Name: xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo
Uploaded: 2022-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist finansieret af sponsorerede forskningsaftaler fra TRex Bio og tilskud fra NIH (1R01AR075864-01A1). JMM er støttet af Kræftens Bekæmpelse (bevilling 26005). Vi anerkender Parnassus Flow Cytometry Core delvist støttet af tilskud NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 og S10 1S10OD018040-01.

Denne undersøgelse blev godkendt og udført i overensstemmelse med UCSF IACUC (AN191105-01H) og IRB (13-11307) protokoller. Hudprøver, kasseret som en del af rutinemæssige elektive kirurgiske procedurer, såsom brokreparation, blev brugt til den nuværende forskning. Hudprøverne er enten afidentificerede og certificeret som ikke-human forsøgsforskning, eller, hvis klinisk identificerende oplysninger er nødvendige for downstream-analyser, gav patienterne skriftligt samtykke i henhold til IRB-protokol 13-11307. Der b...

<ol>
	<li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wound+healing+in+humans+and+mice:+Challenges+in+translational+research.">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).</li><li>Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+approaches+to+create+murine+models+of+human+wound+healing.">Surgical approaches to create murine models of human wound healing.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2011, 969618 (2011).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+skin+immunity+and+inflammation.">Mechanisms regulating skin immunity and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).</li><li>Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+skin+organoids:+potential+opportunities+and+challenges.">Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).</li><li>Crist&#243;bal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+human+skin+transplantation:+a+systematic+review.">Mouse models for human skin transplantation: a systematic review.</a> Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/&#947;cnull+mouse:+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/&#947;cnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Meraz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+patient-derived+xenograft+humanized+mouse+model+for+evaluation+of+lung+cancer+immune+responses.">An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses.</a> Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).</li><li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD-scid+IL2rgamma(null)+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection.">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li><li>Meehan, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+xenograft+model+of+human+vasculature+in+the+mouse+ear+pinna.">Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).</li><li>Gokkaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+graft+storage+in+platelet+rich+plasma+(PRP).">Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP).</a> Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).</li><li>. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA">https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA</a> (2021)</li><li>Rodriguez, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+regulatory+T+cells+reside+in+human+skin.">Memory regulatory T cells reside in human skin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).</li><li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+rodent+aseptic+surgery.">Techniques in rodent aseptic surgery.</a> Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).</li><li>Karim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ischemia+and+neovascularization+in+a+murine+model+of+full+thickness+human+wound+healing.">Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2R&#947;null+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2R&#947;null mice display a T-effector memory phenotype.</a> PloS One. 7 (8), 44219 (2012).</li><li>Souci, L., Denesvre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+skin+models+in+domestic+animals.">3D skin models in domestic animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).</li><li>Holtkamp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+guide+dendritic+cells+into+skin+lymphatics.">Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics.</a> Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).</li></ol>

Mus xenograft hudtransplantationsmodellen er en nøgleteknik til mekanisk at dissekere menneskers hudimmunresponser i en in vivo-indstilling 14. Vellykkede hudtransplantationer er afhængige af passende forberedelse af mus og hudprøver og mus og overholdelse af aseptiske gnaveroperationsmetoder15. Hurtig afkøling og korrekt opbevaring af hudprøver ved kolde temperaturer i medier (såsom sterilt saltvand) er vigtigt for at sikre fortsat vævssundhed inden transpl...

