Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde através dos Números de Concessão R37-CA260223, R21CA246414. Agradecemos ao núcleo de citometria de fluxo da NCSU pelo treinamento e orientação na análise da citometria de fluxo. Os esquemas foram criados com Biorender.com

Todos os procedimentos envolvendo células de primazia humana e vetores retrovirais foram realizados em conformidade com as diretrizes de Segurança Biológica da Universidade Estadual da Carolina do Norte e aprovados pelo Escritório de Saúde e Segurança Ambiental. As células mononucleares do sangue periférico humano foram compradas como casacos de buffy de fontes comerciais. As células humanas primárias devem ser isoladas de frações de pelagem humana e requerem autorização de nível 2 de biossegurança e proc...

<ol>
	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. 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PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

A terapia celular CAR-T continua a ganhar interesse tanto para pesquisas quanto para aplicações comerciais. Apesar do sucesso que a terapia com células CAR-T teve no tratamento de cânceres no sangue, o alto custo do procedimento limita seu uso. O protocolo aqui apresentado introduz um novo método para a transferência de genes virais de células T sem a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. A produção de andaimes de alginato macroporoso secos para mediar a transdução é relativamen...

A imunoterapia emergiu como um paradigma revolucionário de tratamento do câncer devido à sua capacidade de atingir especificamente tumores, limitar a citotoxicidade fora do alvo e prevenir a recaída. Particularmente, a terapia celular com receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) ganhou popularidade devido ao seu sucesso no tratamento de linfomas e leucemias. A FDA aprovou a primeira terapia com células CAR-T em 2017 e, desde então, aprovou mais quatro terapias com células CAR-T 1,2,3,4,5. Os CARs têm um domínio de reconhecimento de antígeno geralmente consistindo de um fragmento variável de cadeia única de um anticorpo monoclonal que é específico para um antígeno associado ao tumor 3,4. Quando um CAR interage com seu antígeno associado ao tumor, as células CAR-T são ativadas, levando a uma resposta antitumoral envolvendo liberação de citocinas, degranulação citolítica, expressão do fator de transcrição e proliferação de células T. Para produzir células CAR-T, o sangue é coletado do paciente para obter suas células T. Os CARs são geneticamente adicionados às células T do paciente usando um vírus. As células CAR-T são cultivadas in vitro e infundidas de volta no paciente 2,3,4,6. A geração bem-sucedida de células CAR-T é determinada pela eficiência de transdução, que descreve o número de células T que são geneticamente modificadas em células CAR-T.
Atualmente, o padrão-ouro para a geração de células CAR-T é a espinoculação de células T ativadas e vírus em placas revestidas de retronectina 7,8. A transdução começa quando as partículas virais se envolvem com a superfície das células T. A retronectina promove a colocalização de vírus e células, aumentando a eficiência de ligação entre as partículas virais e as células, aumentando a transdução 7,8. A retronectina não funciona bem por si só e precisa ser acompanhada de espinoculação, o que aumenta a transferência gênica, concentrando as partículas virais e aumentando a permeabilidade superficial da célula T, permitindo uma infecção viral mais fácil8. Apesar do sucesso da espinoculação em placas revestidas de retronectina, é um processo complexo que requer múltiplos ciclos de rotação e reagentes caros. Portanto, métodos alternativos para a transferência de genes virais que são mais rápidos e mais baratos são altamente desejáveis.
O alginato é um polissacarídeo aniônico natural amplamente utilizado na indústria biomédica devido ao seu baixo custo, bom perfil de segurança e capacidade de formar hidrogéis após a mistura com cátions divalentes 9,10,11,12. O alginato é um polímero compatível com GMP e é geralmente reconhecido como seguro (GRAS) pela FDA13. A reticulação do alginato com cátions cria hidrogéis estáveis frequentemente utilizados na cicatrização de feridas, na entrega de pequenas drogas químicas e proteínas e no transporte celular 9,10,11,12,14,15,16. Devido às suas excelentes propriedades gelificantes, o alginato é o material preferido para criar andaimes porosos por liofilização10,17. Essas características do alginato o tornam um candidato atraente para a produção de um andaime que pode mediar a transferência de genes virais de células ativadas.
Descreve-se aqui um protocolo para a confecção de andaimes de alginato macroporoso secos, conhecidos como andaimes de Drydux, que transduziram estaticamente células T por transferência de genes virais17,18. O processo de fabricação desses andaimes é mostrado na Figura 1. Esses andaimes eliminam a necessidade de espinoculação de placas revestidas de retronectina. Os andaimes de alginato macroporoso estimulam a interação de partículas virais e células T para permitir a transferência eficiente de genes em uma única etapa, sem afetar a funcionalidade e a viabilidade das células T modificadas17. Quando seguidos corretamente, esses andaimes de alginato macroporoso têm uma eficiência de transdução de pelo menos 80%, simplificando e encurtando o processo de transdução viral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema e linha do tempo do protocolo. (A) Linha do tempo para fazer os andaimes secos de alginato macroporoso. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite. Os andaimes congelados são liofilizados por 72 h para criar os andaimes Drydux. (B) Cronograma para transdução viral de células ativadas. As células ativadas e o vírus (MOI 2) são semeados no topo do andaime e incubados em meio completo suplementado com IL-7 e IL-15. Os andaimes absorvem a mistura e promovem a transferência de genes virais. O EDTA é usado para dissolver os andaimes e isolar as células transduzidas. Após a lavagem duas vezes com PBS, o pellet celular pode ser usado para análise. Abreviaturas: PBS = solução salina tamponada com fosfato; PBMCs = células mononucleares do sangue periférico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

