Name: fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından R37-CA260223, R21CA246414 Hibe Ödül Numaraları ile desteklenmiştir. NCSU flow cytometry core'a flow cytometry analizi konusunda eğitim ve rehberlik için teşekkür ederiz. Şemalar Biorender.com ile oluşturuldu

İnsan önceliği hücrelerini ve retroviral vektörleri içeren tüm prosedürler, Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi'nin Biyolojik Güvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi tarafından onaylandı. İnsan periferik kan mononükleer hücreleri, ticari kaynaklardan buffy paltolar olarak satın alındı. Birincil insan hücreleri, insan buffy ceket fraksiyonlarından izole edilmeli ve Biyogüvenlik Seviye 2 temizliği ve ayrıntılı standart çalışma prosedürle...

<ol>
	<li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+therapy+for+glioblastoma:+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing.">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li><li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma:+recent+clinical+advances+and+future+challenges.">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li><li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cells.">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li><li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+CAR+T-cells+forward.">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li><li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-T+cell+therapy:+current+limitations+and+potential+strategies.">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).</li><li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy:+A+new+era+in+cancer+immunotherapy.">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li><li>Lee, H. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells.">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li><li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+in+human+primary+T+cells.">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).</li><li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications.">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li><li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering.">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li><li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate:+properties+and+biomedical+applications.">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li><li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering:+part+1.+Structure,+gelation+rate+and+mechanical+properties.">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li><li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+nondairy+beverages.">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li><li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation,+tissue+retention+and+systemic+capture.">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li><li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence.">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li><li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots.">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy.">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).</li><li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells.">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li><li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells.">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li><li>. PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS Available from: <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022)</li><li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies.">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li><li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis.">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).</li><li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24</a> (2022)</li><li>Lin, H. -. R., Yeh, Y. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+alginate/hydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering:+Preparation,+characterization,+andin+vitro+studies.">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li><li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+poly(ethylene+glycol)+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique.">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).</li></ol>

CAR-T hücre tedavisi hem araştırma hem de ticari uygulamalar için ilgi görmeye devam etmektedir. CAR-T hücre tedavisinin kan kanserlerinin tedavisinde elde ettiği başarıya rağmen, prosedürün yüksek maliyeti kullanımını sınırlar. Burada sunulan protokol, retronektin kaplı plakaların spinokülasyonuna gerek kalmadan T hücrelerinin viral gen transferi için yeni bir yöntem sunmaktadır. Transdüksiyona aracılık etmek için kuru makrogözenekli aljinat iskeleleri üretmek nispeten basittir ve geleneks...

