Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health attraverso i numeri di sovvenzione R37-CA260223, R21CA246414. Ringraziamo il nucleo di citometria a flusso NCSU per la formazione e la guida sull'analisi della citometria a flusso. Gli schemi sono stati creati con Biorender.com

Tutte le procedure che coinvolgono cellule primate umane e vettori retrovirali sono state eseguite in conformità con le linee guida sulla sicurezza biologica della North Carolina State University e approvate dall'Ufficio per la salute e la sicurezza ambientale. Le cellule mononucleate del sangue periferico umano sono state acquistate come buffy coat da fonti commerciali. Le cellule umane primarie devono essere isolate dalle frazioni del rivestimento di buffy umano e richiedono l'autorizzazione di livello 2 di biosicurez...

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PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

La terapia cellulare CAR-T continua a guadagnare interesse sia per la ricerca che per le applicazioni commerciali. Nonostante il successo della terapia cellulare CAR-T nel trattamento dei tumori del sangue, l'alto costo della procedura ne limita l'uso. Il protocollo qui presentato introduce un nuovo metodo per il trasferimento genico virale delle cellule T senza la necessità di spinoculazione di piastre rivestite di retronectina. La produzione di scaffold di alginato macroporoso secco per mediare la trasduzione è relat...

L'immunoterapia è emersa come un paradigma rivoluzionario per il trattamento del cancro grazie alla sua capacità di colpire specificamente i tumori, limitare la citotossicità fuori bersaglio e prevenire le ricadute. In particolare, la terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CAR-T) ha guadagnato popolarità grazie al suo successo nel trattamento di linfomi e leucemie. La FDA ha approvato la prima terapia cellulare CAR-T nel 2017 e, da allora, ha approvato altre quattro terapie cellulari CAR-T 1,2,3,4,5. Le CAR hanno un dominio di riconoscimento dell'antigene solitamente costituito da un frammento variabile a catena singola di un anticorpo monoclonale specifico per un antigene associato al tumore 3,4. Quando una CAR interagisce con il suo antigene associato al tumore, le cellule CAR-T si attivano, portando a una risposta antitumorale che coinvolge il rilascio di citochine, la degranulazione citolitica, l'espressione del fattore di trascrizione e la proliferazione delle cellule T. Per produrre cellule CAR-T, il sangue viene raccolto dal paziente per ottenere le loro cellule T. Le CAR vengono aggiunte geneticamente alle cellule T del paziente utilizzando un virus. Le cellule CAR-T vengono coltivate in vitro e reinfuse nel paziente 2,3,4,6. La generazione di successo delle cellule CAR-T è determinata dall'efficienza di trasduzione, che descrive il numero di cellule T geneticamente modificate in cellule CAR-T.
Attualmente, il gold standard per la generazione di cellule CAR-T è la spinoculazione di cellule T attivate e virus su piastre rivestite di retronectina 7,8. La trasduzione inizia quando le particelle virali interagiscono con la superficie delle cellule T. La retronectina promuove la colocalizzazione di virus e cellule aumentando l'efficienza di legame tra le particelle virali e le cellule, migliorando la trasduzione 7,8. La retronectina non funziona bene da sola e deve essere accompagnata da spinoculazione, che migliora il trasferimento genico concentrando le particelle virali e aumentando la permeabilità superficiale delle cellule T, consentendo una più facile infezione virale8. Nonostante il successo della spinoculazione su piastre rivestite di retronectina, si tratta di un processo complesso che richiede più cicli di centrifuga e costosi reagenti. Pertanto, metodi alternativi per il trasferimento genico virale che sono più rapidi ed economici sono altamente desiderabili.
L'alginato è un polisaccaride anionico naturale ampiamente utilizzato nell'industria biomedica grazie al suo basso costo, al buon profilo di sicurezza e alla capacità di formare idrogel dopo la miscelazione con cationi bivalenti 9,10,11,12. L'alginato è un polimero conforme alle GMP ed è generalmente riconosciuto come sicuro (GRAS) dalla FDA13. L'alginato reticolante con i cationi crea idrogel stabili spesso utilizzati nella guarigione delle ferite, nella consegna di piccoli farmaci chimici e proteine e nel trasporto cellulare 9,10,11,12,14,15,16. Grazie alle sue eccellenti proprietà gelificanti, l'alginato è il materiale preferito per creare scaffold porosi mediante liofilizzazione10,17. Queste caratteristiche dell'alginato lo rendono un candidato attraente per la produzione di un'impalcatura in grado di mediare il trasferimento genico virale delle cellule attivate.
Qui è descritto un protocollo per la realizzazione di scaffold di alginato macroporoso secco, noti come scaffold di Drydux, che trasducono staticamente le cellule T mediante trasferimento genico virale17,18. Il processo per la realizzazione di questi scaffold è illustrato nella Figura 1. Questi scaffold eliminano la necessità di spinoculazione delle piastre rivestite di retronectina. Gli scaffold macroporosi di alginato incoraggiano l'interazione di particelle virali e cellule T per consentire un efficiente trasferimento genico in un unico passaggio senza compromettere la funzionalità e la vitalità delle cellule T ingegnerizzate17. Se seguiti correttamente, questi scaffold di alginato macroporoso hanno un'efficienza di trasduzione di almeno l'80%, semplificando e abbreviando il processo di trasduzione virale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figura 1: Schema e calendario del protocollo . (A) Calendario per la realizzazione degli scaffold di alginato macroporoso secco. L'alginato è reticolato con calcio-D-gluconato e congelato durante la notte. Gli scaffold congelati vengono liofilizzati per 72 ore per creare gli scaffold Drydux. (B) Cronologia per la trasduzione virale delle cellule attivate. Le cellule attivate e il virus (MOI 2) vengono seminati sopra l'impalcatura e incubati in terreni completi integrati con IL-7 e IL-15. Gli scaffold assorbono la miscela e promuovono il trasferimento genico virale. L'EDTA viene utilizzato per dissolvere gli scaffold e isolare le cellule trasdotte. Dopo aver lavato due volte con PBS, il pellet cellulare può essere utilizzato per l'analisi. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; PBMCs = cellule mononucleate del sangue periferico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

