Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gjennom Grant Award Numbers R37-CA260223, R21CA246414. Vi takker NCSU-flowcytometrikjernen for opplæring og veiledning i flowcytometrianalyse. Skjemaer ble opprettet med Biorender.com

Alle prosedyrene som involverer humane forrangceller og retrovirale vektorer ble utført i samsvar med North Carolina State Universitys retningslinjer for biologisk sikkerhet og godkjent av Environmental Health and Safety Office. Humane mononukleære celler i perifert blod ble kjøpt som buffyfrakker fra kommersielle kilder. Primære humane celler må isoleres fra humane buffycoatfraksjoner og kreve biosikkerhetsnivå 2-klarering og detaljerte standard driftsprosedyrer og godkjenning fra institusjonen der arbeidet skal f...

<ol>
	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma:+recent+clinical+advances+and+future+challenges.">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li><li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells.">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li><li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+CAR+T-cells+forward.">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cell+therapy:+current+limitations+and+potential+strategies.">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).</li><li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy:+A+new+era+in+cancer+immunotherapy.">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>Lee, H. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells.">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications.">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li><li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering.">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate:+properties+and+biomedical+applications.">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li><li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering:+part+1.+Structure,+gelation+rate+and+mechanical+properties.">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li><li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+nondairy+beverages.">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li><li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation,+tissue+retention+and+systemic+capture.">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li><li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence.">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li><li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots.">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy.">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells.">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li><li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells.">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li><li>. PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis.">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).</li><li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24</a> (2022)</li><li>Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

CAR-T celleterapi fortsetter å få interesse for både forskning og kommersielle applikasjoner. Til tross for suksessen CAR-T-celleterapi har hatt i behandling av blodkreft, begrenser de høye kostnadene ved prosedyren bruken. Protokollen som presenteres her introduserer en ny metode for viral genoverføring av T-celler uten behov for spinokulasjon av retronektinbelagte plater. Å produsere tørre makroporøse alginatstillaser for å formidle transduksjon er relativt enkelt og er en egnet rimelig erstatning for konvensj...