İmmünoterapi, tümörleri spesifik olarak hedefleme, hedef dışı sitotoksisiteyi sınırlama ve nüksetmeyi önleme kabiliyeti nedeniyle devrim niteliğinde bir kanser tedavisi paradigması olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle kimerik antijen reseptörü T (CAR-T) hücre tedavisi, lenfoma ve lösemi tedavisindeki başarısı nedeniyle popülerlik kazanmıştır. FDA, 2017 yılında ilk CAR-T hücre tedavisini onayladı ve o zamandan beri dört CAR-T hücre terapisini daha onayladı 1,2,3,4,5. CAR'lar genellikle tümörle ilişkili bir antijen 3,4 için spesifik olan bir monoklonal antikorun tek zincirli değişken fragmanından oluşan bir antijen tanıma alanına sahiptir. Bir CAR, tümörle ilişkili antijeniyle etkileşime girdiğinde, CAR-T hücreleri aktive olur ve sitokin salınımı, sitolitik degranülasyon, transkripsiyon faktörü ekspresyonu ve T hücresi proliferasyonunu içeren bir antitümör yanıta yol açar. CAR-T hücrelerini üretmek için, T hücrelerini elde etmek için hastadan kan toplanır. CAR'lar genetik olarak bir virüs kullanılarak hastanın T hücrelerine eklenir. CAR-T hücreleri in vitro olarak büyütülürve hastaya 2,3,4,6 geri verilir. CAR-T hücrelerinin başarılı bir şekilde üretilmesi, genetik olarak CAR-T hücrelerine dönüştürülen T hücrelerinin sayısını tanımlayan iletim verimliliği ile belirlenir.
Şu anda, CAR-T hücre üretimi için altın standart, retronektin kaplı plakalar 7,8 üzerinde aktive edilmiş T hücrelerinin ve virüsün spinokülasyonudur. Transdüksiyon, viral parçacıklar T hücrelerinin yüzeyine girdiğinde başlar. Retronektin, viral parçacıklar ve hücreler arasındaki bağlanma verimliliğini artırarak virüs ve hücrelerin kolokalizasyonunu teşvik eder ve transdüksiyonu arttırır 7,8. Retronektin kendi başına iyi çalışmaz ve viral parçacıkları yoğunlaştırarak ve T hücresinin yüzey geçirgenliğini artırarak gen transferini artıran ve daha kolay viral enfeksiyona izin veren spinokülasyonun eşlik etmesi gerekir8. Retronektin kaplı plakalarda spinokülasyonun başarısına rağmen, çoklu spin döngüleri ve pahalı reaktifler gerektiren karmaşık bir işlemdir. Bu nedenle, viral gen transferi için daha hızlı ve daha ucuz olan alternatif yöntemler oldukça arzu edilir.
Aljinat, düşük maliyeti, iyi güvenlik profili ve iki değerli katyonlar 9,10,11,12 ile karıştırıldığında hidrojel oluşturma kabiliyeti nedeniyle biyomedikal endüstrisinde yaygın olarak kullanılan doğal bir anyonik polisakkarittir. Aljinat, GMP uyumlu bir polimerdir ve genellikle FDA13 tarafından güvenli (GRAS) olarak kabul edilir. Aljinatın katyonlarla çapraz bağlanması, yara iyileşmesinde, küçük kimyasal ilaçların ve proteinlerin verilmesinde ve hücre taşınmasında sıklıkla kullanılan stabil hidrojeller oluşturur 9,10,11,12,14,15,16. Mükemmel jelleşme özellikleri nedeniyle, aljinat10,17 dondurarak kurutularak gözenekli iskeleler oluşturmak için tercih edilen malzemedir. Aljinatın bu özellikleri, aktif hücrelerin viral gen transferine aracılık edebilecek bir iskele üretmek için çekici bir aday olmasını sağlar.
Burada tarif edilen, Drydux iskeleleri olarak bilinen kuru makrogözenekli aljinat iskeleleri yapmak için kullanılan ve T hücrelerini viral gen transferi ile statik olarak dönüştüren bir protokoldür17,18. Bu iskelelerin yapım süreci Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu iskeleler, retronektin kaplı plakaların spinokülasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır. Makrogözenekli aljinat iskeleleri, mühendislik ürünü T hücrelerinin işlevselliğini ve yaşayabilirliğini etkilemeden tek bir adımda verimli gen transferini sağlamak için viral parçacıkların ve T hücrelerinin etkileşimini teşvik eder17. Doğru takip edildiğinde, bu makrogözenekli aljinat iskeleleri en az% 80'lik bir transdüksiyon verimliliğine sahiptir ve viral iletim sürecini basitleştirir ve kısaltır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Şekil 1: Protokolün şeması ve zaman çizelgesi. (A) Kuru makrogözenekli aljinat iskelelerinin yapılması için zaman çizelgesi. Aljinat, kalsiyum-D-glukonat ile çapraz bağlanır ve gece boyunca dondurulur. Dondurulmuş iskeleler, Drydux iskelelerini oluşturmak için 72 saat boyunca liyofilize edilir. (B) Aktif hücrelerin viral transdüksiyonu için zaman çizelgesi. Aktif hücreler ve virüs (MOI 2) iskelenin üzerine ekilir ve IL-7 ve IL-15 ile desteklenmiş tam ortamda inkübe edilir. İskeleler karışımı emer ve viral gen transferini teşvik eder. EDTA, iskeleleri çözmek ve dönüştürülmüş hücreleri izole etmek için kullanılır. PBS ile iki kez yıkandıktan sonra, hücre peleti analiz için kullanılabilir. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; PBMC'ler = periferik kan mononükleer hücreleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>UltraPure, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>No calcium chloride or magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Acetic Acid with Methylene Blue</td>
			<td>Stemcell Technologies Inc</td>
			<td>07060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium-D-Gluconate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28.2 Antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555725</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 Antibody</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-387</td>
			<td>100 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click&#39;s Media</td>
			<td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone FBS</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone RPMI 1640 Media</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>SH3009601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peripheral Blood Mononuclear Cells</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Fresh or frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRONOVA UP MVG</td>
			<td>NovaMatrix</td>
			<td>4200101</td>
			<td>Sodium alginate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-07</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1 x 106 TU/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and use of dry macroporous alginate scaffolds for viral transduction of t cells