L'ingegneria genetica delle cellule T per la terapia cellulare CAR-T è arrivata alla ribalta nel trattamento del cancro negli ultimi anni. Le cellule CAR-T sono prodotte dal trasferimento genico virale nelle cellule T. L'attuale gold standard del trasferimento genico virale comporta la spinoculazione di piastre rivestite di retronectina, che è costosa e richiede tempo. Vi è una significativa necessità di metodi efficienti ed economici per generare celle CAR-T. Qui è descritto un metodo per fabbricare scaffold di alginato macroporoso poco costoso e secco, noti come scaffold Drydux, che promuovono efficacemente la trasduzione virale delle cellule T attivate. Gli scaffold sono progettati per essere utilizzati al posto della spinoculazione gold standard di piastre rivestite di retronectina seminate con virus e semplificano il processo di trasduzione delle cellule. L'alginato è reticolato con calcio-D-gluconato e congelato durante la notte per creare gli scaffold . Gli scaffold congelati vengono liofilizzati in un liofilizzatore per 72 ore per completare la formazione degli scaffold macroporosi asciutti. Gli scaffold mediano il trasferimento genico virale quando il virus e le cellule T attivate vengono seminati insieme sulla parte superiore dell'impalcatura per produrre cellule geneticamente modificate. Gli scaffold producono >85% di trasduzione primaria delle cellule T, che è paragonabile all'efficienza di trasduzione della spinoculazione su piastre rivestite di retronectina. Questi risultati dimostrano che gli scaffold di alginato macroporoso secco servono come alternativa più economica e più conveniente al metodo di trasduzione convenzionale.

Questi scaffold di alginato macroporoso sono facili da realizzare e dovrebbero uscire dal liofilizzatore come dischi porosi, soffici e bianchi. Sebbene non studiata in questo esperimento, la soluzione di calcio-alginato può essere colata in diversi stampi per creare scaffold di forme variabili, a seconda delle esigenze dell'utente 9,10. Gli scaffold sono elettrostatici e possono attaccarsi al coperchio della piastra del pozzetto o a un dito guantato. <strong cla...

