Name: xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo
Uploaded: 2022-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato in parte da accordi di ricerca sponsorizzati da TRex Bio e sovvenzioni dal NIH (1R01AR075864-01A1). JMM è sostenuto dalla Cancer Research Society (sovvenzione 26005). Riconosciamo il Parnassus Flow Cytometry Core supportato in parte dalle sovvenzioni NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 e S10 1S10OD018040-01.

Il presente studio è stato approvato ed eseguito in conformità con i protocolli UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Campioni di pelle, scartati come parte di procedure chirurgiche elettive di routine, come la riparazione dell'ernia, sono stati utilizzati per la presente ricerca. I campioni di pelle sono de-identificati e certificati come Not Human Subjects Research o, se sono richieste informazioni clinicamente identificative per le analisi a valle, i pazienti hanno fornito il consenso scritto ai sensi del prot...

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	<li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wound+healing+in+humans+and+mice:+Challenges+in+translational+research.">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).</li><li>Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+approaches+to+create+murine+models+of+human+wound+healing.">Surgical approaches to create murine models of human wound healing.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2011, 969618 (2011).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/&#947;cnull+mouse:+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/&#947;cnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Meraz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+patient-derived+xenograft+humanized+mouse+model+for+evaluation+of+lung+cancer+immune+responses.">An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses.</a> Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).</li><li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD-scid+IL2rgamma(null)+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection.">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li><li>Meehan, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+xenograft+model+of+human+vasculature+in+the+mouse+ear+pinna.">Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).</li><li>Gokkaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+graft+storage+in+platelet+rich+plasma+(PRP).">Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP).</a> Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).</li><li>. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA">https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA</a> (2021)</li><li>Rodriguez, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+regulatory+T+cells+reside+in+human+skin.">Memory regulatory T cells reside in human skin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).</li><li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+rodent+aseptic+surgery.">Techniques in rodent aseptic surgery.</a> Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).</li><li>Karim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ischemia+and+neovascularization+in+a+murine+model+of+full+thickness+human+wound+healing.">Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2R&#947;null+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2R&#947;null mice display a T-effector memory phenotype.</a> PloS One. 7 (8), 44219 (2012).</li><li>Souci, L., Denesvre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+skin+models+in+domestic+animals.">3D skin models in domestic animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).</li><li>Holtkamp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+guide+dendritic+cells+into+skin+lymphatics.">Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics.</a> Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).</li></ol>

Il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto di topo è una tecnica chiave per sezionare meccanicamente le risposte immunitarie della pelle umana in un ambiente in vivo 14. Il successo dei trapianti di xenotrapianto cutaneo si basa su un'adeguata preparazione di topi e campioni di pelle e topi e sull'aderenza ai metodi di chirurgia asettica dei roditori15. Il raffreddamento rapido e la corretta conservazione dei campioni di pelle a basse temperature in terreni...