Musemodeller bruges ofte til at drage slutninger om menneskelig biologi og sygdom, dels på grund af deres eksperimentelle reproducerbarhed og kapacitet til genetisk manipulation. Musefysiologi rekapitulerer imidlertid ikke fuldstændigt menneskelige organsystemer, især hud, og har derfor begrænsninger for anvendelse som præklinisk model i lægemiddeludvikling1. Anatomiske forskelle mellem mus og menneskelig hud omfatter forskelle i epiteltykkelser og arkitektur, mangel på murine ekkrine svedkirtler og variationer i hårcykling2. Desuden er både immunsystemets medfødte og adaptive arme divergerende mellem de to arter3. Musens hud indeholder en unik immunpopulation af dendritiske epidermale T-celler (DETC'er), har en højere overflod af dermale γδ T-celler og varierer i immuncelleundergruppelokalisering sammenlignet med humant væv4. Derfor drager eksperimentelle fund vedrørende human hudbiologi og betændelse fordel af validering med humant væv. Mens in vitro - og organoidkultursystemer er almindeligt anvendte værktøjer til at studere humant væv, er disse systemer begrænset af fraværende eller ufuldstændig immunrekonstitution og manglende forbindelse til perifer vaskulatur5. Den humaniserede xenograft hudtransplantationsmodel sigter mod at muliggøre terapeutisk eller biologisk manipulation af immun- og ikke-immunveje i humant væv in vivo.
Den menneskelige hud xenograft model er blevet brugt til at studere hudfysiologi og farmakologi, analysere immunafvisning og reaktioner, dissekere menneskelige hudkræftmekanismer og forstå hudsygdomme og sårheling6. Selvom den er anvendelig på flere hudforskningsområder, har xenograft-modellen lavere gennemstrømning end in vitro-undersøgelser og mangler den lette genetiske manipulation, der anvendes i musemodeller. Tidspunkter inden for denne model kan variere fra uger til måneder, og vellykket podning kræver passende faciliteter og udstyr til at udføre disse operationer. Xenograft-modellen leverer imidlertid biologisk og fysiologisk kontekst til eksperimenter, mens organoidkultursystemer, såsom vævseksplanter, ofte kræver replikering af et utal af bevægelige dele, såsom eksogene signaler, med bestemte tidsintervaller7. Derfor bruges denne model bedst til yderligere at validere fund observeret in vitro og inden for musemodeller eller til arbejde, der ellers ikke er biologisk muligt. Hensigtsmæssig brug af xenograftmodellen giver en enestående mulighed for at studere og manipulere intakt humant væv in vivo.
Optimering af xenograft hudtransplantationsmodellen har været afhængig af årtiers forskning for at bevare transplantatintegriteten over tid. Kritisk for denne proces er at udnytte den ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) mus, som mangler B og T adaptive immunceller, funktionelle NK-celler og har mangler i makrofag og dendritiske celler8. Den immundefekte karakter af disse NSG-værter muliggør transplantation af humane hæmatopoietiske celler, patientafledte kræftformer og hud 8,9,10. På trods af dette immunsuppressive værtsmiljø er yderligere undertrykkelse af musens neutrofile immunrespons ved administration af anti-GR1 nødvendig for transplantatsucces10. De største hindringer ved transplantation af intakt væv er infektion, afvisning og vanskeligheder med at genoprette blodgennemstrømningen til transplantatet, hvilket undertiden fører til tab af dermal og epidermal integritet11. Teknikker, herunder administration af anti-FR1 og brug af passende transplantatdybde, forbedrer graftoverlevelsen10. Omhyggelig optimering gør det muligt at udføre human xenograft hudtransplantationer på NSG-mus med høj effektivitet og overlevelsesrater, der spænder fra 90% -100%.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>surgical glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>56-0451-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GR1 clone RB6-8C5</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0075</td>
			<td>Anti-rejection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC mouse anti-human CD25&#160; (Clone 2A3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340939</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-9956-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave pouches</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>89140-800</td>
			<td>For autoclaving tools and paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317438</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301042</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317328</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex 0.3 mg/mL</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>059122</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NADA # 141-199</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4188</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D42 Dermatome blade</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>5.D42BL10</td>
			<td>dermatome (1 blade per sample)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermatome D42</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>4.D42</td>
			<td>dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371610</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-10915-03</td>
			<td>To pin skin specimen for dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>medicon</td>
			<td>02.04.10</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5521-00</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4776-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric clippers</td>
			<td>Kent</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765040</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Hematoxylin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765015</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 (Clone HI30)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0459-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>medicon</td>
			<td>07.60.07</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Morganville Scientific</td>
			<td>HL0100</td>
			<td>Post-surgical care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads 4&#34; x 10&#34;</td>
			<td>Pristech</td>
			<td>20415</td>
			<td>Surgical heat supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin 1cc 12.7 mm syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329410</td>
			<td>drug administration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>United States Pharmacopeia (USP)&#160;</td>
			<td>NDC 66794-013-25</td>
			<td>Anesthesia&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>911103</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair for Men</td>
			<td>Nair</td>
			<td>&#8206; 10022600588556</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>&#160;NDC 17478-235-35</td>
			<td>eye ointment to prevent drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Kleenex</td>
			<td>100848</td>
			<td>May be autoclaved for sterile surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td>Semitransparent sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557938</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561283</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-1529-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer 10x</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305-654</td>
			<td>Site preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-Iodine Swab stick</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S41350</td>
			<td>Site sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)</td>
			<td>Se Lab Group Inc</td>
			<td>NC9066511&#160;</td>
			<td>For supplementing poorly recovering mice post-surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Collection Cups</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-150-266</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile alcohol prep pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Media for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-02</td>
			<td>For drug dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Film 4&#8221; x 43/4&#8221;&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1626</td>
			<td>transparent film wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline Petrolatum Gauze 3&#8221; x 8&#8221;&#160;</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>414600</td>
			<td>wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet 510 Ghost Dye&#160;</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Viability dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo

