Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud a través de los números de subvención R37-CA260223, R21CA246414. Agradecemos al núcleo de citometría de flujo de NCSU por su capacitación y orientación sobre el análisis de citometría de flujo. Los esquemas se crearon con Biorender.com

Todos los procedimientos que involucran células de primacía humana y vectores retrovirales se realizaron de acuerdo con las pautas de Seguridad Biológica de la Universidad Estatal de Carolina del Norte y fueron aprobados por la Oficina de Salud y Seguridad Ambiental. Las células mononucleares de sangre periférica humana se compraron como abrigos leucocitarios de fuentes comerciales. Las células humanas primarias deben aislarse de las fracciones de pelaje leucocitario humano y requieren autorización de nivel 2 de b...

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	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. 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PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

La terapia de células CAR-T continúa ganando interés tanto para la investigación como para las aplicaciones comerciales. A pesar del éxito que la terapia de células CAR-T ha tenido en el tratamiento de cánceres de sangre, el alto costo del procedimiento limita su uso. El protocolo presentado aquí introduce un nuevo método para la transferencia de genes virales de células T sin la necesidad de espinoculación de placas recubiertas de retronectina. La producción de andamios secos de alginato macroporoso para med...

La inmunoterapia se ha convertido en un paradigma revolucionario de tratamiento del cáncer debido a su capacidad para atacar específicamente los tumores, limitar la citotoxicidad fuera del objetivo y prevenir la recaída. En particular, la terapia celular con receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) ha ganado popularidad debido a su éxito en el tratamiento de linfomas y leucemias. La FDA aprobó la primera terapia de células CAR-T en 2017 y, desde entonces, ha aprobado cuatro terapias más de células CAR-T 1,2,3,4,5. Los CAR tienen un dominio de reconocimiento de antígenos que generalmente consiste en un fragmento variable de cadena única de un anticuerpo monoclonal que es específico para un antígeno asociado al tumor 3,4. Cuando un CAR interactúa con su antígeno asociado al tumor, las células CAR-T se activan, lo que lleva a una respuesta antitumoral que implica la liberación de citoquinas, la desgranulación citolítica, la expresión del factor de transcripción y la proliferación de células T. Para producir células CAR-T, se recoge sangre del paciente para obtener sus células T. Los CAR se agregan genéticamente a las células T del paciente utilizando un virus. Las células CAR-T se cultivan in vitro y se infunden de nuevo en el paciente 2,3,4,6. La generación exitosa de células CAR-T está determinada por la eficiencia de transducción, que describe el número de células T que se modifican genéticamente en células CAR-T.
Actualmente, el estándar de oro para la generación de células CAR-T es la espinoculación de células T activadas y virus en placas recubiertas de retronectina 7,8. La transducción comienza cuando las partículas virales se involucran con la superficie de las células T. La retronectina promueve la colocalización de virus y células aumentando la eficiencia de unión entre las partículas virales y las células, mejorando la transducción 7,8. La retronectina no funciona bien por sí sola y necesita ir acompañada de espinoculación, lo que mejora la transferencia de genes al concentrar las partículas virales y aumentar la permeabilidad superficial de la célula T, lo que permite una infección viral más fácil8. A pesar del éxito de la espinoculación en placas recubiertas de retronectina, es un proceso complejo que requiere múltiples ciclos de centrifugado y reactivos costosos. Por lo tanto, los métodos alternativos para la transferencia de genes virales que son más rápidos y más baratos son altamente deseables.
El alginato es un polisacárido aniónico natural ampliamente utilizado en la industria biomédica debido a su bajo costo, buen perfil de seguridad y capacidad para formar hidrogeles al mezclarse con cationes divalentes 9,10,11,12. El alginato es un polímero que cumple con GMP y generalmente es reconocido como seguro (GRAS) por la FDA13. La reticulación del alginato con cationes crea hidrogeles estables que a menudo se usan en la cicatrización de heridas, la administración de pequeños fármacos químicos y proteínas, y el transporte celular 9,10,11,12,14,15,16. Debido a sus excelentes propiedades gelificantes, el alginato es el material preferido para crear andamios porosos por liofilización10,17. Estas características del alginato lo convierten en un candidato atractivo para producir un andamio que puede mediar la transferencia de genes virales de las células activadas.
Aquí se describe un protocolo para hacer andamios secos de alginato macroporoso, conocidos como andamios Drydux, que transducen estáticamente células T por transferencia de genes virales17,18. El proceso para hacer estos andamios se muestra en la Figura 1. Estos andamios eliminan la necesidad de espinoculación de las placas recubiertas de retronectina. Los andamios de alginato macroporoso estimulan la interacción de partículas virales y células T para permitir la transferencia eficiente de genes en un solo paso sin afectar la funcionalidad y viabilidad de las células T diseñadas17. Cuando se siguen correctamente, estos andamios de alginato macroporoso tienen una eficiencia de transducción de al menos el 80%, simplificando y acortando el proceso de transducción viral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema y cronología del protocolo . (A) Cronología para la fabricación de los andamios secos de alginato macroporoso. El alginato se reticula con el D-gluconato de calcio y se congela durante la noche. Los andamios congelados se liofilizan durante 72 h para crear los andamios Drydux. (B) Cronología para la transducción viral de células activadas. Las células activadas y el virus (MOI 2) se siembran en la parte superior del andamio y se incuban en medios completos suplementados con IL-7 e IL-15. Los andamios absorben la mezcla y promueven la transferencia de genes virales. El EDTA se utiliza para disolver los andamios y aislar las células transducidas. Después de lavar dos veces con PBS, el pellet celular se puede utilizar para el análisis. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; PBMCs = células mononucleares de sangre periférica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