Immunterapi har dukket opp som et revolusjonerende kreftbehandlingsparadigme på grunn av sin evne til spesifikt å målrette svulster, begrense cytotoksisitet utenfor målet og forhindre tilbakefall. Spesielt har kimær antigenreseptor T (CAR-T) celleterapi blitt populær på grunn av sin suksess i behandling av lymfomer og leukemier. FDA godkjente den første CAR-T-celleterapien i 2017, og har siden da godkjent ytterligere fire CAR-T-celleterapier 1,2,3,4,5. CARs har et antigengjenkjenningsdomene som vanligvis består av et enkeltkjedevariabelt fragment av et monoklonalt antistoff som er spesifikt for et tumorassosiert antigen 3,4. Når en CAR interagerer med sitt tumorassosierte antigen, aktiveres CAR-T-cellene, noe som fører til en antitumorrespons som involverer cytokinfrigivelse, cytolytisk degranulering, transkripsjonsfaktoruttrykk og T-celleproliferasjon. For å produsere CAR-T-celler samles blod fra pasienten for å få sine T-celler. CARs blir genetisk tilsatt pasientens T-celler ved hjelp av et virus. CAR-T-cellene dyrkes in vitro og infunderes tilbake til pasienten 2,3,4,6. Vellykket generering av CAR-T-celler bestemmes av transduksjonseffektiviteten, som beskriver antall T-celler som er genetisk modifisert til CAR-T-celler.
For tiden er gullstandarden for CAR-T-cellegenerering spinoculation av aktiverte T-celler og virus på retronektinbelagte plater 7,8. Transduksjon begynner når virale partikler engasjerer seg med overflaten av T-cellene. Retronektin fremmer kolokalisering av virus og celler ved å øke bindingseffektiviteten mellom viruspartiklene og cellene, og forbedrer transduksjonen 7,8. Retronektin fungerer ikke bra alene og må ledsages av spinokulasjon, noe som forbedrer genoverføringen ved å konsentrere viruspartiklene og øke overflatepermeabiliteten til T-cellen, noe som muliggjør lettere virusinfeksjon8. Til tross for suksessen med spinokulasjon på retronektinbelagte plater, er det en kompleks prosess som krever flere sentrifugeringssykluser og dyre reagenser. Derfor er alternative metoder for viral genoverføring som er raskere og billigere svært ønskelige.
Alginat er et naturlig anionisk polysakkarid som er mye brukt i biomedisinsk industri på grunn av dets lave kostnader, gode sikkerhetsprofil og evne til å danne hydrogeler ved blanding med divalente kationer 9,10,11,12. Alginat er en GMP-kompatibel polymer og er generelt anerkjent som trygg (GRAS) av FDA13. Tverrbindende alginat med kationer skaper stabile hydrogeler som ofte brukes i sårheling, levering av små kjemiske stoffer og proteiner, og celletransport 9,10,11,12,14,15,16. På grunn av sine utmerkede geleringsegenskaper er alginat det foretrukne materialet for å lage porøse stillaser ved å frysetørke10,17. Disse egenskapene til alginat gjør det til en attraktiv kandidat for å produsere et stillas som kan formidle viral genoverføring av aktiverte celler.
Her beskrives en protokoll for fremstilling av tørre makroporøse alginatstillaser, kjent som Drydux-stillaser, som statisk transduserer T-celler ved viral genoverføring17,18. Prosessen for å lage disse stillasene er vist i figur 1. Disse stillasene eliminerer behovet for spinoculation av retronektinbelagte plater. De makroporøse alginatstillasene oppmuntrer til interaksjon mellom viruspartikler og T-celler for å muliggjøre effektiv genoverføring i et enkelt trinn uten å påvirke funksjonaliteten og levedyktigheten til de konstruerte T-cellene17. Når de følges riktig, har disse makroporøse alginatstillasene en transduksjonseffektivitet på minst 80%, noe som forenkler og forkorter den virale transduksjonsprosessen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figur 1: Skjematisk og tidslinje for protokollen . (A) Tidslinje for fremstilling av de tørre makroporøse alginatstillasene. Alginat er kryssbundet med kalsium-D-glukonat og fryses ned over natten. De frosne stillasene blir lyofilisert i 72 timer for å lage Drydux-stillasene. (B) Tidslinje for viral transduksjon av aktiverte celler. Aktiverte celler og virus (MOI 2) sås på toppen av stillaset og inkuberes i komplette medier supplert med IL-7 og IL-15. Stillasene absorberer blandingen og fremmer viral genoverføring. EDTA brukes til å løse opp stillasene og isolere de transduserte cellene. Etter vask to ganger med PBS, kan cellepelleten brukes til analyse. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvann; PBMCs = mononukleære celler i perifert blod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

Genteknologi av T-celler for CAR-T-celleterapi har kommet i forkant av kreftbehandling de siste årene. CAR-T-celler produseres ved viral genoverføring til T-celler. Den nåværende gullstandarden for viral genoverføring innebærer spinoculation av retronektinbelagte plater, noe som er dyrt og tidkrevende. Det er et betydelig behov for effektive og kostnadseffektive metoder for å generere CAR-T-celler. Her beskrives en metode for fremstilling av billige, tørre makroporøse alginatstillaser, kjent som Drydux-stillaser, som effektivt fremmer viral transduksjon av aktiverte T-celler. Stillasene er designet for å brukes i stedet for gullstandard spinokulasjon av retronektinbelagte plater sådd med virus og forenkle prosessen for å transdusere celler. Alginat er kryssbundet med kalsium-D-glukonat og frosset over natten for å lage stillasene. De frosne stillasene frysetørkes i en lyofiliser i 72 timer for å fullføre dannelsen av de tørre makroporøse stillasene. Stillasene formidler viral genoverføring når virus og aktiverte T-celler sås sammen på toppen av stillaset for å produsere genmodifiserte celler. Stillasene produserer >85% primær T-celletransduksjon, som er sammenlignbar med transduksjonseffektiviteten av spinokulasjon på retronektinbelagte plater. Disse resultatene viser at tørre makroporøse alginatstillaser fungerer som et billigere og mer praktisk alternativ til den konvensjonelle transduksjonsmetoden.

