Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מספרי פרס מענק R37-CA260223, R21CA246414. אנו מודים לליבת הציטומטריה של זרימה NCSU על הדרכה והדרכה בניתוח ציטומטריה של זרימה. סכמות נוצרו עם Biorender.com

כל ההליכים המערבים תאי עליונות אנושית וקטורים רטרו-ויראליים בוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת צפון קרוליינה ואושרו על ידי משרד הבריאות והבטיחות הסביבתית. תאי דם חד-גרעיניים של דם היקפי אנושי נרכשו כמעילי באפי ממקורות מסחריים. תאים אנושיים ראשוניים חייבים להיות מבודדי?...

<ol>
	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma:+recent+clinical+advances+and+future+challenges.">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li><li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells.">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li><li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+CAR+T-cells+forward.">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cell+therapy:+current+limitations+and+potential+strategies.">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).</li><li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy:+A+new+era+in+cancer+immunotherapy.">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>Lee, H. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells.">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications.">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li><li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering.">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate:+properties+and+biomedical+applications.">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li><li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering:+part+1.+Structure,+gelation+rate+and+mechanical+properties.">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li><li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+nondairy+beverages.">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li><li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation,+tissue+retention+and+systemic+capture.">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li><li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence.">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li><li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots.">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy.">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells.">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li><li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells.">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li><li>. PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis.">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).</li><li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24</a> (2022)</li><li>Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

טיפול בתאי CAR-T ממשיך לצבור עניין הן ביישומים מחקריים והן ביישומים מסחריים. למרות ההצלחה שיש לטיפול בתאי CAR-T בטיפול בסרטן הדם, העלות הגבוהה של ההליך מגבילה את השימוש בו. הפרוטוקול המוצג כאן מציג שיטה חדשה להעברת גנים נגיפיים של תאי T ללא צורך בספינוקולציה של צלחות מצופות רטרונקטין. ייצור פיג...

