Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения через номера грантов R37-CA260223, R21CA246414. Мы благодарим ядро проточной цитометрии NCSU за обучение и руководство по анализу проточной цитометрии. Схемы были созданы с помощью Biorender.com

Все процедуры с участием клеток первенства человека и ретровирусных векторов были выполнены в соответствии с руководящими принципами биологической безопасности Университета штата Северная Каролина и одобрены Управлением по охране окружающей среды и технике безопасности. Мононукле...

<ol>
	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma:+recent+clinical+advances+and+future+challenges.">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li><li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells.">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li><li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+CAR+T-cells+forward.">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cell+therapy:+current+limitations+and+potential+strategies.">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).</li><li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy:+A+new+era+in+cancer+immunotherapy.">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>Lee, H. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells.">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications.">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li><li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering.">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate:+properties+and+biomedical+applications.">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li><li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering:+part+1.+Structure,+gelation+rate+and+mechanical+properties.">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li><li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+nondairy+beverages.">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li><li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation,+tissue+retention+and+systemic+capture.">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li><li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence.">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li><li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots.">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy.">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells.">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li><li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells.">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li><li>. PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis.">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).</li><li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24</a> (2022)</li><li>Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

CAR-T-клеточная терапия продолжает вызывать интерес как для исследований, так и для коммерческих применений. Несмотря на успех CAR-T-клеточной терапии в лечении рака крови, высокая стоимость процедуры ограничивает ее использование. Представленный здесь протокол вводит новый метод перенос...

Иммунотерапия стала революционной парадигмой лечения рака из-за ее способности специфически нацеливаться на опухоли, ограничивать нецелевую цитотоксичность и предотвращать рецидив. В частности, клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CAR-T) приобрела популярность благодаря ее успеху в лечении лимфом и лейкемий. FDA одобрило первую терапию CAR-T-клетками в 2017 году, и с тех пор одобрило еще четыре CAR-T клеточныетерапии 1,2,3,4,5. CARs имеют домен распознавания антигена, обычно состоящий из одного цепного переменного фрагмента моноклонального антитела, который является специфическим для опухолевого ассоциированного антигена 3,4. Когда CAR взаимодействует со своим опухолеассоциированным антигеном, CAR-T-клетки активируются, что приводит к противоопухолевому ответу, включающему высвобождение цитокинов, цитолитическую дегрануляцию, экспрессию фактора транскрипции и пролиферацию Т-клеток. Для производства CAR-T-клеток кровь собирается у пациента для получения их Т-клеток. CARs генетически добавляются к Т-клеткам пациента с помощью вируса. CAR-T-клетки выращивают in vitro и вводят обратно пациенту 2,3,4,6. Успешная генерация CAR-T-клеток определяется эффективностью трансдукции, которая описывает количество Т-клеток, которые генетически модифицированы в CAR-T-клетки.
В настоящее время золотым стандартом генерации CAR-T-клеток является спинокуляция активированных Т-клеток и вируса на пластинахс ретронектиновым покрытием 7,8. Трансдукция начинается, когда вирусные частицы взаимодействуют с поверхностью Т-клеток. Ретронектин способствует колокализации вируса и клеток за счет повышения эффективности связывания между вирусными частицами и клетками, усиливая трансдукцию 7,8. Ретронектин плохо работает сам по себе и должен сопровождаться спинокуляцией, которая усиливает перенос генов путем концентрации вирусных частиц и увеличения поверхностной проницаемости Т-клеток, что облегчает вирусную инфекцию8. Несмотря на успех спинокуляции на пластинах с ретронектиновым покрытием, это сложный процесс, который требует нескольких циклов вращения и дорогостоящих реагентов. Поэтому альтернативные методы переноса вирусных генов, которые являются более быстрыми и дешевыми, очень желательны.
Альгинат является природным анионным полисахаридом, широко используемым в биомедицинской промышленности из-за его низкой стоимости, хорошего профиля безопасности и способности образовывать гидрогели при смешивании с двухвалентными катионами 9,10,11,12. Альгинат является GMP-совместимым полимером и в целом признан безопасным (GRAS) FDA13. Сшивание альгината с катионами создает стабильные гидрогели, часто используемые для заживления ран, доставки небольших химических препаратов и белков и транспортировки клеток 9,10,11,12,14,15,16. Благодаря своим превосходным гелеобразующим свойствам, альгинат является предпочтительным материалом для создания пористых каркасов путем сублимационной сушки10,17. Эти характеристики альгината делают его привлекательным кандидатом для производства каркаса, который может опосредуть перенос вирусных генов активированных клеток.
Здесь описан протокол для создания сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как каркасы Drydux, которые статически трансдуцируют Т-клетки путем переноса вирусных генов17,18. Процесс изготовления этих каркасов показан на рисунке 1. Эти каркасы устраняют необходимость в спинокуляции пластин с ретронектиновым покрытием. Макропористые альгинатные каркасы стимулируют взаимодействие вирусных частиц и Т-клеток, чтобы обеспечить эффективный перенос генов за один этап, не влияя на функциональность и жизнеспособность инженерных Т-клеток17. При правильном следовании эти макропористые альгинатные каркасы имеют эффективность трансдукции не менее 80%, упрощая и укорачивая процесс вирусной трансдукции.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Рисунок 1: Схема и временная шкала протокола. (A) Временная шкала для создания сухих макропористых альгинатных каркасов. Альгинат сшивается с кальцием-D-глюконатом и замораживается на ночь. Замороженные каркасы лиофилизируются в течение 72 ч, чтобы создать каркасы Drydux. (B) Временная шкала для вирусной трансдукции активированных клеток. Активированные клетки и вирус (MOI 2) высеивают поверх каркаса и инкубируют в полной среде, дополненной IL-7 и IL-15. Каркасы поглощают смесь и способствуют переносу вирусных генов. ЭДТА используется для растворения каркасов и изоляции трансдуцированных клеток. После двойной промывки PBS гранулу ячейки можно использовать для анализа. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PBMCs = мононуклеарные клетки периферической крови. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