CAR-T hücre tedavisi için T hücrelerinin genetik mühendisliği, son birkaç yılda kanser tedavisinde ön plana çıkmıştır. CAR-T hücreleri, T hücrelerine viral gen transferi ile üretilir. Viral gen transferinin mevcut altın standardı, pahalı ve zaman alıcı olan retronektin kaplı plakaların spinokülasyonunu içerir. CAR-T hücreleri üretmek için verimli ve uygun maliyetli yöntemlere önemli bir ihtiyaç vardır. Burada açıklanan, aktif T hücrelerinin viral transdüksiyonunu etkili bir şekilde teşvik eden Drydux iskeleleri olarak bilinen ucuz, kuru makrogözenekli aljinat iskelelerinin üretilmesi için bir yöntemdir. İskeleler, virüsle tohumlanmış retronektin kaplı plakaların altın standart spinokülasyonu yerine kullanılmak üzere tasarlanmıştır ve hücrelerin dönüştürülmesi işlemini basitleştirir. Aljinat, kalsiyum-D-glukonat ile çapraz bağlanır ve iskeleleri oluşturmak için gece boyunca dondurulur. Dondurulmuş iskeleler, kuru makrogözenekli iskelelerin oluşumunu tamamlamak için 72 saat boyunca bir liyofilizatörde dondurularak kurutulur. İskeleler, virüs ve aktive olmuş T hücreleri, genetiği değiştirilmiş hücreler üretmek için iskelenin üzerine birlikte tohumlandığında viral gen transferine aracılık eder. İskeleler, retronektin kaplı plakalarda spinokülasyonun transdüksiyon verimliliği ile karşılaştırılabilir olan% >85 primer T hücre transdüksiyonu üretir. Bu sonuçlar, kuru makrogözenekli aljinat iskelelerinin geleneksel transdüksiyon yöntemine daha ucuz ve daha uygun bir alternatif olarak hizmet ettiğini göstermektedir.

Bu makrogözenekli aljinat iskelelerinin yapımı kolaydır ve liyofilizatörden gözenekli, kabarık ve beyaz diskler olarak çıkmalıdır. Bu deneyde çalışılmamış olmasına rağmen, kalsiyum-aljinat çözeltisi, kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak farklı şekillerde iskeleler oluşturmak için farklı kalıplara dökülebilir 9,10. İskeleler elektrostatiktir ve iyi plakanın kapağına veya eldivenli bir parmağa yapışabilir. <strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells at JoVE.com

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Burada, CAR-T hücre tedavisi için T hücreleri de dahil olmak üzere T hücrelerinin genetik mühendisliğinde kullanılmak üzere verimli viral gen transferine aracılık eden kuru makrogözenekli aljinat iskeleleri oluşturmak için bir protokol bulunmaktadır. İskelelerin aktive olmuş primer T hücrelerini %>85 transdüksiyonla transdüksiyon yaptığı gösterilmiştir.

T Hücrelerinin Viral Transdüksiyonu için Kuru Makrogözenekli Aljinat İskelelerinin İmalatı ve Kullanımı