I modelli murini sono spesso usati per fare inferenze sulla biologia umana e sulle malattie, in parte a causa della loro riproducibilità sperimentale e della capacità di manipolazione genetica. Tuttavia, la fisiologia del topo non ricapitola completamente i sistemi di organi umani, in particolare la pelle, e quindi ha limitazioni per l'uso come modello preclinico nello sviluppo di farmaci1. Le differenze anatomiche tra la pelle del topo e quella umana includono differenze negli spessori epiteliali e nell'architettura, mancanza di ghiandole sudoripare eccrine murine e variazioni nel ciclo dei capelli2. Inoltre, sia il braccio innato che quello adattativo del sistema immunitario sono divergenti tra le due specie3. La pelle di topo contiene una popolazione immunitaria unica di cellule T epidermiche dendritiche (DETC), ha una maggiore abbondanza di cellule T γδ dermiche e varia nella localizzazione del sottogruppo di cellule immunitarie rispetto al tessuto umano4. Pertanto, i risultati sperimentali riguardanti la biologia della pelle umana e l'infiammazione beneficiano della convalida con tessuto umano. Mentre i sistemi di coltura in vitro e organoidi sono strumenti ampiamente utilizzati per studiare il tessuto umano, questi sistemi sono limitati dalla ricostituzione immunitaria assente o incompleta e dalla mancanza di connessione con la vascolarizzazione periferica5. Il modello umanizzato di trapianto di pelle di xenotrapianto mira a consentire la manipolazione terapeutica o biologica di percorsi immunitari e non immunitari nei tessuti umani in vivo.
Il modello di xenotrapianto di pelle umana è stato utilizzato per studiare la fisiologia e la farmacologia della pelle, analizzare il rigetto immunitario e le risposte, analizzare i meccanismi del cancro della pelle umana e comprendere le malattie della pelle e la guarigione delle ferite6. Sebbene applicabile a più campi della ricerca sulla pelle, il modello di xenotrapianto ha un rendimento inferiore rispetto agli studi in vitro e manca della facilità di manipolazione genetica impiegata nei modelli murini. I punti temporali all'interno di questo modello possono variare da settimane a mesi e l'innesto di successo richiede strutture e attrezzature adeguate per eseguire questi interventi chirurgici. Tuttavia, il modello di xenotrapianto fornisce un contesto biologico e fisiologico agli esperimenti, mentre i sistemi di coltura organoide, come gli espianti di tessuto, spesso richiedono la replica di una miriade di parti mobili, come i segnali esogeni, a specifici intervalli di tempo7. Pertanto, questo modello è meglio utilizzato per convalidare ulteriormente i risultati osservati in vitro e all'interno di modelli murini, o per lavori che non sono altrimenti biologicamente fattibili. L'uso appropriato del modello di xenotrapianto offre un'opportunità unica per studiare e manipolare il tessuto umano intatto in vivo.
L'ottimizzazione del modello di trapianto di pelle di xenotrapianto si è basata su decenni di ricerca per preservare l'integrità dell'innesto nel tempo. Fondamentale per questo processo è l'utilizzo del topo del recettore della catena gamma (NSG) del diabete non obeso (NOD)-scid, che manca di cellule immunitarie adattative B e T, cellule NK funzionali e ha carenze nei macrofagi e nelle cellule dendritiche8. La natura immunodeficiente di questi ospiti NSG consente il trapianto di cellule ematopoietiche umane, tumori derivati dal paziente e pelle 8,9,10. Nonostante questo ambiente ospite immunosoppressivo, è necessaria un'ulteriore soppressione delle risposte immunitarie neutrofile del topo mediante somministrazione di anti-GR1 per il successo del trapianto10. I principali ostacoli nel trapianto di tessuto intatto sono l'infezione, il rigetto e la difficoltà di ristabilire il flusso sanguigno all'innesto, che a volte porta alla perdita dell'integrità dermica ed epidermica11. Le tecniche che includono la somministrazione di anti-FR1 e l'uso di un'appropriata profondità di innesto migliorano la sopravvivenza del trapianto10. L'ottimizzazione meticolosa consente di eseguire trapianti di pelle di xenotrapianto umano su topi NSG con alti tassi di efficienza e sopravvivenza, compresi tra il 90% e il 100%.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>surgical glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>56-0451-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GR1 clone RB6-8C5</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0075</td>
			<td>Anti-rejection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC mouse anti-human CD25&#160; (Clone 2A3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340939</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-9956-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave pouches</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>89140-800</td>
			<td>For autoclaving tools and paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317438</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301042</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317328</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex 0.3 mg/mL</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>059122</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NADA # 141-199</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4188</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D42 Dermatome blade</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>5.D42BL10</td>
			<td>dermatome (1 blade per sample)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermatome D42</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>4.D42</td>
			<td>dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371610</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-10915-03</td>
			<td>To pin skin specimen for dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>medicon</td>
			<td>02.04.10</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5521-00</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4776-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric clippers</td>
			<td>Kent</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765040</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Hematoxylin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765015</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 (Clone HI30)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0459-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>medicon</td>
			<td>07.60.07</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Morganville Scientific</td>
			<td>HL0100</td>
			<td>Post-surgical care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads 4&#34; x 10&#34;</td>
			<td>Pristech</td>
			<td>20415</td>
			<td>Surgical heat supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin 1cc 12.7 mm syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329410</td>
			<td>drug administration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>United States Pharmacopeia (USP)&#160;</td>
			<td>NDC 66794-013-25</td>
			<td>Anesthesia&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>911103</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair for Men</td>
			<td>Nair</td>
			<td>&#8206; 10022600588556</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>&#160;NDC 17478-235-35</td>
			<td>eye ointment to prevent drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Kleenex</td>
			<td>100848</td>
			<td>May be autoclaved for sterile surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td>Semitransparent sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557938</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561283</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-1529-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer 10x</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305-654</td>
			<td>Site preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-Iodine Swab stick</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S41350</td>
			<td>Site sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)</td>
			<td>Se Lab Group Inc</td>
			<td>NC9066511&#160;</td>
			<td>For supplementing poorly recovering mice post-surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Collection Cups</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-150-266</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile alcohol prep pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Media for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-02</td>
			<td>For drug dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Film 4&#8221; x 43/4&#8221;&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1626</td>
			<td>transparent film wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline Petrolatum Gauze 3&#8221; x 8&#8221;&#160;</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>414600</td>
			<td>wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet 510 Ghost Dye&#160;</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Viability dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo

Il modello di xenotrapianto di pelle umana, in cui la pelle di un donatore umano viene trapiantata su un ospite di topo immunodeficiente, è un'opzione importante per la ricerca traslazionale in immunologia cutanea. La pelle murina e umana differiscono sostanzialmente nell'anatomia e nella composizione delle cellule immunitarie. Pertanto, i modelli murini tradizionali hanno limitazioni per la ricerca dermatologica e la scoperta di farmaci. Tuttavia, gli xenotrapianti di successo sono tecnicamente impegnativi e richiedono una preparazione ottimale del campione e del sito di innesto di topo per la sopravvivenza dell'innesto e dell'ospite. Il presente protocollo fornisce una tecnica ottimizzata per il trapianto di pelle umana sui topi e discute le considerazioni necessarie per gli obiettivi sperimentali a valle. Questo rapporto descrive la preparazione appropriata di un campione di pelle di donatore umano, l'assemblaggio di una configurazione chirurgica, la preparazione del topo e del sito chirurgico, il trapianto di pelle e il monitoraggio post-chirurgico. L'aderenza a questi metodi consente il mantenimento degli xenotrapianti per oltre 6 settimane dopo l'intervento. Le tecniche descritte di seguito consentono la massima efficienza dell'innesto grazie allo sviluppo di controlli ingegneristici, tecniche sterili e condizionamento pre e post-chirurgico. L'esecuzione appropriata del modello di xenotrapianto si traduce in campioni di innesto di pelle umana di lunga durata per la caratterizzazione sperimentale della pelle umana e test preclinici di composti in vivo.

Gli xenotrapianti di pelle umana sono stati eseguiti su topi NSG all'interno di una struttura animale super-barriera. Il successo è stato definito dalla prolungata sopravvivenza del trapianto e del topo e dalla salute comportamentale dei topi post-trapianto. La scarsa sopravvivenza durante la settimana successiva all'intervento chirurgico è stata inizialmente osservata come la più grande barriera al successo sperimentale, con fino al 50% dei topi che richiedono l'eutanasia. Il miglioramento della tecnica sterile e un ...

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Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

Il presente protocollo descrive come innestare la pelle umana su topi del recettore della catena gamma (NSG) diabetici non obesi (NOD)-scid. Una descrizione dettagliata della preparazione della pelle umana per il trapianto, la preparazione di topi per il trapianto, il trapianto di pelle umana a spessore diviso e la procedura di recupero post-trapianto sono inclusi nella relazione.

Modello cutaneo di xenotrapianto per manipolare le risposte immunitarie umane in vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

