Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

この研究は、助成金番号R37-CA260223、R21CA246414を通じて国立衛生研究所によってサポートされました。フローサイトメトリー分析に関するトレーニングとガイダンスを提供してくれたNCSUフローサイトメトリーコアに感謝します。回路図は Biorender.com で作成されました

ヒト優位性細胞とレトロウイルスベクターを含むすべての手順は、ノースカロライナ州立大学の生物学的安全性ガイドラインに準拠して実行され、環境衛生安全局によって承認されました。ヒト末梢血単核細胞は、商業的供給源からバフィーコートとして購入された。初代ヒト細胞は、ヒトバフィーコート画分から単離する必要があり、バイオセーフティレベル2のクリアランスと詳細な標準...

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	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. 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PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis.">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).</li><li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24</a> (2022)</li><li>Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

CAR-T細胞療法は、研究と商業的応用の両方で関心を集め続けています。CAR-T細胞療法が血液がんの治療に成功しているにもかかわらず、この手順の高コストはその使用を制限しています。ここで紹介するプロトコルは、レトロネクチンコーティングプレートの脊髄分泌を必要とせずにT細胞のウイルス遺伝子導入のための新しい方法を紹介します。形質導入を媒介する乾燥マクロポーラスアル?...

免疫療法は、腫瘍を特異的に標的とし、オフターゲット細胞毒性を制限し、再発を防ぐ能力により、革新的な癌治療パラダイムとして浮上しています。特に、キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、リンパ腫や白血病の治療に成功したことで人気を博しています。FDAは2017年に最初のCAR-T細胞療法を承認し、それ以来、さらに4つのCAR-T細胞療法を承認しました1,2,3,4,5。CARは、通常、腫瘍関連抗原3,4に特異的であるモノクローナル抗体の一本鎖可変断片からなる抗原認識ドメインを有する。CARが腫瘍関連抗原と相互作用すると、CAR-T細胞が活性化され、サイトカイン放出、細胞溶解性脱顆粒、転写因子発現、およびT細胞増殖を含む抗腫瘍応答を引き起こします。CAR-T細胞を産生するために、患者から血液を採取してT細胞を得る。CARは、ウイルスを使用して患者のT細胞に遺伝的に追加されます。CAR-T細胞はインビトロで増殖し、患者に注入されます2、3、4、6。CAR-T細胞の生成の成功は、CAR-T細胞に遺伝子改変されたT細胞の数を記述する形質導入効率によって決定される。
現在、CAR-T細胞生成のゴールドスタンダードは、レトロネクチンコーティングプレート上での活性化T細胞およびウイルスのスピンオキュレーションである7,8。形質導入は、ウイルス粒子がT細胞の表面と係合するときに始まります。レトロネクチンは、ウイルス粒子と細胞との間の結合効率を高めることによってウイルスと細胞の共局在を促進し、形質導入を増強する7,8。レトロネクチンはそれ自体ではうまく機能せず、ウイルス粒子を濃縮し、T細胞の表面透過性を高めることによって遺伝子導入を促進する脊髄分泌を伴う必要があり、ウイルス感染を容易にします8。レトロネクチンコーティングプレートでのスピンオキュレーションの成功にもかかわらず、それは複数のスピンサイクルと高価な試薬を必要とする複雑なプロセスです。したがって、より迅速かつ安価なウイルス遺伝子導入のための代替方法が非常に望ましい。
アルギン酸塩は、その低コスト、優れた安全性プロファイル、および二価カチオンとの混合時にヒドロゲルを形成する能力のために、生物医学産業で広く使用されている天然アニオン性多糖類です9,10,11,12。アルギン酸塩はGMP準拠のポリマーであり、FDA13によって一般的に安全(GRAS)として認められています。アルギン酸塩を陽イオンと架橋すると、創傷治癒、少量の化学薬品やタンパク質の送達、および細胞輸送によく使用される安定したヒドロゲルが作成されます9、10、11、12、14、15、16。その優れたゲル化特性のために、アルギン酸塩は凍結乾燥によって多孔質足場を作成するための好ましい材料である10,17。アルギン酸塩のこれらの特性は、活性化細胞のウイルス遺伝子導入を媒介することができる足場を製造するための魅力的な候補となる。
ここで説明するのは、ウイルス遺伝子導入によってT細胞を静的に形質導入する、Drydux足場として知られる乾燥マクロポーラスアルギン酸足場を作製するためのプロトコルである17,18。これらの足場を作成するプロセスを図 1 に示します。これらの足場は、レトロネクチンコーティングプレートの脊髄分泌の必要性を排除します。マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドは、ウイルス粒子とT細胞の相互作用を促進し、操作されたT細胞の機能および生存率に影響を与えることなく、単一ステップで効率的な遺伝子導入を可能にする17。正しく従えば、これらのマクロポーラスアルギン酸塩足場は、少なくとも80%の形質導入効率を有し、ウイルス形質導入プロセスを単純化および短縮する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> 図1:プロトコルの概略図とタイムライン 。 (A)乾燥マクロポーラスアルギン酸塩足場を作製するためのタイムライン。アルギン酸塩はカルシウム-D-グルコン酸塩と架橋され、一晩凍結されます。凍結した足場を72時間凍結乾燥して、Drydux足場を作ります。(B)活性化細胞のウイルス形質導入のタイムライン。活性化細胞およびウイルス(MOI 2)を足場の上に播種し、IL-7およびIL-15を添加した完全培地中でインキュベートする。足場は混合物を吸収し、ウイルス遺伝子導入を促進します。EDTAは、足場を溶解し、形質導入された細胞を単離するために使用されます。PBSで2回洗浄した後、細胞ペレットを分析に使用できます。略語:PBS =リン酸緩衝生理食塩水;PBMC =末梢血単核細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