Disse makroporøse alginatstillasene er enkle å lage og bør komme ut av lyofilisøren som porøse, luftige og hvite plater. Selv om det ikke er studert i dette eksperimentet, kan kalsiumalginatløsning støpes i forskjellige former for å lage stillaser av varierende former, avhengigav brukerens behov 9,10. Stillasene er elektrostatiske og kan feste seg til lokket på brønnplaten eller til en hansket finger. Figur 2 viser hvordan ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Her er en protokoll for å lage tørre makroporøse alginat stillaser som medierer effektiv viral genoverføring for bruk i genteknologi av T-celler, inkludert T-celler for CAR-T celleterapi. Stillasene ble vist å transdusere aktiverte primære T-celler med >85% transduksjon.

Fremstilling og bruk av tørre makroporøse alginatstillaser ved viral transduksjon av T-celler

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Beskrevet i denne videoen er en protokoll for å lage og bruke tørre makroporøse alginat stillaser kjent som Drydux som effektivt fremmer transduksjon av aktiverte T-celler. Drydux er designet for å brukes i stedet for gullstandard spinokulasjon av RetroNectin-belagte plater sådd med virus og forenkler prosessen for å transdusere celler. Drydux har en transduksjonseffektivitet som kan sammenlignes med spinokulasjon på RetroNectin-belagte plater, og fungerer som et billigere og mer praktisk alternativ til den konvensjonelle transduksjonsmetoden.Lag først en 0,4% løsning av kalsium-D-glukonat. Tilsett sterilt filtrert DI-vann til kalsium-D-glukonat i et beger. Rør på middels hastighet til kalsium-D-glukonatet er oppløst, noe som tar omtrent 1 1/2 time.Når det er oppløst, filtrer sterilt kalsium-D-glukonatoppløsningen. Denne løsningen kan lagres ved romtemperatur. Deretter lager du en 2% alginatløsning.Dette kan oppnås ved hjelp av et hetteglass med skrukork eller et beger. Begge vil bli vist her. Tilsett forsiktig det ultrarene alginatet til karet.Tilsett riktig mengde DI-vann til alginatet. Velg den største rørstangen som ikke vil hindre blanding og legg den til fartøyet. Rør oppløsningen på høy til alginatet oppløses, noe som tar omtrent en time.Hvis det er noen store alginatklumper på siden av fartøyet, vipp fartøyet sidelengs for å løsne dem. Små klumper vil oppløses i løpet av timen, og er ikke grunn til bekymring. Når 2% alginatoppløsningen oppløses, reduser omrøringshastigheten.Tilsett sakte et like stort volum av kalsium-D-glukonatoppløsningen til alginatoppløsningen. Å legge det sakte vil bidra til å forhindre at tverrbindingsklumper dannes. Når kalsiumglukonatoppløsningen er tilsatt, øker du omrøringshastigheten og rører kraftig i 15 minutter.Vipp fartøyet sidelengs for å fjerne klumper som kan ha dannet seg. Etter omrøring kraftig i 15 minutter, sørg for at det ikke er klumper i løsningen. Pipette løsningen i en 48- eller 24-brønnsplate.For en 48-brønns plate, pipette 300 mikroliter inn i hver brønn. Sørg for å kaste sakte og endre tips ofte, da løsningen vil være viskøs, og kan holde seg til spissen. For en 24-brønns plate, pipette en milliliter inn i hver brønn.Igjen, kast sakte, og bytt pipettespisser ofte. Dekk brønnplatene med et lokk, og frys ved negative 20 grader Celsius over natten. Forbered platene til lyofilisatoren ved å fjerne lokkene og feste toppen med kluter og gummibånd.Plasser platene i lyofilisørrøret, og sett på lyofilisatoren i 72 timer. Etter 72 timer, fjern platen fra lyofilisatoren. Stillasene er nå klare til bruk til transduksjon.Hvis du ikke bruker stillasene umiddelbart, må du forsegle platen med Parafilm og oppbevare den ved fire grader Celsius til det er nødvendig. For langtidsoppbevaring anbefales det å vakuumforsegle platen i tillegg til tetting med Parafilm. Konsentrer viral supernatant ved å sentrifugere to ml viral løsning gjennom et sentrifugalfilter ved 1.500 g i 10 minutter.100 til 200 mikroliter konsentrert virus er nødvendig per stillas. Spinn i noen ekstra minutter hvis det konsentrerte virusløsningsvolumet er større enn 200 mikroliter. For hvert stillas, lag en aliquot på 1 million aktiverte T-celler suspendert i 