A engenharia genética de células T para terapia com células CAR-T chegou à vanguarda do tratamento do câncer nos últimos anos. As células CAR-T são produzidas pela transferência de genes virais para as células T. O atual padrão-ouro de transferência de genes virais envolve a espinoculação de placas revestidas de retronectina, o que é caro e demorado. Há uma necessidade significativa de métodos eficientes e econômicos para gerar células CAR-T. Descrito aqui é um método para a fabricação de andaimes de alginato macroporosos secos e baratos, conhecidos como andaimes Drydux, que promovem eficientemente a transdução viral de células T ativadas. Os andaimes são projetados para serem usados no lugar da espinoculação padrão-ouro de placas revestidas de retronectina semeadas com vírus e simplificam o processo de transdução de células. O alginato é reticulado com cálcio-D-gluconato e congelado durante a noite para criar os andaimes. Os andaimes congelados são liofilizados em um liofilizador por 72 h para completar a formação dos andaimes macroporosos secos. Os andaimes mediam a transferência de genes virais quando o vírus e as células T ativadas são semeados juntos no topo do andaime para produzir células geneticamente modificadas. Os andaimes produzem >85% de transdução primária de células T, o que é comparável à eficiência de transdução da espinoculação em placas revestidas de retronectina. Estes resultados demonstram que os andaimes de alginato macroporoso secos servem como uma alternativa mais barata e conveniente ao método de transdução convencional.

Esses andaimes de alginato macroporoso são fáceis de fazer e devem sair do liofilizador como discos porosos, macios e brancos. Embora não estudada neste experimento, a solução de alginato de cálcio pode ser fundida em diferentes moldes para criar andaimes de formas variadas, dependendo das necessidades do usuário 9,10. Os andaimes são eletrostáticos e podem aderir à tampa da placa do poço ou a um dedo enluvado. A Figura 2 ...

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Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Aqui está um protocolo para a criação de andaimes de alginato macroporoso secos que medeiam a transferência eficiente de genes virais para uso em engenharia genética de células T, incluindo células T para terapia com células CAR-T. Os andaimes demonstraram transduzir células T primárias ativadas com transdução de >85%.