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Bu videoda açıklanan, aktif T hücrelerinin transdüksiyonunu verimli bir şekilde teşvik eden Drydux olarak bilinen kuru makrogözenekli aljinat iskelelerinin oluşturulması ve kullanılması için bir protokoldür. Drydux, virüs tohumlanmış RetroNektin kaplı plakaların altın standart spinokülasyonunun yerine kullanılmak üzere tasarlanmıştır ve hücrelerin dönüştürülmesi işlemini basitleştirir. Drydux, RetroNektin kaplı plakalarda spinokülasyonla karşılaştırılabilir bir transdüksiyon verimliliğine sahiptir ve geleneksel transdüksiyon yöntemine daha ucuz ve daha uygun bir alternatif olarak hizmet eder.İlk önce,% 0.4'lük bir kalsiyum-D-glukonat çözeltisi hazırlayın. Bir beherde kalsiyum-D-glukonata steril filtrelenmiş DI suyu ekleyin. Kalsiyum-D-glukonat çözünene kadar orta hızda karıştırın, bu da yaklaşık 1 1/2 saat sürer.Çözündükten sonra, kalsiyum-D-glukonat çözeltisini steril olarak filtreleyin. Bu çözelti oda sıcaklığında saklanabilir. Daha sonra,% 2'lik bir aljinat çözeltisi hazırlayın.Bu, bir vidalı kapak şişesi veya bir beher kullanılarak gerçekleştirilebilir. Her ikisi de burada gösterilecektir. Ultra saf aljinatı damara dikkatlice ekleyin.Aljinata uygun miktarda DI suyu ekleyin. Karıştırmayı engellemeyecek mümkün olan en büyük karıştırma çubuğunu seçin ve kaba ekleyin. Aljinat çözünene kadar çözeltiyi yüksekte karıştırın, bu da yaklaşık bir saat sürer.Geminin yan tarafında büyük aljinat kümeleri varsa, bunları yerinden çıkarmak için kabı yana doğru eğin. Küçük kümeler saat içinde çözülür ve endişe kaynağı değildir. % 2 aljinat çözeltisi çözündükten sonra, karıştırma hızını azaltın.Aljinat çözeltisine yavaşça eşit miktarda kalsiyum-D-glukonat çözeltisi ekleyin. Yavaşça eklemek, çapraz bağlanan kümelerin oluşmasını önlemeye yardımcı olacaktır. Kalsiyum-glukonat çözeltisi eklendiğinde, karıştırma hızını artırın ve 15 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.Oluşmuş olabilecek kümeleri çıkarmak için kabı yana doğru eğin. 15 dakika boyunca kuvvetlice karıştırdıktan sonra, çözeltide küme olmadığından emin olun. Çözeltiyi 48 veya 24 delikli bir plakaya pipetleyin.48 delikli bir plaka için, her bir kuyucuğa 300 mikrolitre pipet yerleştirin. Çözelti viskoz olacağından ve uca yapışabileceğinden, yavaşça döktüğünüzden ve uçları sık sık değiştirdiğinizden emin olun. 24 delikli bir plaka için, her bir kuyucuğa bir mililitre pipet yerleştirin.Yine, yavaşça dökün ve pipet uçlarını sık sık değiştirin. Kuyu plakalarını bir kapakla örtün ve gece boyunca negatif 20 santigrat derecede dondurun. Kapakları çıkararak ve üstünü mendil ve lastik bantlarla sabitleyerek liyofilizatör için plakaları hazırlayın.Plakaları liyofilizatör tüpüne yerleştirin ve 72 saat boyunca liyofilizatörü takın. 72 saat sonra, plakayı liyofilizatörden çıkarın. İskeleler artık aktarma için kullanılmaya hazırdır.İskeleleri hemen kullanmıyorsanız, plakayı Parafilm ile kapatın ve ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Uzun süreli depolama için, Parafilm ile sızdırmazlığa ek olarak plakanın vakumla kapatılması önerilir. İki mililitre viral çözeltiyi 10 dakika boyunca 1.500 g'da bir santrifüj filtreden geçirerek viral süpernatantı konsantre edin.İskele başına 100 ila 200 mikrolitre konsantre virüse ihtiyaç vardır. Konsantre virüs çözeltisi hacmi 200 mikrolitreden büyükse birkaç dakika daha döndürün. Her iskele için, 50 mikrolitre tam hücre kültürü ortamında asılı olan 1 milyon aktif T hücresinden oluşan bir aliquot yapın.Konsantre virüsü hücre süspansiyonuna ekleyin. Hücre virüsü süspansiyonunun toplam hacmi, 48 kuyulu bir iskele için 200 mikrolitreyi veya 24 kuyulu bir iskele için 350 mikrolitreyi geçmemelidir. Hücre virüsü karışımını kuru iskelenin üstüne damla damla ekleyin.Negatif kontrol deneyleri için, konsantre virüs yerine tam hücre kültürü ortamı kullanın. Bu hücre süspansiyonunu kuru iskelenin üstüne ekleyin. Hücre kültürü inkübatöründeki iskeleleri 45 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.