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Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Qui è un protocollo per la creazione di scaffold di alginato macroporoso secco che mediano un efficiente trasferimento genico virale per l'uso nell'ingegneria genetica delle cellule T, comprese le cellule T per la terapia cellulare CAR-T. Gli scaffold hanno dimostrato di trasdurre le cellule T primarie attivate con una trasduzione del >85%.

Fabbricazione e utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco per la trasduzione virale delle cellule T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Descritto in questo video è un protocollo per la creazione e l'utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco noto come Drydux che promuove efficacemente la trasduzione delle cellule T attivate. Drydux è progettato per essere utilizzato al posto della spinoculazione gold standard di piastre rivestite con RetroNectin seminate con virus e semplifica il processo di trasduzione delle cellule. Drydux ha un'efficienza di trasduzione paragonabile alla spinoculazione su piastre rivestite con RetroNectin e rappresenta un'alternativa più economica e conveniente al metodo di trasduzione convenzionale.In primo luogo, preparare una soluzione allo 0,4% di calcio-D-gluconato. Aggiungere acqua DI filtrata sterile al calcio-D-gluconato in un becher. Mescolare a velocità media fino a quando il calcio-D-gluconato si è sciolto, il che richiede circa 1 1/2 ore.Una volta sciolto, filtrare sterile la soluzione di calcio-D-gluconato. Questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente. Quindi, preparare una soluzione di alginato al 2%.Questo può essere realizzato utilizzando una fiala con tappo a vite o un becher. Entrambi saranno mostrati qui. Aggiungere con attenzione l'alginato ultrapuro al recipiente.Aggiungere la quantità appropriata di acqua DI all'alginato. Scegli il più grande agitatore possibile che non impedisca la miscelazione e aggiungilo al recipiente. Mescolare la soluzione in alto fino a quando l'alginato si scioglie, il che richiede circa un'ora.Se ci sono grandi ciuffi di alginato sul lato della nave, inclinare la nave lateralmente per spostarli. Piccoli grumi si dissolveranno nel corso dell'ora e non sono motivo di preoccupazione. Una volta che la soluzione di alginato al 2% si scioglie, ridurre la velocità di agitazione.Aggiungere lentamente un volume uguale della soluzione di calcio-D-gluconato alla soluzione di alginato. Aggiungerlo lentamente aiuterà a prevenire la formazione di grumi di reticolazione. Quando la soluzione di calcio-gluconato è stata aggiunta, aumentare la velocità di agitazione e mescolare vigorosamente per 15 minuti.Inclinare la nave lateralmente per rimuovere eventuali grumi che potrebbero essersi formati. Dopo aver agitato vigorosamente per 15 minuti, assicurarsi che non ci siano grumi nella soluzione. Pipettare la soluzione in una piastra da 48 o 24 pozzetti.Per una piastra da 48 pozzetti, pipettare 300 microlitri in ciascun pozzetto. Assicurarsi di lanciare lentamente e cambiare spesso le punte, poiché la soluzione sarà viscosa e potrebbe attaccarsi alla punta. Per una piastra da 24 pozzetti, pipettare un millilitro in ciascun pozzetto.Anche in questo caso, lanciare lentamente e cambiare spesso le punte delle pipette. Coprire le piastre del pozzo con un coperchio e congelare a 20 gradi Celsius negativi durante la notte. Preparare i piatti per il liofilizzante rimuovendo i coperchi e fissando la parte superiore con salviette e elastici.Posizionare le piastre nel tubo del liofilizzatore e indossare il liofilizzatore per 72 ore. Dopo 72 ore, rimuovere la piastra dal liofilizzatore. Gli scaffold sono ora pronti per essere utilizzati per la trasduzione.Se non si utilizzano immediatamente i ponteggi, sigillare la piastra con Parafilm e conservare a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Per