Fabricação e Uso de Andaimes Secos de Alginato Macroporoso para Transdução Viral de Células T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Descrito neste vídeo é um protocolo para a criação e uso de andaimes de alginato macroporoso seco conhecidos como Drydux que promovem eficientemente a transdução de células T ativadas. O Drydux foi projetado para ser usado no lugar da espinoculação padrão-ouro de placas revestidas com RetroNectin, semeadas com vírus e simplifica o processo de transdução de células. O Drydux tem uma eficiência de transdução comparável à espinoculação em placas revestidas com RetroNectin, e serve como uma alternativa mais barata e conveniente ao método de transdução convencional.Primeiro, prepare uma solução a 0,4% de cálcio-D-gluconato. Adicione água DI filtrada estéril ao gliconato de cálcio D em um copo. Mexa na velocidade média até que o gliconato de cálcio D tenha se dissolvido, o que leva aproximadamente 1 hora e meia.Uma vez dissolvido, filtro estéril a solução de cálcio-D-gluconato. Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma solução de 2% de alginato.Isso pode ser feito usando um frasco para injetáveis de tampa de rosca ou um béquer. Ambos serão mostrados aqui. Adicione cuidadosamente o alginato ultrapuro ao vaso.Adicione a quantidade apropriada de água DI ao alginato. Escolha a maior barra de agitação possível que não impeça a mistura e adicione-a ao recipiente. Mexa a solução no alto até que o alginato se dissolva, o que leva aproximadamente uma hora.Se houver grandes aglomerados de alginato no lado do vaso, incline o vaso para os lados para desalojá-los. Pequenos aglomerados se dissolverão ao longo da hora e não são motivo de preocupação. Uma vez que a solução de 2% alginato se dissolve, reduza a velocidade de agitação.Adicione lentamente um volume igual da solução de cálcio-D-gluconato à solução de alginato. Adicioná-lo lentamente ajudará a evitar a formação de aglomerados de reticulação. Quando a solução de gluconato de cálcio tiver sido adicionada, aumente a velocidade de agitação e mexa vigorosamente por 15 minutos.Incline o vaso para os lados para remover quaisquer aglomerados que possam ter se formado. Depois de mexer vigorosamente por 15 minutos, certifique-se de que não há aglomerados na solução. Pipetar a solução para uma placa de 48 ou 24 poços.Para uma placa de 48 poços, pipete 300 microlitros em cada poço. Certifique-se de lançar lentamente e mudar as pontas com frequência, pois a solução será viscosa e pode grudar na ponta. Para uma placa de 24 poços, pipete um mililitro em cada poço.Novamente, lance lentamente e mude as pontas da pipeta com frequência. Cubra as placas do poço com uma tampa e congele a 20 graus Celsius negativos durante a noite. Prepare as placas para o liofilizador, removendo as tampas e prendendo o topo com lenços umedecidos e elásticos.Coloque as placas no tubo liofilizador e coloque o liofilizador por 72 horas. Após 72 horas, retire a placa do liofilizador. Os andaimes estão agora prontos para serem usados para transdução.Se não usar os andaimes imediatamente, sele a placa com parafilme e armazene a quatro graus Celsius até que seja necessário. Para armazenamento a longo prazo, recomenda-se selar a placa a vácuo, além de selar com Parafilme. Concentrar o sobrenadante viral centrifugando dois mililitros de solução viral através de um filtro centrífugo a 1, 500 g durante 10 minutos.São necessários 100 a 200 microlitros de vírus concentrado por andaime. Gire por alguns minutos adicionais se o volume concentrado de solução de vírus for superior a 200 microlitros. Para cada andaime, faça uma alíquota de 1 milhão de células T ativadas suspensas em 50 microlitros de meios completos de cultura celular.Adicione o vírus concentrado à suspensão celular. O volume total da suspensão do vírus celular não deve exceder 200 microlitros para um andaime de 48 poços, ou 350 microlitros para um andaime de 24 poços. Adicione a mistura de vírus celular gota a gota na parte superior do andaime seco.Para experimentos de controle negativo, use meios de cultura celular completos no lugar do vírus concentrado. Adicione esta suspensão celular à parte superior do andaime seco. Incubar os andaimes na incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos.Remova os andaimes da incubadora. Os andaimes devem absorver totalmente a solução durante este tempo. Para induzir a proliferação, adicione meios de cultura celular completos suplementados com IL-7 e IL-15 a cada poço.IL-2 também pode ser usado. Para um andaime de 24 poços, adicione um mililitro. Para um andaime de 48 poços, adicione 500 microlitros.Incubar a 37 graus Celsius por 72 horas. As células proliferarão ao longo das 72 horas, o que pode tornar a mídia laranja. Remova o excesso de mídia de cada poço.Para isolar as células do andaime, adicione uma solução de EDTA 0,25 molar a cada andaime. Adicione um mililitro para andaimes de 24 poços ou 300 microlitros para andaimes de 48 poços. Deixe o prato descansar ou agite suavemente por três a quatro minutos.Uma vez dissolvido na maior parte, a pipeta entra e sai suavemente dentro do poço. Algumas etapas de pipetagem de entrada e saída podem ser necessárias para dissolver completamente o andaime. Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Lave as células duas vezes com PBS. Adicione 12 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga. Centrifugar a 400 g durante cinco minutos.Uma pelota de célula se formará na parte inferior do tubo. Aspirar a solução sobrenadante e repetir a lavagem. Tenha cuidado para remover completamente o sobrenadante a cada lavagem, pois é crucial se livrar de todo o EDTA.Após a lavagem com PBS uma segunda vez, o pellet celular está pronto para análise. A citometria de fluxo foi utilizada para determinar a eficiência de transdução de cada grupo. Células não transduzidas foram utilizadas como controle negativo e não apresentaram transdução.Células semeadas em andaimes sem retrovírus GFP também não apresentaram transdução. O grupo Drydux, que ativou células semeadas nos andaimes de alginato macroporoso seco, apresentou 85% de transdução, pouco menor que o grupo Retronectina. Estes resultados demonstram que os andaimes de Drydux efetivamente transduziram células por transferência de genes retrovirais sem a necessidade de espinoculação de placas revestidas de RetroNectin.Os andaimes Drydux exibem alta eficiência de transdução comparável ao RetroNectin, fornecendo um método alternativo para a transdução de células T. Devido ao baixo custo de fabricação dos andaimes Drydux, esse processo tem o potencial de reduzir significativamente o custo das terapias com células T CAR.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Bioengenharia

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabricação de Mecanicamente Tunable e Bioativos metal andaimes para aplicações biomédicas

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

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Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabricação e caracterização de andaimes de fibra Griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabricação de matriz de cartilagem-derivado Decellularized andaimes

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

Transdução e expansão de células T primárias em nove dias com manutenção do fenótipo da memória central

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Andaimes 3D macroporosos interligados de hastes de microgel

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...