Генная инженерия Т-клеток для терапии CAR-T-клетками вышла на передний план лечения рака за последние несколько лет. CAR-T-клетки продуцируются путем переноса вирусных генов в Т-клетки. Нынешний золотой стандарт переноса вирусных генов включает в себя спинокуляцию пластин с ретронектиновым покрытием, что является дорогостоящим и трудоемким. Существует значительная потребность в эффективных и экономичных методах получения CAR-T-клеток. Здесь описан метод изготовления недорогих, сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как каркасы Drydux, которые эффективно способствуют вирусной трансдукции активированных Т-клеток. Каркасы предназначены для использования вместо золотого стандарта спинокуляции пластин с ретронектиновым покрытием, засеянных вирусом, и упрощают процесс преобразования клеток. Альгинат сшивается с кальцием-D-глюконатом и замораживается на ночь для создания каркасов. Замороженные каркасы лиофилизируют в лиофилизаторе в течение 72 ч, чтобы завершить формирование сухих макропористых каркасов. Каркасы опосредуют перенос вирусных генов, когда вирусные и активированные Т-клетки сеются вместе поверх каркаса для производства генетически модифицированных клеток. Каркасы производят >85% первичной трансдукции Т-клеток, что сопоставимо с эффективностью трансдукции спинокуляции на пластинах, покрытых ретронектином. Эти результаты демонстрируют, что сухие макропористые альгинатные каркасы служат более дешевой и удобной альтернативой традиционному методу трансдукции.

Эти макропористые альгинатные каркасы легко сделать и должны выходить из лиофилизатора в виде пористых, пушистых и белых дисков. Хотя раствор кальция-альгината не изучен в этом эксперименте, он может быть отлит в различные формы для создания каркасов различной формы, в зависимости от п...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Здесь представлен протокол для создания сухих макропористых альгинатных каркасов, которые опосредуют эффективный перенос вирусных генов для использования в генной инженерии Т-клеток, включая Т-клетки для терапии CAR-T-клетками. Было показано, что каркасы трансдуцируют активированные первичные Т-клетки с трансдукцией >85%.

