Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा अनुदान पुरस्कार संख्या R37-CA260223, R21CA246414 के माध्यम से समर्थित किया गया था। हम प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण पर प्रशिक्षण और मार्गदर्शन के लिए एनसीएसयू फ्लो साइटोमेट्री कोर को धन्यवाद देते हैं। Biorender.com के साथ योजनाबद्ध बनाए गए थे

मानव प्रधानता कोशिकाओं और रेट्रोवायरल वैक्टर से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को उत्तरी कैरोलिना स्टेट यूनिवर्सिटी के जैविक सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया गया था और पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक?...

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	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma:+recent+clinical+advances+and+future+challenges.">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li><li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells.">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li><li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+CAR+T-cells+forward.">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells.">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications.">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li><li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering.">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate:+properties+and+biomedical+applications.">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li><li>Kuo, C. K., Ma, P. 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PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis.">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).</li><li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24</a> (2022)</li><li>Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

सीएआर-टी सेल थेरेपी अनुसंधान और वाणिज्यिक अनुप्रयोगों दोनों के लिए रुचि हासिल करना जारी रखती है। रक्त कैंसर के इलाज में सीएआर-टी सेल थेरेपी की सफलता के बावजूद, प्रक्रिया की उच्च लागत इसके उपयोग को सीम?...