CAR-T細胞治療のためのT細胞の遺伝子工学は、ここ数年で癌治療の最前線に来ています。CAR-T細胞は、T細胞へのウイルス遺伝子導入によって産生される。ウイルス遺伝子導入の現在のゴールドスタンダードは、レトロネクチンコーティングプレートのスピンオキュレーションを含み、これは高価で時間がかかります。CAR-T細胞を生成するための効率的で費用効果の高い方法に対する大きなニーズがあります。ここで説明するのは、活性化T細胞のウイルス形質導入を効率的に促進する、Dryduxスキャフォールドとして知られる安価で乾燥したマクロポーラスアルギン酸スキャフォールドを製造する方法です。足場は、ウイルスを播種したレトロネクチンコーティングプレートのゴールドスタンダードのスピンオキュレーションの代わりに使用するように設計されており、細胞を形質導入するプロセスを簡素化します。アルギン酸塩はカルシウム-D-グルコン酸塩と架橋され、一晩凍結して足場を作ります。凍結した足場を凍結乾燥機で72時間凍結乾燥して、乾燥したマクロポーラス足場の形成を完了します。足場は、ウイルスと活性化T細胞が足場の上に一緒に播種されて遺伝子組み換え細胞を生成するときに、ウイルス遺伝子導入を仲介します。足場は>85%の初代T細胞形質導入を生成し、これはレトロネクチンコーティングプレート上のスピンノキュレーションの形質導入効率に匹敵します。これらの結果は、乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドが従来の形質導入法に代わる安価で便利な代替手段として機能することを示しています。

これらのマクロポーラスアルギン酸塩足場は簡単に作成でき、凍結乾燥機から多孔質でふわふわした白いディスクとして出てくるはずです。この実験では検討されていないが、カルシウム−アルギン酸塩溶液を異なる型に鋳造して、ユーザのニーズに応じて様々な形状の足場を作り出すことができる9、10。足場は静電であり、ウェルプレートの蓋?...

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Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

本明細書は、CAR-T細胞療法のためのT細胞を含むT細胞の遺伝子工学において使用するための効率的なウイルス遺伝子導入を媒介する乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドを作成するためのプロトコルである。足場は、活性化された初代T細胞を>85%の形質導入で形質導入することが示された。