Изготовление и использование сухих макропористых альгинатных каркасов для вирусной трансдукции Т-клеток

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

В этом видео описан протокол для создания и использования сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как Drydux, которые эффективно способствуют трансдукции активированных Т-клеток. Drydux предназначен для использования вместо золотого стандарта спинокуляции пластин с покрытием RetroNectin, засеянных вирусом, и упрощает процесс преобразования клеток. Drydux обладает эффективностью трансдукции, сравнимой со спинокуляцией на пластинах с покрытием RetroNectin, и служит более дешевой и удобной альтернативой обычному методу трансдукции.Сначала готовят 0,4% раствор кальция-D-глюконата. Добавьте стерильную фильтрованную воду DI к кальцию-D-глюконату в стакане. Перемешивайте на средней скорости до тех пор, пока кальций-D-глюконат не растворится, что занимает примерно 1 1/2 часа.После растворения стерильно фильтруют раствор кальция-D-глюконата. Этот раствор можно хранить при комнатной температуре. Далее готовят 2% раствор альгината.Это может быть достигнуто с помощью флакона с винтовой крышкой или стакана. Оба будут показаны здесь. Осторожно добавьте ультрачистый альгинат в сосуд.Добавьте соответствующее количество воды DI к альгинату. Выберите самый большой перемешивание, который не будет препятствовать смешиванию, и добавьте его в сосуд. Размешайте раствор до тех пор, пока альгинат не растворится, что занимает примерно один час.Если на борту судна есть большие альгинатные скопления, наклоните судно вбок, чтобы выбить их. Небольшие комочки будут растворяться в течение часа, и не являются поводом для беспокойства. Как только 2%-ный раствор альгината растворится, уменьшите скорость перемешивания.Медленно добавляют равный объем раствора кальция-D-глюконата в раствор альгината. Медленное добавление поможет предотвратить образование слипших сгустков. Когда раствор кальция-глюконата будет добавлен, увеличьте скорость перемешивания и энергично перемешивайте в течение 15 минут.Наклоните судно вбок, чтобы удалить любые скопления, которые могли образоваться. После энергичного перемешивания в течение 15 минут убедитесь, что в растворе нет комочков. Пипетка раствора в 48 или 24-луночную пластину.Для 48-луночной пластины пипетка по 300 микролитров в каждую скважину. Следите за тем, чтобы отливать медленно и часто менять наконечники, так как раствор будет вязким и может прилипнуть к кончику. Для 24-луночной пластины пипетка по одному миллилитру в каждую скважину.Опять же, бросайте медленно и часто меняйте наконечники пипеток. Накройте плиты колодца крышкой и заморозьте при минусе 20 градусов цельсия на ночь. Подготовьте пластины для лиофилизатора, сняв крышки и закрепив верх салфетками и резинками.Поместите пластины в трубку лиофилизатора и наденьте лиофилизатор на 72 часа. Через 72 часа снимите пластину с лиофилизатора. Теперь строительные леса готовы к использованию для трансдукции.Если каркасы не используются немедленно, запечатайте пластину парапленкой и храните при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока это не понадобится. Для длительного хранения рекомендуется вакуумная герметизация пластины в дополнение к герметизации парапленкой. Концентрат вирусного супернатанта путем центрифугирования двух миллилитров вирусного раствора через центробежный фильтр по 1 500 г в течение 10 минут.На каркас необходимо от 100 до 200 микролитров концентрированного вируса. Вращайтесь в течение нескольких дополнительных минут, если объем концентрированного раствора вируса превышает 200 микролитров. Для каждого каркаса сделайте аликвоту из 1 миллиона активированных Т-клеток, взвешенных в 50 микролитрах полной клеточной культуральной среды.Добавьте концентрированный вирус в клеточную суспензию. Общий объем суспензии клеточного вируса не должен превышать 200 микролитров для 48-луночного каркаса или 350 микролитров для 24-луночного каркаса. Добавьте смесь клеточных вирусов по каплям в верхнюю часть сухого каркаса.