इम्यूनोथेरेपी विशेष रूप से ट्यूमर को लक्षित करने, ऑफ-टारगेट साइटोटॉक्सिसिटी को सीमित करने और रिलैप्स को रोकने की क्षमता के कारण एक क्रांतिकारी कैंसर उपचार प्रतिमान के रूप में उभरा है। विशेष रूप से, चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (सीएआर-टी) सेल थेरेपी ने लिम्फोमा और ल्यूकेमिया के इलाज में अपनी सफलता के कारण लोकप्रियता हासिल की है। एफडीए ने 2017 में पहली सीएआर-टी सेल थेरेपी को मंजूरी दी, और तब से, चार और सीएआर-टी सेल थेरेपी 1,2,3,4,5 को मंजूरी दी है। सीएआर में एक एंटीजन पहचान डोमेन होता है जिसमें आमतौर पर एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का एकल श्रृंखला चर टुकड़ा होता है जो ट्यूमर से जुड़े एंटीजन 3,4 के लिए विशिष्ट होता है। जब एक सीएआर अपने ट्यूमर से जुड़े एंटीजन के साथ बातचीत करता है, तो सीएआर-टी कोशिकाएं सक्रिय हो जाती हैं, जिससे साइटोकिन रिलीज, साइटोलाइटिक डिग्रेनुलेशन, ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर अभिव्यक्ति और टी सेल प्रसार शामिल होता है। सीएआर-टी कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए, रोगी से उनकी टी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए रक्त एकत्र किया जाता है। सीएआर को आनुवंशिक रूप से वायरस का उपयोग करके रोगी की टी कोशिकाओं में जोड़ा जाता है। सीएआर-टी कोशिकाओं को विट्रो में उगाया जाता है और रोगी मेंवापस 2,3,4,6 डाला जाता है। सीएआर-टी कोशिकाओं की सफल पीढ़ी पारगमन दक्षता द्वारा निर्धारित की जाती है, जो टी कोशिकाओं की संख्या का वर्णन करती है जो आनुवंशिक रूप से सीएआर-टी कोशिकाओं में संशोधित होती हैं।
वर्तमान में, सीएआर-टी सेल उत्पादन के लिए स्वर्ण मानक सक्रिय टी कोशिकाओं और रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों 7,8 पर वायरस का स्पिनोक्यूलेशन है। पारगमन तब शुरू होता है जब वायरल कण टी कोशिकाओं की सतह के साथ संलग्न होते हैं। रेट्रोनेक्टिन वायरल कणों और कोशिकाओं के बीच बाध्यकारी दक्षता को बढ़ाकर वायरस और कोशिकाओं के कोलोकलाइजेशन को बढ़ावा देता है,पारगमन 7,8 को बढ़ाता है। रेट्रोनेक्टिन अपने आप में अच्छी तरह से काम नहीं करता है और इसके साथ स्पिनोक्यूलेशन की आवश्यकता होती है, जो वायरल कणों को केंद्रित करके जीन हस्तांतरण को बढ़ाता है और टी सेल की सतह पारगम्यता को बढ़ाता है, जिससे आसान वायरल संक्रमण की अनुमति मिलतीहै। रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों पर स्पिनोक्यूलेशन की सफलता के बावजूद, यह एक जटिल प्रक्रिया है जिसके लिए कई स्पिन चक्रों और महंगे अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। इसलिए, वायरल जीन हस्तांतरण के लिए वैकल्पिक तरीके जो तेज और सस्ते हैं, अत्यधिक वांछनीय हैं।
एल्गिनेट एक प्राकृतिक आयनिक पॉलीसेकेराइड है जिसका उपयोग बायोमेडिकल उद्योग में बड़े पैमाने पर किया जाता है क्योंकि इसकी कम लागत, अच्छी सुरक्षा प्रोफ़ाइल, और 9,10,11,12 के साथ मिश्रण करने पर हाइड्रोगेल बनाने की क्षमता होती है। एल्गिनेट एक जीएमपी-अनुरूप बहुलक है और आमतौर पर एफडीए13 द्वारा सुरक्षित (जीआरएएस) के रूप में मान्यता प्राप्त है। पिंजरों के साथ क्रॉस-लिंकिंग एल्गिनेट स्थिर हाइड्रोगेल बनाता है जिसका उपयोग अक्सर घाव भरने, छोटी रासायनिक दवाओं और प्रोटीन के वितरण और सेल परिवहन 9,10,11,12,14,15,16 में किया जाता है। अपने उत्कृष्ट गेलिंग गुणों के कारण, एल्गिनेट10,17 को फ्रीज-सुखाकर छिद्रपूर्ण मचान बनाने के लिए पसंदीदा सामग्री है। एल्गिनेट की ये विशेषताएं इसे एक मचान बनाने के लिए एक आकर्षक उम्मीदवार बनाती हैं जो सक्रिय कोशिकाओं के वायरल जीन हस्तांतरण को मध्यस्थ कर सकती है।
यहां वर्णित शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसे ड्राइडक्स स्काफोल्ड्स के रूप में जाना जाता है, जो वायरल जीन ट्रांसफर17,18 द्वारा टी कोशिकाओं को स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस करता है। इन मचानों को बनाने की प्रक्रिया चित्र 1 में दर्शाई गई है। ये मचान रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों के पुन: ऑक्सीकरण की आवश्यकता को समाप्त करते हैं। मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचान वायरल कणों और टी कोशिकाओं की बातचीत को प्रोत्साहित करते हैं ताकि इंजीनियर टी कोशिकाओं की कार्यक्षमता और व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना एक ही चरण में कुशल जीन हस्तांतरण को सक्षम कियाजा सके। जब सही तरीके से पालन किया जाता है, तो इन मैक्रोपोरस एल्गिनेट स्काफोल्ड्स में कम से कम 80% की पारगमन दक्षता होती है, जो वायरल ट्रांसडक्शन प्रक्रिया को सरल और छोटा करती है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> चित्र 1: प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध और समयरेखा। (A) शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाने के लिए समयरेखा। एल्गिनेट कैल्शियम-डी-ग्लूकोनेट के साथ क्रॉस-लिंक्ड है और रात भर जमे हुए हैं। ड्राइडक्स मचानों को बनाने के लिए जमे हुए मचानों को 72 घंटे के लिए लियोफिलाइज्ड किया जाता है। (बी) सक्रिय कोशिकाओं के वायरल पारगमन के लिए समयरेखा। सक्रिय कोशिकाओं और वायरस (एमओआई 2) को मचान के शीर्ष पर बीज दिया जाता है और आईएल -7 और आईएल -15 के साथ पूरक पूर्ण मीडिया में इनक्यूबेट किया जाता है। मचान मिश्रण को अवशोषित करते हैं और वायरल जीन हस्तांतरण को बढ़ावा देते हैं। ईडीटीए का उपयोग मचानों को भंग करने और ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है। पीबीएस के साथ दो बार धोने के बाद, सेल पेलेट का उपयोग विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। संक्षेप: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; पीबीएमसी = परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