la conservazione a lungo termine, si consiglia di sigillare sottovuoto la piastra oltre alla sigillatura con Parafilm. Concentrare il surnatante virale centrifugando due millilitri di soluzione virale attraverso un filtro centrifugo a 1.500 g per 10 minuti.Sono necessari da 100 a 200 microlitri di virus concentrato per impalcatura. Ruotare per qualche minuto aggiuntivo se il volume della soluzione virale concentrata è superiore a 200 microlitri. Per ogni impalcatura, fare un'aliquota di 1 milione di cellule T attivate sospese in 50 microlitri di terreno di coltura cellulare completo.Aggiungere il virus concentrato alla sospensione cellulare. Il volume totale della sospensione del virus cellulare non deve superare i 200 microlitri per uno scaffold a 48 pozzetti o 350 microlitri per uno scaffold a 24 pozzetti. Aggiungere la miscela di virus cellulare goccia a goccia nella parte superiore dell'impalcatura asciutta.Per gli esperimenti di controllo negativo, utilizzare terreni di coltura cellulare completi al posto del virus concentrato. Aggiungere questa sospensione cellulare nella parte superiore dell'impalcatura asciutta. Incubare gli scaffold nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per 45-60 minuti.Rimuovere i ponteggi dall'incubatore. Gli scaffold dovrebbero assorbire completamente la soluzione durante questo periodo. Per indurre la proliferazione, aggiungere terreni di coltura cellulare completi integrati con IL-7 e IL-15 a ciascun pozzetto.IL-2 può anche essere usato. Per un'impalcatura a 24 pozzetti, aggiungere un millilitro. Per un'impalcatura da 48 pozzetti, aggiungere 500 microlitri.Incubare a 37 gradi Celsius per 72 ore. Le cellule proliferano nel corso delle 72 ore, il che può trasformare il mezzo in arancione. Rimuovere i supporti in eccesso da ciascun pozzetto.Per isolare le cellule dallo scaffold, aggiungere una soluzione di EDTA molare 0,25 a ciascuna impalcatura. Aggiungere un millilitro per scaffold da 24 pozzetti o 300 microlitri per scaffold da 48 pozzetti. Lasciare riposare il piatto o agitare delicatamente per tre o quattro minuti.Una volta per lo più sciolto, pipettare dentro e fuori delicatamente all'interno del pozzetto. Potrebbero essere necessari alcuni passaggi di pipettaggio in entrata e in uscita per dissolvere completamente lo scaffold. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.Lavare le celle due volte con PBS. Aggiungere 12 millilitri di PBS a ciascuna provetta da centrifuga. Centrifugare a 400 g per cinque minuti.Un pellet cellulare si formerà sul fondo del tubo. Aspirare la soluzione surnatante e ripetere il lavaggio. Fare attenzione a rimuovere completamente il surnatante ad ogni lavaggio in quanto è fondamentale eliminare tutto l'EDTA.Dopo il lavaggio con PBS una seconda volta, il pellet cellulare è pronto per l'analisi. La citometria a flusso è stata utilizzata per determinare l'efficienza di trasduzione di ciascun gruppo. Le cellule non trasdotte sono state utilizzate come controllo negativo e non hanno mostrato trasduzione.Anche le cellule seminate su scaffold senza retrovirus GFP non hanno mostrato trasduzione. Il gruppo Drydux, che aveva attivato cellule seminate sugli scaffold di alginato macroporoso secco, ha mostrato una trasduzione dell'85%, appena inferiore al gruppo Retronectin. Questi risultati dimostrano che gli scaffold di Drydux trasducono efficacemente le cellule mediante trasferimento genico retrovirale senza la necessità di spinoculazione di piastre rivestite di RetroNectin.Gli scaffold Drydux mostrano un'elevata efficienza di trasduzione paragonabile a RetroNectin, fornendo un metodo alternativo per la trasduzione delle cellule T. A causa del basso costo di produzione degli scaffold Drydux, questo processo ha il potenziale per ridurre significativamente il costo delle terapie con cellule T CAR.

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