אימונותרפיה התגלתה כפרדיגמה מהפכנית לטיפול בסרטן בשל יכולתה להתמקד ספציפית בגידולים, להגביל ציטוטוקסיות מחוץ למטרה ולמנוע הישנות. במיוחד, טיפול בתאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR-T) צבר פופולריות בשל הצלחתו בטיפול בלימפומות ולוקמיה. ה-FDA אישר את הטיפול הראשון בתאי CAR-T בשנת 2017, ומאז אישר ארבעה טיפולים נוספים בתאי CAR-T 1,2,3,4,5. ל- CARs יש תחום זיהוי אנטיגן המורכב בדרך כלל מקטע משתנה שרשרת יחיד של נוגדן חד שבטי שהוא ספציפי לאנטיגןהקשור לגידול 3,4. כאשר CAR מקיים אינטראקציה עם האנטיגן הקשור לגידול שלו, תאי CAR-T מופעלים, מה שמוביל לתגובה אנטי-סרטנית הכוללת שחרור ציטוקינים, דה-גרנולציה ציטוליטית, ביטוי גורם שעתוק והתפשטות תאי T. כדי לייצר תאי CAR-T, הדם נאסף מהחולה כדי לקבל את תאי ה- T שלהם. CARs מתווספים גנטית לתאי T של המטופל באמצעות וירוס. תאי CAR-T גדלים במבחנה ומוחדרים בחזרה לחולה 2,3,4,6. ייצור מוצלח של תאי CAR-T נקבע על ידי יעילות ההתמרת, המתארת את מספר תאי ה-T המהונדסים גנטית לתאי CAR-T.
נכון לעכשיו, תקן הזהב לייצור תאי CAR-T הוא ספינוקולציה של תאי T מופעלים ונגיפים על לוחות מצופים רטרונקטין 7,8. ההתמרה מתחילה כאשר חלקיקים נגיפיים מתקשרים עם פני השטח של תאי T. רטרונקטין מקדם קולוקליזציה של נגיף ותאים על ידי הגברת יעילות הקשירה בין חלקיקי הנגיף לתאים, מה שמשפר את הטרנסדוקציה 7,8. רטרונקטין אינו פועל היטב בפני עצמו וצריך להיות מלווה בספינוקולציה, המשפרת את העברת הגנים על ידי ריכוז החלקיקים הנגיפיים והגדלת חדירות פני השטח של תא T, מה שמאפשר זיהום נגיפי קל יותר8. למרות ההצלחה של ספינוקולציה על לוחות מצופים רטרונקטין, זהו תהליך מורכב הדורש מחזורי ספין מרובים וריאגנטים יקרים. לכן, שיטות חלופיות להעברת גנים ויראליים מהירים וזולים יותר רצויות מאוד.
אלגינט הוא רב-סוכר אניוני טבעי הנמצא בשימוש נרחב בתעשייה הביו-רפואית בשל עלותו הנמוכה, פרופיל הבטיחות הטוב ויכולתו ליצור הידרוג'לים בעת ערבוב עם קטיונים דיוולנטיים 9,10,11,12. אלגינט הוא פולימר תואם GMP ובדרך כלל מוכר כבטוח (GRAS) על ידי ה-FDA13. קישור צולב של אלגינט עם קטיונים יוצר הידרוג'לים יציבים המשמשים לעתים קרובות לריפוי פצעים, העברת תרופות כימיות קטנות וחלבונים, והובלת תאים 9,10,11,12,14,15,16. בשל תכונות הג'ל המצוינות שלו, אלגינט הוא החומר המועדף ליצירת פיגומים נקבוביים על ידיייבוש בהקפאה של 10,17. מאפיינים אלה של אלגינט הופכים אותו למועמד אטרקטיבי לייצור פיגום שיכול לתווך העברת גנים נגיפית של תאים פעילים.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא פרוטוקול לייצור פיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים, המכונים פיגומי Drylux, המתמרים באופן סטטי תאי T על ידי העברת גנים נגיפיים17,18. תהליך ייצור הפיגומים האלה מוצג באיור 1. פיגומים אלה מבטלים את הצורך בספינוקולציה של לוחות מצופים רטרונקטין. פיגומי האלגינט המקרו-נקבוביים מעודדים אינטראקציה של חלקיקים נגיפיים ותאי T כדי לאפשר העברת גנים יעילה בשלב אחד מבלי להשפיע על הפונקציונליות והכדאיות של תאי T מהונדסים17. כאשר עוקבים אחריהם נכון, פיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים אלה הם בעלי יעילות התמרה של לפחות 80%, מה שמפשט ומקצר את תהליך ההתמרה הנגיפית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> איור 1: סכימה וציר זמן של הפרוטוקול . (A) ציר הזמן להכנת פיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים. אלגינט מקושר באופן צולב עם סידן-D-גלוקונאט וקפוא למשך הלילה. הפיגומים הקפואים עוברים ליופיליזציה למשך 72 שעות כדי ליצור את פיגומי Drydox. (B) ציר הזמן להתמרה נגיפית של תאים פעילים. תאים פעילים ונגיפים (MOI 2) נזרעים על גבי הפיגום ודוגרים במדיה מלאה בתוספת IL-7 ו- IL-15. הפיגומים סופגים את התערובת ומקדמים העברת גנים נגיפית. EDTA משמש להמסת הפיגומים ולבידוד התאים המתמרים. לאחר שטיפה פעמיים עם PBS, כדור התא יכול לשמש לניתוח. קיצורים: PBS = מלח עם מאגר פוספטים; PBMCs = תאי דם חד-גרעיניים היקפיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

הנדסה גנטית של תאי T לטיפול בתאי CAR-T הגיעה לחזית הטיפול בסרטן בשנים האחרונות. תאי CAR-T מיוצרים על ידי העברת גנים נגיפיים לתאי T. תקן הזהב הנוכחי של העברת גנים ויראליים כרוך בספינוקולציה של צלחות מצופות רטרונקטין, שהיא יקרה וגוזלת זמן. קיים צורך משמעותי בשיטות יעילות וחסכוניות ליצירת תאי CAR-T. מתוארת כאן שיטה לייצור פיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים זולים ויבשים, המכונים פיגומי Drylux, המקדמים ביעילות התמרה נגיפית של תאי T פעילים. הפיגומים מתוכננים לשימוש במקום ספינוקולציה בתקן זהב של צלחות מצופות רטרונקטין שנזרעו בנגיף ולפשט את תהליך התמרת התאים. אלגינט מקושר באופן צולב עם סידן-D-גלוקונאט וקפוא למשך הלילה ליצירת הפיגומים. הפיגומים הקפואים מיובשים בהקפאה בליאופיליזר למשך 72 שעות כדי להשלים את היווצרות הפיגומים המקרו-נקבוביים היבשים. הפיגומים מתווכים העברת גנים נגיפית כאשר נגיפים ותאי T מופעלים נזרעים יחד על גבי הפיגום כדי לייצר תאים מהונדסים גנטית. הפיגומים מייצרים >85% התמרה של תאי T ראשוניים, הדומה ליעילות ההתמרה של ספינוקולציה על לוחות מצופים רטרונקטין. תוצאות אלה מראות כי פיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים משמשים חלופה זולה ונוחה יותר לשיטת ההתמרות הקונבנציונלית.

פיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים אלה קלים להכנה ואמורים לצאת מהליופילייזר כדיסקים נקבוביים, רכים ולבנים. למרות שלא נחקר בניסוי זה, ניתן ליצוק תמיסת סידן-אלגינט לתבניות שונות כדי ליצור פיגומים בצורות שונות, בהתאם לצרכי המשתמש 9,10. הפיגומים הם אלקטרוסטטיים ועלולי...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

להלן פרוטוקול ליצירת פיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים המתווכים העברת גנים נגיפית יעילה לשימוש בהנדסה גנטית של תאי T, כולל תאי T לטיפול בתאי CAR-T. הודגם כי הפיגומים מתמרים תאי T ראשוניים פעילים עם התמרה של >85%.

ייצור ושימוש בפיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים להתמרה נגיפית של תאי T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

בסרטון זה מתואר פרוטוקול ליצירה ושימוש בפיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים המכונים Drydux המקדמים ביעילות התמרה של תאי T פעילים. Drydux מיועד לשימוש במקום ספינוקולציה בתקן זהב של צלחות מצופות רטרו-נקטין שנזרעו בווירוס ומפשטת את תהליך התמרת התאים. ל-Drydux יש יעילות התמרות הדומה לספינוקולציה על לוחות מצופים רטרו-נקטין, והיא משמשת כחלופה זולה ונוחה יותר לשיטת ההתמרות הקונבנציונלית.ראשית, הכינו תמיסה של 0.4% של סידן-D-גלוקונט. הוסיפו מי DI מסוננים סטריליים לסידן-D-גלוקונט בכוס. יש לערבב במהירות בינונית עד שהסידן-D-גלוקונאט מתמוסס, פעולה שנמשכת כשעה וחצי.לאחר ההמסה, מסננים סטרילי את תמיסת הסידן-D-גלוקונט. ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו פתרון של 2% אלגינט.ניתן להשיג זאת באמצעות בקבוקון מכסה בורג, או. שניהם יוצגו כאן. בזהירות להוסיף את אלגינט ultrapure לכלי.מוסיפים את הכמות המתאימה של מי DI לאלגינט. בחר את סרגל הערבוב הגדול ביותר האפשרי שלא יעכב ערבוב והוסף אותו לכלי. מערבבים את התמיסה על גבוה עד אלגינט מתמוסס, אשר לוקח בערך שעה.אם יש גושים אלגינטיים גדולים בצד הכלי, הטה את כלי השיט הצידה כדי לעקור אותם. גושים קטנים יתמוססו במשך שעה, ואינם סיבה לדאגה. לאחר שהתמיסה של 2% אלגינט מתמוססת, הפחיתו את מהירות הערבוב.הוסיפו באיטיות נפח שווה של תמיסת הסידן-D-גלוקונאט לתמיסת האלגינט. הוספתו באיטיות תסייע למנוע היווצרות גושים צולבים. לאחר הוספת תמיסת הסידן-גלוקונט, הגבירו את מהירות הערבוב, וערבבו במרץ במשך 15 דקות.הטה את הכלי הצידה כדי להסיר גושים שאולי נוצרו. לאחר ערבוב נמרץ במשך 15 דקות, ודא שאין גושים בתמיסה. צנד את התמיסה לצלחת של 48, או 24 בארות.עבור צלחת 48 באר, פיפטה 300 מיקרוליטר לתוך כל באר. הקפידו להטיל לאט ולהחליף טיפים לעתים קרובות, שכן הפתרון יהיה צמיג, ועלול להיצמד לקצה. עבור צלחת של 24 בארות, פיפטה מיליליטר אחד לתוך כל באר.שוב, יצקו לאט, והחליפו טיפים לפיפטה לעתים קרובות. מכסים את צלחות הבאר במכסה, ומקפיאים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הכינו את הצלחות לליופילייזר על ידי הסרת המכסים ואבטחת החלק העליון באמצעות מגבונים וגומיות.מניחים את הצלחות בצינור lyophilizer, ולשים על lyophilizer במשך 72 שעות. לאחר 72 שעות, להסיר את הצלחת מן lyophilizer. הפיגומים מוכנים כעת לשימוש לצורך התמרת.אם לא משתמשים בפיגומים באופן מיידי, אטמו את הצלחת עם Parafilm ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. לאחסון לטווח ארוך, מומלץ לאטום את הצלחת בוואקום בנוסף לאיטום עם Parafilm. רכז סופרנטנט ויראלי על ידי צנטריפוגה של שני מיליליטר של תמיסה ויראלית דרך מסנן צנטריפוגלי ב 1, 500 גרם במשך 10 דקות.