Для экспериментов с отрицательным контролем используйте полную клеточную культуральную среду вместо концентрированного вируса. Добавьте эту клеточную суспензию в верхнюю часть сухого каркаса. Инкубируйте каркасы в инкубаторе клеточной культуры при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45-60 минут.Извлеките каркасы из инкубатора. Каркасы должны полностью впитывать раствор в течение этого времени. Чтобы вызвать пролиферацию, добавьте полную среду клеточного культивирования, дополненную IL-7 и IL-15, в каждую лунку.Также может использоваться Ил-2. Для 24-луночного каркаса добавьте один миллилитр. Для 48-луночного каркаса добавьте 500 микролитров.Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 72 часов. Клетки будут размножаться в течение 72 часов, что может сделать медиа оранжевым. Удалите лишние носители из каждой лунки.Чтобы изолировать клетки от каркаса, добавьте 0,25 молярного раствора ЭДТА к каждому каркасу. Добавьте один миллилитр для 24-луночных лесов или 300 микролитров для 48-луночных лесов. Дайте тарелке постоять или осторожно перемешайте в течение трех-четырех минут.После того, как пипетка в основном растворилась, пипетка осторожно входила и выходила внутрь колодца. Для полного растворения каркаса может потребоваться несколько этапов пипетирования. Переложите раствор в 15-миллилитровую центрифужную трубку.Дважды промыть ячейки PBS. Добавьте 12 миллилитров PBS в каждую трубку центрифуги. Центрифуга по 400 г в течение пяти минут.Ячейка гранулы будет образовываться в нижней части трубки. Аспирируйте раствор надосадочного вещества и повторите промывку. Будьте осторожны, чтобы полностью удалить супернатант с каждой стиркой, так как очень важно избавиться от всех ЭДТА.После промывки PBS во второй раз, гранула клетки готова к анализу. Проточная цитометрия использовалась для определения эффективности трансдукции каждой группы. Нетрансдуцированные клетки использовались в качестве отрицательного контроля и не показали трансдукции.Клетки, посеянные на каркасах без ретровируса GFP, также не показали трансдукции. Группа Драйдукса, которая активировала клетки, посеянные на сухие макропористые альгинатные каркасы, показала 85% трансдукции, чуть ниже, чем группа RetroNectin. Эти результаты демонстрируют, что каркасы Drydux эффективно трансдуцируют клетки путем переноса ретровирусных генов без необходимости спинокуляции пластин, покрытых retroNectin.Каркасы Drydux демонстрируют высокую эффективность трансдукции, сравнимую с RetroNectin, обеспечивая альтернативный метод преобразования Т-клеток. Из-за низкой стоимости производства каркасов Drydux этот процесс может значительно снизить стоимость терапии Т-клетками CAR.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Альгинат гидрогелей для трехмерных органной культуры яичников и Яйцеводы

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Использование прав Периваскулярная стволовых клеток для регенерации костной

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Альгината микрокапсулы в качестве 3D-платформа для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) для разных линий

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Изготовление механически перестраиваемых и биологически активных металлов строительные леса для биомедицинских применений

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Генерация ESC происхождения мыши эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием легких Decellularized Строительные леса

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Расплава Electrospinning написания трехмерных Poly(ε-caprolactone) леса с контролируемым морфологии тканей инженерных приложений

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Изготовление и характеристика Griffithsin модифицированные волокна подмости для профилактики передающихся половым

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Изготовление подмостей Decellularized хряща производные матрица

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

Трансдукция и расширение первичных Т-клеток за девять дней с поддержанием центрального фенотипа памяти

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Взаимосвязанные макропористые 3D-каркасы из микрогелевых стержней

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...