2,3,4,6. La génération réussie de cellules CAR-T est déterminée par l’efficacité de transduction, qui décrit le nombre de cellules T génétiquement modifiées en cellules CAR-T.
Actuellement, l’étalon-or pour la génération de cellules CAR-T est la spinoculation des lymphocytes T activés et du virus sur des plaques recouvertes de rétronectine 7,8. La transduction commence lorsque les particules virales s’engagent à la surface des lymphocytes T. La rétronectine favorise la colocalisation du virus et des cellules en augmentant l’efficacité de liaison entre les particules virales et les cellules, améliorant la transduction 7,8. La rétronectine ne fonctionne pas bien seule et doit être accompagnée d’une spinoculation, qui améliore le transfert de gènes en concentrant les particules virales et en augmentant la perméabilité de surface de la cellule T, ce qui facilite l’infection virale8. Malgré le succès de la spinoculation sur des plaques recouvertes de rétronectine, il s’agit d’un processus complexe qui nécessite plusieurs cycles d’essorage et des réactifs coûteux. Par conséquent, d’autres méthodes de transfert de gènes viraux plus rapides et moins coûteuses sont hautement souhaitables.
L’alginate est un polysaccharide anionique naturel largement utilisé dans l’industrie biomédicale en raison de son faible coût, de son bon profil d’innocuité et de sa capacité à former des hydrogels lors du mélange avec des cations divalents 9,10,11,12. L’alginate est un polymère conforme aux BPF et est généralement reconnu comme sûr (GRAS) par la FDA13. L’alginate de réticulation avec les cations crée des hydrogels stables souvent utilisés dans la cicatrisation des plaies, l’administration de petits médicaments chimiques et de protéines, et le transport cellulaire 9,10,11,12,14,15,16. En raison de ses excellentes propriétés gélifiantes, l’alginate est le matériau préféré pour créer des échafaudages poreux par lyophilisation10,17. Ces caractéristiques de l’alginate en font un candidat attrayant pour la production d’un échafaudage capable de servir de médiateur au transfert de gènes viraux de cellules activées.
On décrit ici un protocole de fabrication d’échafaudages d’alginate macroporeux secs, connus sous le nom d’échafaudages Drydux, qui transduisent statiquement les lymphocytes T par transfert de gènes viraux17,18. Le processus de fabrication de ces échafaudages est illustré à la figure 1. Ces échafaudages éliminent le besoin de spinoculation des plaques recouvertes de rétronectine. Les échafaudages d’alginate macroporeux favorisent l’interaction des particules virales et des lymphocytes T pour permettre un transfert efficace des gènes en une seule étape sans affecter la fonctionnalité et la viabilité des lymphocytes T modifiés17. Lorsqu’ils sont suivis correctement, ces échafaudages d’alginate macroporeux ont une efficacité de transduction d’au moins 80%, ce qui simplifie et raccourcit le processus de transduction virale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figure 1 : Schéma et chronologie du protocole. (A) Calendrier de fabrication des échafaudages d’alginate macroporeux secs. L’alginate est réticulé avec le gluconate de calcium D et congelé pendant la nuit. Les échafaudages congelés sont lyophilisés pendant 72 h pour créer les échafaudages Drydux. (B) Chronologie de la transduction virale des cellules activées. Les cellules activées et le virus (MOI 2) sont ensemencés sur le dessus de l’échafaudage et incubés dans des milieux complets supplémentés en IL-7 et IL-15. Les échafaudages absorbent le mélange et favorisent le transfert de gènes viraux. L’EDTA est utilisé pour dissoudre les échafaudages et isoler les cellules transduites. Après avoir été lavé deux fois avec du PBS, le granulé de cellule peut être utilisé pour l’analyse. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate; PBMC = cellules mononucléées du sang périphérique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