Den humane hud xenograft-model, hvor human donorhud transplanteres på en immundefekt musevært, er en vigtig mulighed for translationel forskning inden for hudimmunologi. Murine og menneskelig hud adskiller sig væsentligt i anatomi og immuncellesammensætning. Derfor har traditionelle musemodeller begrænsninger for dermatologisk forskning og lægemiddelopdagelse. Imidlertid er vellykkede xenotransplanter teknisk udfordrende og kræver optimal forberedelse af prøve- og musetransplantatstedet til podning og værtsoverlevelse. Den nuværende protokol giver en optimeret teknik til transplantation af menneskelig hud på mus og diskuterer nødvendige overvejelser for nedstrøms eksperimentelle mål. Denne rapport beskriver den passende forberedelse af en human donor hudprøve, samling af en kirurgisk opsætning, mus og kirurgisk sted forberedelse, hudtransplantation og post-kirurgisk overvågning. Overholdelse af disse metoder muliggør vedligeholdelse af xenotransplantater i over 6 uger efter operationen. Teknikkerne skitseret nedenfor tillader maksimal podningseffektivitet på grund af udviklingen af tekniske kontroller, steril teknik og præ- og postkirurgisk konditionering. Passende ydeevne af xenograftmodellen resulterer i langlivede humane hudtransplantatprøver til eksperimentel karakterisering af human hud og præklinisk testning af forbindelser in vivo.

Human hud xenografts blev udført på NSG mus inde i en super-barriere dyr facilitet. Succes blev defineret af den langvarige transplantat- og museoverlevelse og adfærdsmæssige sundhed hos mus efter transplantation. Dårlig overlevelse i ugen efter operationen blev oprindeligt observeret som den største barriere for eksperimentel succes, hvor op til 50% af musene krævede eutanasi. Forbedring af steril teknik og bedre understøttelse af musens kropstemperaturer under og umiddelbart efter operationen øgede kirurgisk o...

Watch this Scientific Journal Video about Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo at JoVE.com

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

Den nuværende protokol beskriver, hvordan man transplanterer menneskelig hud på ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -scid interleukin-2 gammakædereceptor (NSG) mus. Rapporten indeholder en detaljeret beskrivelse af klargøring af menneskers hud til transplantation, klargøring af mus til transplantation, transplantation af menneskelig hud med delt tykkelse og genopretningsprocedure efter transplantation.

Xenograft hudmodel til at manipulere humane immunresponser in vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