La ingeniería genética de las células T para la terapia de células CAR-T ha llegado a la vanguardia del tratamiento del cáncer en los últimos años. Las células CAR-T se producen por transferencia de genes virales a células T. El estándar de oro actual de la transferencia de genes virales implica la espinoculación de placas recubiertas de retronectina, que es costosa y requiere mucho tiempo. Existe una necesidad significativa de métodos eficientes y rentables para generar células CAR-T. Aquí se describe un método para fabricar andamios de alginato macroporoso secos y de bajo costo, conocidos como andamios Drydux, que promueven eficientemente la transducción viral de células T activadas. Los andamios están diseñados para ser utilizados en lugar de la espinoculación estándar de oro de placas recubiertas de retronectina sembradas con virus y simplificar el proceso de transducción de células. El alginato se reticula con el D-gluconato de calcio y se congela durante la noche para crear los andamios. Los andamios congelados se liofilizan en un liofilizador durante 72 h para completar la formación de los andamios macroporosos secos. Los andamios median la transferencia de genes virales cuando el virus y las células T activadas se siembran juntas en la parte superior del andamio para producir células modificadas genéticamente. Los andamios producen >85% de transducción primaria de células T, que es comparable a la eficiencia de transducción de la espinoculación en placas recubiertas de retronectina. Estos resultados demuestran que los andamios secos de alginato macroporoso sirven como una alternativa más barata y conveniente al método de transducción convencional.

Estos andamios de alginato macroporoso son fáciles de hacer y deben salir del liofilizador como discos porosos, esponjosos y blancos. Aunque no estudiada en este experimento, la solución de calcio-alginato puede ser moldeada en diferentes moldes para crear andamios de diferentes formas, dependiendo de las necesidades del usuario 9,10. Los andamios son electrostáticos y pueden adherirse a la tapa de la placa del pozo o a un dedo enguantado. <strong class="xfig"...

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Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Aquí hay un protocolo para crear andamios de alginato macroporoso seco que median la transferencia eficiente de genes virales para su uso en ingeniería genética de células T, incluidas las células T para la terapia de células CAR-T. Se demostró que los andamios transducen células T primarias activadas con una transducción del >85%.

Fabricación y uso de andamios secos de alginato macroporoso para la transducción viral de células T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