Le génie génétique des lymphocytes T pour la thérapie cellulaire CAR-T est devenu au premier plan du traitement du cancer au cours des dernières années. Les cellules CAR-T sont produites par transfert de gènes viraux dans les cellules T. L’étalon-or actuel du transfert de gènes viraux implique la spinoculation de plaques recouvertes de rétronectine, ce qui est coûteux et prend beaucoup de temps. Il existe un besoin important de méthodes efficaces et rentables pour générer des cellules CAR-T. La méthode décrite ici est une méthode de fabrication d’échafaudages d’alginate macroporeux secs et peu coûteux, connus sous le nom d’échafaudages Drydux, qui favorisent efficacement la transduction virale des cellules T activées. Les échafaudages sont conçus pour être utilisés à la place de la spinoculation de référence des plaques enrobées de rétronectine ensemencées avec des virus et simplifient le processus de transmission des cellules. L’alginate est réticulé avec du gluconate de calcium D et congelé pendant la nuit pour créer les échafaudages. Les échafaudages congelés sont lyophilisés dans un lyophilisateur pendant 72 h pour compléter la formation des échafaudages macroporeux secs. Les échafaudages servent de médiateur au transfert de gènes viraux lorsque le virus et les lymphocytes T activés sont ensemencés ensemble sur le dessus de l’échafaudage pour produire des cellules génétiquement modifiées. Les échafaudages produisent >85% de transduction primaire des lymphocytes T, ce qui est comparable à l’efficacité de transduction de la spinoculation sur des plaques recouvertes de rétronectine. Ces résultats démontrent que les échafaudages d’alginate macroporeux secs constituent une alternative moins coûteuse et plus pratique à la méthode de transduction conventionnelle.

Ces échafaudages d’alginate macroporeux sont faciles à fabriquer et devraient sortir du lyophilisateur sous forme de disques poreux, duveteux et blancs. Bien que non étudiée dans cette expérience, la solution d’alginate de calcium peut être coulée dans différents moules pour créer des échafaudages de formes variables, en fonction des besoins de l’utilisateur 9,10. Les échafaudages sont électrostatiques et peuvent coller au couvercle de la plaque...

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Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Voici un protocole pour créer des échafaudages d’alginate macroporeux secs qui interviennent dans le transfert efficace de gènes viraux pour une utilisation dans le génie génétique des cellules T, y compris les cellules T pour la thérapie cellulaire CAR-T. Il a été démontré que les échafaudages transduisaient les lymphocytes T primaires activés avec une transduction de >85%.