T細胞のウイルス形質導入のための乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドの作製と利用

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

このビデオで説明されているのは、活性化T細胞の形質導入を効率的に促進するDryduxとして知られる乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールドを作成して使用するためのプロトコルです。Dryduxは、ウイルスを播種したレトロネクチンコーティングプレートのゴールドスタンダードのスピンノキュレーションの代わりに使用するように設計されており、細胞の形質導入プロセスを簡素化します。Dryduxは、レトロネクチンコーティングプレート上のスピノキュレーションに匹敵する形質導入効率を有し、従来の形質導入法に代わる安価で便利な方法として機能します。まず、0.4%カルシウム-D-グルコン酸塩の溶液を調製します。滅菌ろ過したDI水をビーカーのカルシウム-D-グルコン酸塩に加えます。カルシウム-D-グルコン酸塩が溶解するまで中速で攪拌しますが、これには約1時間半かかります。溶解したら、カルシウム-D-グルコン酸溶液を滅菌濾過する。この溶液は室温で保存することができる。次に、2%アルギン酸塩溶液を調製します。これは、スクリューキャップバイアルまたはビーカーを使用して達成することができる。両方がここに表示されます。超高純度アルギン酸塩を容器に慎重に加えます。アルギン酸塩に適量のDI水を加えます。混合を妨げない可能な限り最大の攪拌子を選択し、それを容器に追加します。アルギン酸塩が溶解するまで溶液を強火で攪拌しますが、これには約1時間かかります。容器の側面に大きなアルギン酸塩の塊がある場合は、血管を横に傾けて取り除きます。小さな塊は1時間かけて溶解し、心配する必要はありません。2%アルギン酸溶液が溶解したら、攪拌速度を下げます。等量のカルシウム-D-グルコン酸塩溶液をアルギン酸塩溶液にゆっくりと加えます。ゆっくりと追加すると、架橋塊の形成を防ぐのに役立ちます。グルコン酸カルシウム溶液を加えたら、攪拌速度を上げ、15分間激しく攪拌します。容器を横に傾けて、形成された可能性のある塊を取り除きます。15分間激しく攪拌した後、溶液に塊がないことを確認します。溶液を48ウェルまたは24ウェルプレートにピペットで入れます。48ウェルプレートの場合、各ウェルに300マイクロリットルをピペットで入れます。溶液は粘性があり、先端にくっつく可能性があるため、ゆっくりとキャストし、チップを頻繁に交換してください。24ウェルプレートの場合は、各ウェルに1ミリリットルずつピペットで入れます。繰り返しますが、ゆっくりとキャストし、ピペットチップを頻繁に交換します。ウェルプレートを蓋で覆い、マイナス20°Cで一晩凍結する。蓋を外し、ワイプと輪ゴムで上部を固定して、凍結乾燥機用のプレートを準備します。プレートを凍結乾燥機チューブに入れ、凍結乾燥機に72時間置きます。72時間後、凍結乾燥機からプレートを取り外します。これで、足場を形質導入に使用する準備が整いました。足場をすぐに使用しない場合は、プレートをパラフィルムで密封し、必要になるまで摂氏4度で保管してください。長期保存の場合は、パラフィルムによるシールに加えて、プレートを真空シールすることをお勧めします。2ミリリットルのウイルス溶液を遠心フィルターを通して1, 500 gで10分間遠心分離することにより、ウイルス上清を濃縮します。足場あたり100〜200マイクロリットルの濃縮ウイルスが必要です。濃縮ウイルス溶液の量が200マイクロリットルを超える場合は、さらに数分間回転します。各足場について、50マイクロリットルの完全な細胞培養培地に懸濁した100万個の活性化T細胞のアリコートを作ります。濃縮ウイルスを細胞懸濁液に加える。細胞ウイルス懸濁液の総容量は、48ウェル足場の場合は200マイクロリットル、24ウェル足場の場合は350マイクロリットルを超えてはなりません。細胞ウイルス混合物を乾いた足場の上部に滴下して加えます。ネガティブコントロール実験では、濃縮ウイルスの代わりに完全な細胞培養培地を使用してください。この細胞懸濁液を乾いた足場の上部に加える。細胞培養インキュベーター内の足場を摂氏37度で45〜60分間インキュベートします。インキュベーターから足場を取り外します。足場はこの間に溶液を完全に吸収するはずです。増殖を誘導するには、IL-7およびIL-15を添加した完全な細胞培養培地を各ウェルに追加します。IL-2も使用することができる。24ウェル足場の場合は、1ミリリットルを追加します。48ウェル足場の場合は、500マイクロリットルを追加します。摂氏37度で72時間インキュベートします。細胞は72時間にわたって増殖し、培地がオレンジ色に変わる可能性があります。各ウェルから余分な培地を取り除きます。足場から細胞を単離するには、各足場に0.25モルのEDTA溶液を追加します。24 ウェル足場の場合は 1 ミリリットル、48 ウェル足場の場合は 300 マイクロリットルを追加します。プレートをそのままにするか、3〜4分間静かに攪拌します。ほとんど溶解したら、ウェル内でピペットで静かに出し入れします。足場を完全に溶解するには、いくつかのピペッティング手順が必要になる場合があります。溶液を15ミリリットルの遠沈管に移します。細胞をPBSで2回洗浄します。各遠沈管に12ミリリットルのPBSを追加します。400gで5分間遠心分離する。チューブの底にセルペレットが形成されます。上澄み液を吸引し、洗浄を繰り返す。すべてのEDTAを取り除くことが重要であるため、洗浄するたびに上清を完全に除去するように注意してください。PBSで2回洗浄した後、細胞ペレットは分析の準備が整います。フローサイトメトリーを使用して、各群の形質導入効率を決定しました。非形質導入細胞を陰性対照として用い、形質導入を示さなかった。GFPレトロウイルスを含まない足場に播種した細胞も形質導入を示さなかった。乾燥マクロポーラスアルギン酸スキャフォールド上に細胞を播種したDryduxグループは、85%の形質導入を示し、RetroNectinグループよりもわずかに低かった。これらの結果は、Dryduxスキャフォールドがレトロネクチンコーティングプレートの脊髄分泌を必要とせずに、レトロウイルス遺伝子導入によって効果的に形質導入された細胞を実証する。Dryduxスキャフォールドは、レトロネクチンに匹敵する高い形質導入効率を示し、T細胞を形質導入するための代替方法を提供します。Drydux足場の製造コストが低いため、このプロセスはCAR T細胞療法のコストを大幅に削減する可能性があります。

Research

JoVE Journal

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