En este video se describe un protocolo para crear y usar andamios de alginato macroporoso seco conocidos como Drydux que promueven eficientemente la transducción de células T activadas. Drydux está diseñado para ser utilizado en lugar de la espinoculación estándar de oro de placas recubiertas con RetroNectin sembradas con virus y simplifica el proceso de transducción de células. Drydux tiene una eficiencia de transducción comparable a la espinoculación en placas recubiertas de RetroNectin, y sirve como una alternativa más barata y conveniente al método de transducción convencional.Primero, prepare una solución al 0,4% de D-gluconato de calcio. Agregue agua DI filtrada estéril al D-gluconato de calcio en un vaso de precipitados. Revuelva a velocidad media hasta que el D-gluconato de calcio se haya disuelto, lo que toma aproximadamente 1 1/2 horas.Una vez disuelto, filtre estéril la solución de calcio-D-gluconato. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente. A continuación, prepare una solución de alginato al 2%.Esto se puede lograr usando un vial de tapa de rosca o un vaso de precipitados. Ambos se mostrarán aquí. Agregue cuidadosamente el alginato ultrapuro al recipiente.Agregue la cantidad adecuada de agua DI al alginato. Elija la barra de agitación más grande posible que no impida la mezcla y agréguela al recipiente. Revuelva la solución a fuego alto hasta que el alginato se disuelva, lo que toma aproximadamente una hora.Si hay grupos grandes de alginato en el costado del recipiente, incline el recipiente hacia los lados para desalojarlos. Los pequeños grupos se disolverán durante la hora y no son motivo de preocupación. Una vez que la solución de alginato al 2% se disuelve, reduzca la velocidad de agitación.Agregue lentamente un volumen igual de la solución de calcio-D-gluconato a la solución de alginato. Agregarlo lentamente ayudará a evitar que se formen grupos de reticulación. Cuando se haya agregado la solución de gluconato de calcio, aumente la velocidad de agitación y revuelva vigorosamente durante 15 minutos.Incline el vaso hacia los lados para eliminar cualquier grumo que pueda haberse formado. Después de remover vigorosamente durante 15 minutos, asegúrese de que no haya grumos en la solución. Pipeta la solución en una placa de 48 o 24 pocillos.Para una placa de 48 pocillos, pipetear 300 microlitros en cada pocillo. Asegúrese de fundir lentamente y cambie las puntas con frecuencia, ya que la solución será viscosa y puede adherirse a la punta. Para una placa de 24 pocillos, pipetear un mililitro en cada pocillo.Una vez más, colar lentamente y cambiar las puntas de la pipeta con frecuencia. Cubra las placas del pozo con una tapa y congele a 20 grados centígrados negativos durante la noche. Prepare las placas para el liofilizador quitando las tapas y asegurando la parte superior con toallitas y bandas de goma.Coloque las placas en el tubo liofilizador y colóquelas durante 72 horas. Después de 72 horas, retire la placa del liofilizador. Los andamios ya están listos para ser utilizados para la transducción.Si no utiliza los andamios inmediatamente, selle la placa con Parafilm y guárdela a cuatro grados centígrados hasta que sea necesario. Para el almacenamiento a largo plazo, se recomienda sellar al vacío la placa además de sellar con Parafilm. Concentrar sobrenadante viral centrifugando dos mililitros de solución viral a través de un filtro centrífugo a 1, 500 g durante 10 minutos.Se necesitan de 100 a 200 microlitros de virus concentrado por andamio. Girar durante unos minutos adicionales si el volumen de la solución de virus concentrada es superior a 200 microlitros. Para cada andamio, hacer una alícuota de 1 millón de células T activadas suspendidas en 50 microlitros de medios de cultivo celular completos.Agregue el virus concentrado a la suspensión celular. El volumen total de la suspensión del virus celular no debe exceder los 200 microlitros para un andamio de 48 pocillos, o 350 microlitros para un andamio de 24 pocillos. Agregue la mezcla de virus celular gota a gota a la parte superior del andamio seco.Para experimentos de control negativo, utilice medios de cultivo celular completos en lugar de virus concentrados. Agregue esta suspensión celular a la parte superior del andamio seco. Incubar los andamios en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante 45 a 60 minutos.Retire los andamios de la incubadora. Los andamios deben absorber completamente la solución durante este tiempo. Para inducir la proliferación, agregue medios de cultivo celular completos suplementados con IL-7 e IL-15 a cada pocillo.También se puede utilizar IL-2. Para un andamio de 24 pocillos, agregue un mililitro. Para un andamio de 48 pocillos, agregue 500 microlitros.Incubar a 37 grados centígrados durante 72 horas. Las células proliferarán durante las 72 horas, lo que puede hacer que los medios se vuelvan naranjas. Retire el exceso de medios de cada pocillo.Para aislar las células del andamio, agregue 0,25 molares de solución EDTA a cada andamio. Agregue un mililitro para andamios de 24 pocillos o 300 microlitros para andamios de 48 pocillos. Deje que el plato se asiente o agite suavemente durante tres o cuatro minutos.Una vez que se disuelva en su mayoría, pipetear hacia adentro y hacia afuera suavemente dentro del pozo. Es posible que se necesiten algunos pasos de pipeteo de entrada y salida para disolver completamente el andamio. Transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.Lave las células dos veces con PBS. Agregue 12 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga. Centrifugar a 400 g durante cinco minutos.Se formará un pellet celular en el fondo del tubo. Aspire la solución sobrenadante y repita el lavado. Tenga cuidado de eliminar completamente el sobrenadante con cada lavado, ya que es crucial deshacerse de todo el EDTA.Después de lavar con PBS por segunda vez, el pellet celular está listo para su análisis. Se utilizó citometría de flujo para determinar la eficiencia de transducción de cada grupo. Las células no transducidas se utilizaron como control negativo y no mostraron transducción.Las células sembradas en andamios sin retrovirus GFP tampoco mostraron transducción. El grupo Drydux, que tenía células activadas sembradas en los andamios secos de alginato macroporoso, mostró una transducción del 85%, justo más baja que el grupo RetroNectin. Estos resultados demuestran que los andamios Drydux transducen eficazmente las células mediante la transferencia de genes retrovirales sin la necesidad de espinoculación de placas recubiertas con RetroNectin.Los andamios Drydux exhiben una alta eficiencia de transducción comparable a RetroNectin, proporcionando un método alternativo para transducir células T. Debido al bajo costo de fabricación de los andamios Drydux, este proceso tiene el potencial de reducir significativamente el costo de las terapias de células T con CAR.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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