सीएआर-टी सेल थेरेपी के लिए टी कोशिकाओं की आनुवंशिक इंजीनियरिंग पिछले कुछ वर्षों में कैंसर के उपचार में सबसे आगे आ गई है। सीएआर-टी कोशिकाएं टी कोशिकाओं में वायरल जीन हस्तांतरण द्वारा निर्मित होती हैं। वायरल जीन ट्रांसफर के वर्तमान स्वर्ण मानक में रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों का स्पिनोक्यूलेशन शामिल है, जो महंगा और समय लेने वाला है। सीएआर-टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कुशल और लागत प्रभावी तरीकों की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। यहां वर्णित सस्ती, शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाने की एक विधि है, जिसे ड्राइडक्स मचानों के रूप में जाना जाता है, जो सक्रिय टी कोशिकाओं के वायरल पारगमन को कुशलतापूर्वक बढ़ावा देता है। मचानों को वायरस से भरे रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों के सोने के मानक स्पिनोक्यूलेशन के स्थान पर उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने की प्रक्रिया को सरल बनाता है। एल्गिनेट को कैल्शियम-डी-ग्लूकोनेट के साथ क्रॉस-लिंक किया जाता है और मचानों को बनाने के लिए रात भर फ्रीज किया जाता है। जमे हुए मचानों को शुष्क मैक्रोपोरस मचानों के गठन को पूरा करने के लिए 72 घंटे के लिए लियोफिलाइज़र में फ्रीज-सुखाया जाता है। मचान वायरल जीन हस्तांतरण की मध्यस्थता करते हैं जब वायरस और सक्रिय टी कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए मचान के शीर्ष पर एक साथ बीज दिया जाता है। मचान >85% प्राथमिक टी सेल ट्रांसडक्शन का उत्पादन करते हैं, जो रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों पर स्पिनोक्यूलेशन की पारगमन दक्षता के बराबर है। इन परिणामों से पता चलता है कि शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचान पारंपरिक पारगमन विधि के लिए एक सस्ता और अधिक सुविधाजनक विकल्प के रूप में काम करते हैं।

ये मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचान बनाने में आसान हैं और लियोफिलाइज़र से छिद्रपूर्ण, फूला हुआ और सफेद डिस्क के रूप में आना चाहिए। यद्यपि इस प्रयोग में अध्ययन नहीं किया गया है, कैल्शियम-एल्जिनेट समाधान को उपय...

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Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

यहां शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल है जो टी कोशिकाओं की आनुवंशिक इंजीनियरिंग में उपयोग के लिए कुशल वायरल जीन हस्तांतरण की मध्यस्थता करता है, जिसमें सीएआर-टी सेल थेरेपी के लिए टी कोशिकाएं शामिल हैं। मचानों को >85% पारगमन के साथ सक्रिय प्राथमिक टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए दिखाया गया था।

टी कोशिकाओं के वायरल ट्रांसडक्शन के लिए ड्राई मैक्रोपोरस एल्गिनेट स्काफोल्ड्स का निर्माण और उपयोग