Fabrication et utilisation d’échafaudages d’alginate macroporeux secs pour la transduction virale des lymphocytes T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Cette vidéo décrit un protocole pour créer et utiliser des échafaudages d’alginate macroporeux secs connus sous le nom de Drydux qui favorisent efficacement la transduction des lymphocytes T activés. Drydux est conçu pour être utilisé à la place de la spinoculation de référence des plaques enrobées de rétroNectine ensemencées avec du virus et simplifie le processus de transmission des cellules. Drydux a une efficacité de transduction comparable à celle de la spinoculation sur plaques revêtues de rétronectine et constitue une alternative moins chère et plus pratique à la méthode de transduction conventionnelle.Tout d’abord, préparez une solution à 0,4% de gluconate de calcium-D. Ajouter de l’eau DI filtrée stérile au gluconate de calcium dans un bécher. Remuer à vitesse moyenne jusqu’à ce que le gluconate de calcium soit dissous, ce qui prend environ 1 1/2 heure.Une fois dissous, filtrer stérile la solution de calcium-D-gluconate de calcium. Cette solution peut être conservée à température ambiante. Ensuite, préparez une solution d’alginate à 2%.Cela peut être accompli à l’aide d’un flacon à bouchon à vis ou d’un bécher. Les deux seront montrés ici. Ajouter soigneusement l’alginate ultrapur dans le récipient.Ajouter la quantité appropriée d’eau DI à l’alginate. Choisissez la plus grande barre d’agitation possible qui n’empêchera pas le mélange et ajoutez-la au récipient. Remuer la solution à puissance élevée jusqu’à ce que l’alginate se dissolve, ce qui prend environ une heure.S’il y a de gros amas d’alginate sur le côté du vaisseau, inclinez le vaisseau latéralement pour les déloger. Les petits touffes se dissolvent au fil des heures et ne sont pas préoccupants. Une fois la solution d’alginate à 2 % dissoute, réduire la vitesse d’agitation.Ajouter lentement un volume égal de la solution de gluconate de calcium D à la solution d’alginate. L’ajouter lentement aidera à empêcher la formation de touffes de réticulation. Lorsque la solution de gluconate de calcium a été ajoutée, augmenter la vitesse d’agitation et remuer vigoureusement pendant 15 minutes.Inclinez le vaisseau latéralement pour enlever les touffes qui ont pu se former. Après avoir agité vigoureusement pendant 15 minutes, assurez-vous qu’il n’y a pas de touffes dans la solution. Pipeter la solution dans une plaque de 48 ou 24 puits.Pour une plaque de 48 puits, pipeter 300 microlitres dans chaque puits. Assurez-vous de lancer lentement et de changer souvent les pointes, car la solution sera visqueuse et pourrait coller à la pointe. Pour une plaque de 24 puits, pipeter un millilitre dans chaque puits.Encore une fois, lancez lentement et changez souvent les pointes des pipettes. Couvrir les plaques de puits avec un couvercle et congeler à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Préparez les plaques pour le lyophile en retirant les couvercles et en fixant le dessus avec des lingettes et des élastiques.Placez les plaques dans le tube lyophiliseur et mettez le lyophiliseur pendant 72 heures. Après 72 heures, retirez la plaque du lyophiliseur. Les échafaudages sont maintenant prêts à être utilisés pour la transduction.Si vous n’utilisez pas les échafaudages immédiatement, scellez la plaque avec Parafilm et conservez à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour un stockage à long terme, il est recommandé de sceller la plaque sous vide en plus de l’étanchéité avec Parafilm. Concentrer le surnageant viral en centrifugeant deux millilitres de solution virale à travers un filtre centrifuge à 1 500 g pendant 10 minutes.100 à 200 microlitres de virus concentré sont nécessaires par échafaudage. Faites tourner pendant quelques minutes supplémentaires si le volume de la solution virale concentrée est supérieur à 200 microlitres. Pour chaque échafaudage, fabriquer une partie aliquote de 1 million de lymphocytes T activés en suspension dans 50 microlitres de milieux de culture cellulaire complets.Ajouter le virus concentré à la suspension cellulaire. Le volume total de la suspension du virus cellulaire ne doit pas dépasser 200 microlitres pour un échafaudage de 48 puits, ou 350 microlitres pour un échafaudage de 24 puits. Ajouter le mélange de virus cellulaires goutte à goutte au sommet de l’échafaudage sec.Pour les expériences de contrôle négatif, utiliser des milieux de culture cellulaire complets à la place du virus concentré. Ajouter cette suspension cellulaire au sommet de l’échafaudage sec. Incuber les échafaudages dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes.Retirez les échafaudages de l’incubateur. Les échafaudages doivent absorber complètement la solution pendant ce temps. Pour induire la prolifération, ajouter des milieux de culture cellulaire complets supplémentés en IL-7 et IL-15 à chaque puits.IL-2 peut également être utilisé. Pour un échafaudage de 24 puits, ajoutez un millilitre. Pour un échafaudage de 48 puits, ajoutez 500 microlitres.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Les cellules vont proliférer au cours des 72 heures, ce qui peut rendre le média orange. Retirez l’excès de média de chaque puits.Pour isoler les cellules de l’échafaudage, ajoutez une solution d’EDTA 0,25 molaire à chaque échafaudage. Ajoutez un millilitre pour les échafaudages à 24 puits, ou 300 microlitres pour les échafaudages à 48 puits. Laissez reposer l’assiette ou agitez doucement pendant trois à quatre minutes.Une fois la plus grande partie dissoute, introduire et sortir doucement à l’intérieur du puits. Quelques étapes de pipetage peuvent être nécessaires pour dissoudre complètement l’échafaudage. Transférer la solution dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.Lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ajouter 12 millilitres de PBS à chaque tube de centrifugation. Centrifuger à 400 g pendant cinq minutes.Une pastille de cellule se formera au fond du tube. Aspirer la solution surnageante et répéter le lavage. Veillez à éliminer complètement le surnageant à chaque lavage, car il est crucial de se débarrasser de tout l’EDTA.Après un deuxième lavage avec du PBS, le granulé de cellule est prêt pour l’analyse. La cytométrie de flux a été utilisée pour déterminer l’efficacité de transduction de chaque groupe. Des cellules non transduites ont été utilisées comme témoin négatif et n’ont montré aucune transduction.Les cellules ensemencées sur des échafaudages sans rétrovirus GFP n’ont également montré aucune transduction. Le groupe Drydux, qui avait activé des cellules ensemencées sur les échafaudages d’alginate macroporeux secs, a montré une transduction de 85%, juste inférieure au groupe RetroNectine. Ces résultats démontrent que les échafaudages Drydux transduisent efficacement les cellules par transfert de gènes rétroviraux sans avoir besoin de spinoculation des plaques recouvertes de rétroNectine.Les échafaudages Drydux présentent une efficacité de transduction élevée comparable à celle de la rétroNectine, offrant une méthode alternative pour transduire les lymphocytes T. En raison du faible coût de fabrication des échafaudages Drydux, ce processus a le potentiel de réduire considérablement le coût des thérapies par cellules CAR-T.

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