Descriviamo le tecniche necessarie per il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto umano, uno strumento importante per la manipolazione di percorsi immunitari e non immunitari nei tessuti umani in vivo. Questa tecnica ricapitola meglio la fisiologia della pelle umana rispetto ai metodi in vitro, consentendo la manipolazione sperimentale preclinica in vivo. I trapianti cutanei di xenotrapianto possono essere utilizzati per test preclinici di composti mirati all'infiammazione della pelle umana in vivo.Il bendaggio dei topi può essere particolarmente impegnativo, quindi consigliamo di praticare il processo di bendaggio su topi sani anestetizzati prima di eseguire interventi chirurgici. Per iniziare, preparare a dermatomare il campione di pelle umana in un cappuccio di coltura tissutale sterilizzato a pressione negativa su un pannello di dissezione sterilizzato. Posizionare il campione di pelle con l'epidermide rivolta verso l'alto sulla scheda di dissezione e pulire l'epidermide con un tampone sterile per la preparazione all'alcool seguito da PBS.Ora usa un perno a T da 1,5 pollici per fissare il bordo più vicino della pelle. Quindi dermatoma il campione di pelle a 400 micrometri di spessore e applicare una pressione costante mentre si taglia in avanti con un angolo di 30-45 gradi. Posizionare una garza sterile imbevuta di PBS sterile sul fondo della piastra di Petri e posizionare la pelle con l'epidermide rivolta verso l'alto sulla garza bagnata.Sigillare e coprire i bordi della piastra con una pellicola sigillante semitrasparente per garantire che il campione non sia contaminato e conservare il campione a quattro gradi Celsius prima dell'innesto. Preparare gli strumenti sterili e la stazione chirurgica per l'innesto e utilizzare asciugamani di carta autoclavati come superfici sterili per il posizionamento di strumenti e mouse. Dopo l'induzione dell'anestesia, trasferire il mouse su una piastra riscaldante o un'altra fonte di calore e somministrare l'unguento oftalmico tamponando una piccola goccia di unguento sull'occhio con un dito guantato.Pizzicare la pelle e iniettare analgesici per via sottocutanea con un angolo parallelo al corpo. Dopo aver sollevato il topo per la coda, esporre l'addome e iniettare 100 microgrammi per 100 microlitri di anti-Gr1 per via intraperitoneale con un angolo di 30 gradi utilizzando una siringa da insulina da un millilitro. Quindi utilizzare tagliatrici elettriche sicure per animali per radere le porzioni centrale e superiore del lato dorsale del mouse.Dopo aver eliminato tutti i peli, applicare una generosa quantità di unguento depilatorio sulla pelle rasata. Attendere da 30 secondi a un minuto, quindi pulire completamente l'unguento depilatorio con un tovagliolo di carta e PBS. Dopo aver trasferito il mouse alla stazione chirurgica, sterilizzare l'area chirurgica e posizionare un involucro di plastica sterile sul mouse.Tagliare una finestra nella plastica leggermente più grande della dimensione dell'area da innestare. Tenere la pelle del donatore saldamente in posizione con la pinza posteriore e tagliare una porzione rettangolare sagomata di 10 per 10 millimetri della pelle del donatore da innestare accanto alla pinza con un bisturi. Tirare la pelle lontano dal corpo per evitare di tagliare profondamente la fascia.Per creare un letto di innesto, tagliare un'area rettangolare di pelle di topo corrispondente alle dimensioni del pezzo di pelle del donatore. Quindi posizionare il pezzo di pelle del donatore con il lato dell'epidermide verso l'alto sul letto di innesto preparato. Utilizzando la parte posteriore della pinza, manipolare la pelle scivolando avanti e indietro fino a quando la pelle del donatore si trova completamente piatta contro il letto di innesto.Aggiungere gocce adesive per tessuti di colla chirurgica dove la pelle del donatore incontra la pelle del topo e tenere la pelle del topo e del donatore insieme con una pinza per uno o due secondi in modo che la colla aderisca ai tessuti. Sigillare completamente il bordo dell'innesto e lasciare asciugare accuratamente la colla. Quindi, tagliare una garza di petrolato abbastanza grande da coprire completamente l'area dell'innesto.Coprire l'innesto con la garza di petrolato e premere leggermente la garza contro la pelle usando una pinza. Tagliare una striscia di una pellicola trasparente medicata longitudinalmente in modo che la larghezza sia abbastanza grande da coprire la ferita del topo. Premere con decisione la medicazione trasparente con il lato adesivo verso il basso sulla garza.Ruota rapidamente il mouse per avvolgere completamente la medicazione attorno al busto, assicurandoti che si adatti perfettamente senza ostacolare la respirazione e che tutti gli arti siano liberi di movimento. Dopo aver posizionato il mouse in una gabbia di recupero, monitoralo fino a quando non è vigile e si muove. Fornire una fonte di calore sulla parte della gabbia per almeno 15 minuti dopo il recupero.L'analisi degli innesti da 10 a 21 giorni dopo il trapianto ha mostrato che l'innesto è rimasto aderente attorno ai bordi in cui la pelle del donatore incontra la pelle del topo e l'innesto è rimasto più spesso e più infiammato della pelle umana sana. L'analisi mediante citometria a flusso ha rivelato la presenza sostenuta di cellule immunitarie umane nella maggior parte degli innesti, ma la conta variava tra gli xenotrapianti. L'innesto di successo ha mantenuto le cellule immunitarie umane.Tuttavia, nonostante la continua aderenza e sopravvivenza del tessuto donatore, gli innesti che non sono riusciti a mantenere le cellule immunitarie umane sono considerati infruttuosi. L'analisi delle sezioni colorate con ematossilina ed eosina dell'innesto dopo 35 giorni ha mostrato epidermide intatta e il derma è moderatamente cellulare composto da fibroblasti ovali paffuti con citoplasma sinciziale pallido e linfociti sparsi. L'analisi dell'innesto dopo 50 giorni ha mostrato risultati simili con epidermide intatta e il derma contenente fibroblasti ovali e deposizione di matrice extracellulare leggermente migliorata.Gli xenotrapianti cutanei di successo si basano su un'appropriata preparazione di campioni di pelle, sulla soppressione delle risposte immunitarie neutrofile del topo mediante somministrazione anti-Gr1, sull'aderenza ai metodi di chirurgia asettica dei roditori e sul bendaggio sicuro dei topi. Il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto umano consente ai ricercatori di studiare le risposte immunitarie umane nell'organo intatto in vivo, fornendo una nuova strada per la ricerca traslazionale.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

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Un modello ortotopico di carcinoma ovarico sieroso in topi immunocompetenti per In vivo Tumore Imaging e monitoraggio del tumore Risposte immunitarie

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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