Vi skitserer teknikker, der er nødvendige for den menneskelige xenograft hudtransplantationsmodel, et vigtigt redskab til manipulation af immun- og ikke-immunveje i humant væv in vivo. Denne teknik rekapitulerer bedre menneskelig hudfysiologi end in vitro-metoder, hvilket giver mulighed for præklinisk eksperimentel manipulation in vivo. Xenograft hudtransplantationer kan bruges til præklinisk test af forbindelser rettet mod human hudbetændelse in vivo.Bandaging mus kan være særligt udfordrende, så vi vil anbefale at øve bandageprocessen på sunde bedøvede mus, inden de udfører operationer. Til at begynde med skal du forberede dig på at dermatome den menneskelige hudprøve i en steriliseret undertryksvævskulturhætte på et steriliseret dissektionskort. Placer hudprøven med epidermissiden opad på dissektionspladen og tør epidermis af med en steril alkoholforberedelsespude efterfulgt af PBS.Brug nu en 1,5 tommer dissekerende T-stift til at fastgøre den tættere kant af huden. Dermatomer derefter hudprøven ved 400 mikrometer tykkelse og påfør konstant tryk, mens du skærer fremad i en vinkel på 30 til 45 grader. Placer en steril gaze gennemblødt i steril PBS i bunden af petriskålen og læg huden med epidermis side opad på den våde gaze.Pladekanterne forsegles og dækkes med en halvgennemsigtig tætningsfilm for at sikre, at prøven ikke er forurenet, og prøven opbevares ved fire grader Celsius inden podning. Forbered de sterile instrumenter og den kirurgiske station til podning, og brug autoklaverede papirhåndklæder som sterile overflader til placering af instrumenter og mus. Efter anæstesiinduktion overføres musen til en varmepude eller en anden varmekilde og administrerer den oftalmiske salve ved at duppe en lille dråbe salve på øjet med en behandsket finger.Klem huden og injicer subkutant analgetika i en vinkel parallelt med kroppen. Efter at have løftet musen ved halen, skal du udsætte maven og injicere 100 mikrogram pr. 100 mikroliter anti-Gr1 intraperitonealt i en 30 graders vinkel ved hjælp af en en milliliter insulinsprøjte. Brug derefter dyresikre elektriske klippere til at barbere den midterste og øverste del af musens dorsale side.Når du har ryddet alle hårene, skal du anvende en generøs mængde hårfjerningssalve på den barberede hud. Vent i 30 sekunder til et minut, og tør derefter hårfjerningssalven helt af med et papirhåndklæde og PBS. Efter overførsel af musen til den kirurgiske station skal du sterilisere det kirurgiske område og placere en steril plastfolie over musen.Skær et vindue i plasten, der er lidt større end størrelsen på det område, der skal podes. Hold donorhuden godt på plads med tangens bagside og skær en rektangelformet 10 x 10 millimeter del af donorhuden, der skal podes sammen med tangen med en skalpel. Træk huden væk fra kroppen for at undgå at skære dybt ind i fasciaen.For at skabe en podningsseng skal du klippe et rektangulært område af musehud, der matcher størrelsen på donorhudstykket. Placer derefter donorhudstykket med epidermissiden opad på den forberedte podningsseng. Brug bagsiden af tangen til at manipulere huden, der glider frem og tilbage, indtil donorhuden ligger helt fladt mod transplantatsengen.Tilsæt klæbende dråber til kirurgisk limvæv, hvor donorhuden møder musehuden, og hold musen og donorhuden sammen med tang i et til to sekunder, så limen klæber til vævene. Forsegl transplantatets kant helt, og lad limen tørre grundigt. Skær derefter petrolatumgas, der er stort nok til at dække transplantatområdet fuldstændigt.Dæk transplantatet med petrolatumgassen og tryk let gasbindet mod huden ved hjælp af tang. Skær en strimmel af en gennemsigtig filmdressing på langs, så bredden er stor nok til at dække musens sår. Tryk hårdt på den gennemsigtige filmdressing med klæbesiden nedad over gasbindet.Rul hurtigt musen for at vikle dressingen helt rundt om torsoen, så den passer tæt uden at hindre åndedrættet, og alle lemmer er fri til bevægelse. Når du har placeret musen i et genopretningsbur, skal du overvåge den, indtil den er opmærksom og bevæger sig rundt. Sørg for en varmekilde fra burets side i mindst 15 minutter efter genvinding.Analyse af transplantater 10 til 21 dage efter transplantationen viste, at transplantatet forblev klæbende rundt om kanterne, hvor donorens hud møder musens hud, og transplantatet forblev tykkere og mere betændt end sund menneskelig hud. Analyse ved flowcytometri afslørede den vedvarende tilstedeværelse af humane immunceller inden for de fleste transplantater, men antallet varierede mellem xenotransplantater. Det vellykkede transplantat opretholdt de humane immunceller.På trods af fortsat overholdelse og overlevelse af donorvæv anses transplantater, der ikke har opretholdt de humane immunceller, imidlertid for mislykkede. Analyse af hæmatoxylin og eosin farvede sektioner af transplantatet efter 35 dage viste intakt epidermis, og dermis er moderat cellulær sammensat af fyldige ovale fibroblaster med bleg syncytial cytoplasma og spredte lymfocytter. Analyse af transplantatet efter 50 dage viste lignende resultater med intakt epidermis og dermis indeholdende ovale fibroblaster og let forbedret ekstracellulær matrixaflejring.Succesfulde hudxenotransplantater er afhængige af passende forberedelse af hudprøver, undertrykkelse af musens neutrofile immunresponser ved administration mod Gr1, overholdelse af aseptiske gnaverkirurgiske metoder og sikker bandage af mus. Den humane xenograft hudtransplantationsmodel giver forskere mulighed for at studere humane immunresponser i det intakte organ in vivo, hvilket giver en ny vej til translationel forskning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation af Tail Hud til Study Allogen CD4 T-celle respons i mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til måling immunresponser på malaria i forbindelse med hiv co-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Brug zebrafisk modeller af human influenza A-virus infektioner at Screen antivirale lægemidler og karakterisere værtsimmunsystem Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

En suge Blister protokol at studere Human T-celle hjemkalde svar In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...