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

इस वीडियो में वर्णित शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों को बनाने और उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है जिसे ड्राइडक्स के रूप में जाना जाता है जो सक्रिय टी-कोशिकाओं के पारगमन को कुशलतापूर्वक बढ़ावा देता है। ड्राइडक्स को वायरस के साथ बीज ति रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों के सोने के मानक स्पिनोक्यूलेशन के स्थान पर उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने की प्रक्रिया को सरल बनाता है। ड्राइडक्स में रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों पर स्पिनोक्यूलेशन के बराबर एक पारगमन दक्षता है, और पारंपरिक पारगमन विधि के लिए एक सस्ता और अधिक सुविधाजनक विकल्प के रूप में कार्य करता है।सबसे पहले, कैल्शियम-डी-ग्लूकोनेट का 0.4% समाधान तैयार करें। एक बीकर में कैल्शियम-डी-ग्लूकोनेट में बाँझ फ़िल्टर किए गए डीआई पानी जोड़ें। मध्यम गति पर हिलाएं जब तक कि कैल्शियम-डी-ग्लूकोनेट घुल न जाए, जिसमें लगभग 1 1/2 घंटे लगते हैं।एक बार घुलने के बाद, बाँझ कैल्शियम-डी-ग्लूकोनेट समाधान को फ़िल्टर करें। इस समाधान को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। इसके बाद, एक 2% एल्गिनेट समाधान तैयार करें।यह एक स्क्रू कैप शीशी, या एक बीकर का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। दोनों को यहां दिखाया जाएगा। सावधानी से बर्तन में अल्ट्राप्योर एल्गिनेट जोड़ें।एल्गिनेट में उचित मात्रा में डीआई पानी जोड़ें। संभव सबसे बड़ी हलचल पट्टी चुनें जो मिश्रण में बाधा नहीं डालेगी और इसे बर्तन में जोड़ें। एल्गिनेट के घुलने तक घोल को उच्च पर हिलाएं, जिसमें लगभग एक घंटे का समय लगता है।यदि पोत के किनारे कोई बड़ा एल्गिनेट क्लंप है, तो उन्हें हटाने के लिए पोत को किनारे झुकाएं। छोटे झुरमुट घंटे भर में घुल जाएंगे, और चिंता का कारण नहीं हैं। एक बार जब 2% एल्गिनेट समाधान घुल जाता है, तो सरगर्मी की गति कम करें।धीरे-धीरे एल्गिनेट समाधान में कैल्शियम-डी-ग्लूकोनेट समाधान की समान मात्रा जोड़ें। इसे धीरे-धीरे जोड़ने से क्रॉस-लिंकिंग क्लंप को बनने से रोकने में मदद मिलेगी। जब कैल्शियम-ग्लूकोनेट समाधान जोड़ा गया है, तो सरगर्मी की गति बढ़ाएं, और 15 मिनट के लिए जोर से हिलाएं।किसी भी झुरमुट को हटाने के लिए पोत को किनारे झुकाएं जो बन सकता है। 15 मिनट तक जोर से हिलाने के बाद, सुनिश्चित करें कि घोल में कोई झुरमुट नहीं है। समाधान को 48, या 24-वेल प्लेट में लिखें।48-वेल प्लेट के लिए, प्रत्येक कुएं में 300 माइक्रोलीटर पिपेट करें। धीरे-धीरे कास्ट करना सुनिश्चित करें और अक्सर युक्तियों को बदलें, क्योंकि समाधान चिपचिपा होगा, और टिप से चिपक सकता है। 24-वेल प्लेट के लिए, प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर पिपेट करें।फिर, धीरे-धीरे डालें, और अक्सर पिपेट युक्तियों को बदलें। कुएं की प्लेटों को ढक्कन के साथ कवर करें, और रात भर नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर जम जाएं। ढक्कन को हटाकर और वाइप्स और रबर बैंड के साथ शीर्ष को सुरक्षित करके लियोफिलाइज़र के लिए प्लेटें तैयार करें।प्लेटों को लियोफिलाइज़र ट्यूब में रखें, और 72 घंटों के लिए लियोफिलाइज़र पर रखें। 72 घंटों के बाद, प्लेट को लियोफिलाइज़र से हटा दें। मचान अब पारगमन के लिए उपयोग किए जाने के लिए तैयार हैं।यदि मचानों का तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो प्लेट को पैराफिल्म के साथ सील करें और आवश्यकता होने तक चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, पैराफिल्म के साथ सीलिंग के अलावा प्लेट को वैक्यूम सील करने की सिफारिश की जाती है। 10 मिनट के लिए 1,500 ग्राम पर एक केन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से वायरल समाधान के दो मिलीलीटर को सेंट्रीफ्यूज करके वायरल सुपरनैटेंट पर ध्यान केंद्रित करें।प्रति पाड़ 100 से 200 माइक्रोलीटर केंद्रित वायरस की आवश्यकता होती है। यदि केंद्रित वायरस समाधान की मात्रा 200 माइक्रोलीटर से अधिक है तो कुछ अतिरिक्त मिनटों के लिए स्पिन करें। प्रत्येक मचान के लिए, पूर्ण सेल कल्चर मीडिया के 50 माइक्रोलीटर में निलंबित 1 मिलियन सक्रिय टी-कोशिकाओं का एक एलिकोट बनाएं।सेल निलंबन में केंद्रित वायरस जोड़ें। सेल वायरस निलंबन की कुल मात्रा 48-वेल पाड़ के लिए 200 माइक्रोलीटर से अधिक नहीं होनी चाहिए, या 24-वेल मचान के लिए 350 माइक्रोलीटर से अधिक नहीं होनी चाहिए। सेल वायरस मिश्रण को सूखे मचान के शीर्ष पर ड्रॉप-वार जोड़ें।नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों के लिए, केंद्रित वायरस के स्थान पर पूर्ण सेल संस्कृति मीडिया का उपयोग करें। इस सेल निलंबन को सूखे मचान के शीर्ष पर जोड़ें। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में मचानों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 से 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेटर से मचानों को हटा दें। मचानों को इस समय के दौरान समाधान को पूरी तरह से अवशोषित करना चाहिए। प्रसार को प्रेरित करने के लिए, प्रत्येक कुएं में आईएल -7 और आईएल -15 के साथ पूरक पूर्ण सेल संस्कृति मीडिया जोड़ें।आईएल -2 का भी उपयोग किया जा सकता है। 24-अच्छी तरह से मचान के लिए, एक मिलीलीटर जोड़ें। 48-अच्छी तरह से मचान के लिए, 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाएं 72 घंटों में फैल जाएंगी, जो मीडिया को नारंगी बना सकती हैं। प्रत्येक कुएं से अतिरिक्त मीडिया को हटा दें।पाड़ से कोशिकाओं को अलग करने के लिए, प्रत्येक मचान में 0.25 मोलर ईडीटीए समाधान जोड़ें। 24-वेल स्काफोल्ड्स के लिए एक मिलीलीटर जोड़ें, या 48-वेल स्काफोल्ड्स के लिए 300 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट को बैठने दें, या धीरे से तीन से चार मिनट के लिए आंदोलन करें।एक बार ज्यादातर घुलने के बाद, पिपेट को कुएं के अंदर धीरे-धीरे अंदर और बाहर करें। मचान को पूरी तरह से भंग करने के लिए कुछ अंदर और बाहर पाइपिंग कदम आवश्यक हो सकते हैं। समाधान को 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोएं। प्रत्येक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 12 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें। पांच मिनट के लिए 400 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।ट्यूब के निचले भाग में एक सेल गोली बनेगी। सतह पर तैरने वाले घोल को एस्पिरेट करें, और धोने को दोहराएं। हर धोने के साथ सुपरनैटेंट को पूरी तरह से हटाने के लिए सावधान रहें क्योंकि सभी ईडीटीए से छुटकारा पाना महत्वपूर्ण है।दूसरी बार पीबीएस के साथ धोने के बाद, सेल पेलेट विश्लेषण के लिए तैयार है। प्रत्येक समूह की पारगमन दक्षता निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया गया था। गैर-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और कोई पारगमन नहीं दिखाया गया था।जीएफपी रेट्रोवायरस के बिना मचानों पर बीजित कोशिकाओं ने भी कोई पारगमन नहीं दिखाया। ड्राइडक्स समूह, जिसने शुष्क मैक्रोपोरस एल्गिनेट मचानों पर बीजित कोशिकाओं को सक्रिय किया था, ने 85% पारगमन दिखाया, जो रेट्रोनेक्टिन समूह की तुलना में कम था। इन परिणामों से पता चलता है कि ड्राइडक्स स्काफोल्ड्स ने रेट्रोनेक्टिन-लेपित प्लेटों के स्पिनोक्यूलेशन की आवश्यकता के बिना रेट्रोवायरल जीन ट्रांसफर द्वारा कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से ट्रांसड्यूस किया।ड्राइडक्स मचान रेट्रोनेक्टिन के बराबर उच्च पारगमन दक्षता प्रदर्शित करते हैं, जो टी-कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करते हैं। ड्राइडक्स मचानों के निर्माण की कम लागत के कारण, इस प्रक्रिया में सीएआर टी-सेल उपचारों की लागत को काफी कम करने की क्षमता है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

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Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए यंत्रवत् Tunable और bioactive धातु scaffolds के निर्माण

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

ईएससी व्युत्पन्न माउस श्वासनली उपकला decellularized फेफड़े Scaffolds का उपयोग कोशिकाओं की पीढ़ी

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Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

पिघल Electrospinning तीन आयामी पाली (ε-caprolactone) ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए नियंत्रणीय Morphologies के साथ मचान के लेखन

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

यौन संचारित संक्रमणों की रोकथाम के लिए Griffithsin-संशोधित फाइबर पाड़ों का निर्माण और लक्षण वर्णन

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

विसेलुलर उपास्थि व्युत्पंन मैट्रिक्स पाड़ों का निर्माण

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

सेंट्रल मेमोरी फेनोटाइप के रखरखाव के साथ नौ दिनों में प्राथमिक टी कोशिकाओं का ट्रांसडक्शन और विस्तार

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

माइक्रोजेल रॉड से इंटरलिंक्ड मैक्रोपोरस 3 डी स्काफोल्ड्स

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...