יש צורך ב-100 עד 200 מיקרוליטרים של נגיף מרוכז לכל פיגום. סובבו במשך מספר דקות נוספות אם נפח תמיסת הנגיף המרוכז גדול מ-200 מיקרוליטר. עבור כל פיגום, הכינו אליקוט של מיליון תאי T פעילים התלויים ב-50 מיקרוליטרים של תרבית תאים שלמה.הוסף את הנגיף המרוכז לתרחיף התא. הנפח הכולל של תרחיף נגיף התא לא יעלה על 200 מיקרוליטר עבור פיגום 48 באר, או 350 מיקרוליטר עבור פיגום 24 באר. הוסיפו את תערובת נגיפי התאים לחלק העליון של הפיגום היבש.עבור ניסויי בקרה שלילית, השתמש במדיה מלאה של תרבית תאים במקום בנגיף מרוכז. הוסיפו את מתלה התא הזה לחלק העליון של הפיגום היבש. לדגור את הפיגומים בחממת תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 עד 60 דקות.מוציאים את הפיגומים מהאינקובטור. הפיגומים אמורים לספוג את התמיסה במלואה בתקופה זו. כדי לגרום להתפשטות, הוסיפו לכל באר תרבית תאים מלאה בתוספת IL-7 ו-IL-15.IL-2 יכול לשמש גם. עבור פיגום 24 בארות, להוסיף מיליליטר אחד. עבור פיגום 48 בארות, להוסיף 500 microliters.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. התאים יתרבו במשך 72 השעות, מה שעשוי להפוך את המדיה לכתומה. הסר עודפי מדיה מכל באר.כדי לבודד תאים מהפיגום, יש להוסיף תמיסת EDTA טוחנת 0.25 לכל פיגום. הוסף מיליליטר אחד עבור פיגומים של 24 בארות, או 300 מיקרוליטר עבור פיגומים של 48 בארות. תנו לצלחת לשבת, או התסיסו בעדינות במשך שלוש עד ארבע דקות.לאחר שהתמוסס ברובו, פיפטה פנימה והחוצה בעדינות בתוך הבאר. ייתכן שיהיה צורך בכמה שלבי צנרת פנימה והחוצה כדי להמיס את הפיגום במלואו. העבר את הפתרון לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. הוסף 12 מיליליטר של PBS לכל צינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 400 גרם במשך חמש דקות.כדור תא ייווצר בתחתית הצינור. שאפו את התמיסה הסופר-טבעית, וחזרו על הכביסה. יש להיזהר בהסרה מלאה של הסופר-נטנט עם כל שטיפה, שכן חיוני להיפטר מכל ה-EDTA.לאחר שטיפה עם PBS בפעם השנייה, כדור התא מוכן לניתוח. ציטומטריה של זרימה שימשה לקביעת יעילות ההתמרה של כל קבוצה. תאים שאינם מתמרים שימשו כבקרה שלילית, ולא הראו התמרת.גם תאים שנזרעו על פיגומים ללא רטרו-וירוס GFP לא הראו התמרת. קבוצת Drydux, שהפעילה תאים שנזרעו על פיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים, הראתה התמרה של 85%, מעט נמוך יותר מקבוצת הרטרו-נקטין. תוצאות אלה מראות כי פיגומי Drydux מתמרים ביעילות תאים על ידי העברת גנים רטרו-ויראליים ללא צורך בספינוקולציה של לוחות מצופים רטרו-נקטין.פיגומי Drydux מפגינים יעילות התמרה גבוהה הדומה לרטרונקטין, ומספקים שיטה חלופית להתמרת תאי T. בשל העלות הנמוכה של ייצור פיגומי Drydox, לתהליך זה יש פוטנציאל להוזיל משמעותית את העלות של טיפולים בתאי T של CAR.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

המצאה של מכאני מתכוונן ויו מתכת פיגומים עבור יישומים ביו

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

ייצור ואפיון של סיבים Griffithsin-השתנה פיגומים לצורך מניעת מחלות המועברות

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

התמרה והרחבה של תאי T ראשוניים בתשעה ימים עם אחזקה של זיכרון מרכזי מושגים

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים משולבים ממוטות מיקרוג'ל

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...