İskeleleri inkübatörden çıkarın. İskeleler bu süre zarfında çözeltiyi tamamen emmelidir. Proliferasyonu indüklemek için, her bir kuyucuğa IL-7 ve IL-15 ile desteklenmiş tam hücre kültürü ortamı ekleyin.IL-2 de kullanılabilir. 24 kuyulu bir iskele için bir mililitre ekleyin. 48 kuyulu bir iskele için 500 mikrolitre ekleyin.72 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler 72 saat içinde çoğalır ve bu da medyayı turuncuya çevirebilir. Her bir kuyu boşluğundan fazla medyayı çıkarın.Hücreleri iskeleden izole etmek için, her iskeleye 0.25 molar EDTA çözeltisi ekleyin. 24 kuyulu iskeleler için bir mililitre veya 48 delikli iskeleler için 300 mikrolitre ekleyin. Tabağın oturmasına izin verin veya üç ila dört dakika boyunca hafifçe çalkalayın.Çoğunlukla çözüldükten sonra, kuyunun içine yavaşça girip çıkın. İskeleyi tamamen çözmek için birkaç giriş ve çıkış pipetleme adımı gerekebilir. Çözeltiyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Her santrifüj tüpüne 12 mililitre PBS ekleyin. Beş dakika boyunca 400 g'da santrifüj.Tüpün dibinde bir hücre peleti oluşacaktır. Süpernatant çözeltiyi aspire edin ve yıkamayı tekrarlayın. Tüm EDTA'dan kurtulmak çok önemli olduğu için her yıkamada süpernatantı tamamen çıkarmaya dikkat edin.PBS ile ikinci kez yıkandıktan sonra, hücre peleti analiz için hazırdır. Her grubun transdüksiyon verimliliğini belirlemek için akım sitometrisi kullanıldı. Transdüke edilmemiş hücreler negatif kontrol olarak kullanıldı ve transdüksiyon göstermedi.GFP retrovirüsü olmayan iskelelere tohumlanan hücreler de transdüksiyon göstermedi. Kuru makrogözenekli aljinat iskelelerine tohumlanmış aktive olmuş hücreleri aktive eden Drydux grubu, RetroNectin grubundan sadece daha düşük% 85 transdüksiyon gösterdi. Bu sonuçlar, Drydux iskelelerinin, RetroNektin kaplı plakaların spinokülasyonuna gerek kalmadan retroviral gen transferi yoluyla hücreleri etkili bir şekilde dönüştürdüğünü göstermektedir.Drydux iskeleleri, RetroNectin ile karşılaştırılabilir yüksek iletim verimliliği sergiler ve T hücrelerinin dönüştürülmesi için alternatif bir yöntem sunar. Drydux iskelelerinin düşük üretim maliyeti nedeniyle, bu işlem CAR T hücresi tedavilerinin maliyetini önemli ölçüde düşürme potansiyeline sahiptir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Yumurtalıklar ve fallop borularında Üç Boyutlu Organ Kültür Aljinatta Hidrojeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biyomedikal Uygulamalar için Mekanik ayarlanabilir ve Biyoaktif Metal iskelelerinin Fabrikasyon

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

İmalat ve Fiber Griffithsin-modified iskele karakterizasyonu önlenmesi için cinsel enfeksiyonlar iletilen

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Decellularized matris kıkırdak elde edilen iskele imalatı

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Transduction and Expansion of Primary T Cells in Nine Days with Maintenance of Central Memory Phenotype

Merkezi Bellek Fenotip Bakımı ile Dokuz Günde Primer T Hücrelerinin Transdüksiyonu ve Genişlemesi

Emerging immunotherapies to treat infectious diseases and cancers often involve transduction of cellular populations with genes encoding disease-targeting ...

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

Mikrojel Çubuklardan Birbirine Bağlı Makrogözenekli 3D İskeleler

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...