50 mikroliter komplette cellekulturmedier.Tilsett det konsentrerte viruset i cellesuspensjonen. Det totale volumet av cellevirussuspensjonen bør ikke overstige 200 mikroliter for et 48-brønns stillas, eller 350 mikroliter for et 24-brønns stillas. Tilsett cellevirusblandingen dråpevis til toppen av det tørre stillaset.For negative kontrolleksperimenter, bruk komplette cellekulturmedier i stedet for konsentrert virus. Tilsett denne cellesuspensjonen på toppen av det tørre stillaset. Inkuber stillasene i cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius i 45 til 60 minutter.Fjern stillasene fra inkubatoren. Stillasene skal absorbere løsningen fullt ut i løpet av denne tiden. For å indusere spredning, legg til komplette cellekulturmedier supplert med IL-7 og IL-15 til hver brønn.IL-2 kan også brukes. For et 24-brønns stillas, legg til en milliliter. For et 48-brønns stillas, tilsett 500 mikroliter.Inkuber ved 37 grader Celsius i 72 timer. Cellene vil spre seg i løpet av 72 timer, noe som kan gjøre media oransje. Fjern overflødige medier fra hver brønn.For å isolere celler fra stillaset, tilsett 0,25 molar EDTA-oppløsning til hvert stillas. Tilsett en milliliter for 24-brønns stillaser, eller 300 mikroliter for 48-brønns stillaser. La tallerkenen sitte, eller rør forsiktig i tre til fire minutter.Når det meste er oppløst, pipetter du forsiktig inn og ut inne i brønnen. Noen få pipetteringstrinn inn og ut kan være nødvendig for å løse opp stillaset helt. Overfør løsningen til et 15 milliliter sentrifugerør.Vask cellene to ganger med PBS. Tilsett 12 milliliter PBS til hvert sentrifugerør. Sentrifuge ved 400 g i fem minutter.En cellepellet vil danne seg i bunnen av røret. Aspirer den supernatante løsningen, og gjenta vasken. Vær forsiktig med å fjerne supernatant helt med hver vask, da det er viktig å bli kvitt all EDTA.Etter vask med PBS en gang til, er cellepelleten klar for analyse. Flowcytometri ble brukt til å bestemme transduksjonseffektiviteten til hver gruppe. Ikke-transducerte celler ble brukt som negativ kontroll, og viste ingen transduksjon.Celler sådd på stillas uten GFP retrovirus viste heller ingen transduksjon. Drydux-gruppen, som hadde aktivert celler sådd på de tørre makroporøse alginatstillasene, viste 85 % transduksjon, noe lavere enn RetroNektingruppen. Disse resultatene viser at Drydux-stillaser effektivt transduserte celler ved retroviral genoverføring uten behov for spinoculation av RetroNectin-belagte plater.Drydux stillaser har høy transduksjonseffektivitet som kan sammenlignes med RetroNectin, og gir en alternativ metode for å transdusere T-celler. På grunn av de lave kostnadene ved produksjon av Drydux-stillasene, har denne prosessen potensial til å redusere kostnadene for CAR T-celleterapier betydelig.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Bruk av menneskelige perivaskulær stamceller for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat Microcapsule som en 3D-plattform for Formering og Differensiering av humane embryonale stamceller (hESC) til ulike linjene

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabrikasjon av mekanisk Tunable og Bioaktive Metal Stillas for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generering av MGP-avledet Mouse Airway Epitelceller Bruke Decellularized Lung Stillas

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelt Electrospinning skriving av tredimensjonale Poly(ε-caprolactone) stillaser med kontrollerbar Morphologies for Tissue Engineering programmer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabrikasjon og karakterisering av Griffithsin endret Fiber stillaser for forebygging av seksuelt overførbare infeksjoner

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabrikasjon av Decellularized brusk-avledet Matrix stillaser

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

Transduksjon og utvidelse av primære T-celler i ni dager med vedlikehold av sentralminne fenotype

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Sammenkoblede makroporøse 3D-stillaser fra mikrogelstenger

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...