Name: xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo
Uploaded: 2022-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis finansiert av sponsede forskningsavtaler fra TRex Bio og tilskudd fra NIH (1R01AR075864-01A1). JMM er støttet av Kreftforskningsforeningen (bevilgning 26005). Vi anerkjenner Parnassus Flow Cytometry Core støttet delvis av tilskuddene NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 og S10 1S10OD018040-01.

Denne studien ble godkjent og utført i samsvar med UCSF IACUC (AN191105-01H) og IRB (13-11307) protokoller. Hudprøver, kassert som en del av rutinemessige elektive kirurgiske prosedyrer, som brokkreparasjon, ble brukt til denne forskningen. Hudprøvene er enten avidentifisert og sertifisert som Not Human Subjects Research eller, hvis klinisk identifiserende informasjon er nødvendig for nedstrømsanalyser, har pasienter gitt skriftlig samtykke i henhold til IRB-protokoll 13-11307. Ingen andre inklusjons- eller eksklusj...

<ol>
	<li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wound+healing+in+humans+and+mice:+Challenges+in+translational+research.">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).</li><li>Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+approaches+to+create+murine+models+of+human+wound+healing.">Surgical approaches to create murine models of human wound healing.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2011, 969618 (2011).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+skin+immunity+and+inflammation.">Mechanisms regulating skin immunity and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).</li><li>Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+skin+organoids:+potential+opportunities+and+challenges.">Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).</li><li>Crist&#243;bal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+human+skin+transplantation:+a+systematic+review.">Mouse models for human skin transplantation: a systematic review.</a> Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/&#947;cnull+mouse:+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/&#947;cnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Meraz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+patient-derived+xenograft+humanized+mouse+model+for+evaluation+of+lung+cancer+immune+responses.">An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses.</a> Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).</li><li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD-scid+IL2rgamma(null)+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection.">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li><li>Meehan, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+xenograft+model+of+human+vasculature+in+the+mouse+ear+pinna.">Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).</li><li>Gokkaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+graft+storage+in+platelet+rich+plasma+(PRP).">Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP).</a> Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).</li><li>. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA">https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA</a> (2021)</li><li>Rodriguez, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+regulatory+T+cells+reside+in+human+skin.">Memory regulatory T cells reside in human skin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).</li><li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+rodent+aseptic+surgery.">Techniques in rodent aseptic surgery.</a> Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).</li><li>Karim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ischemia+and+neovascularization+in+a+murine+model+of+full+thickness+human+wound+healing.">Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2R&#947;null+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2R&#947;null mice display a T-effector memory phenotype.</a> PloS One. 7 (8), 44219 (2012).</li><li>Souci, L., Denesvre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+skin+models+in+domestic+animals.">3D skin models in domestic animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).</li><li>Holtkamp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+guide+dendritic+cells+into+skin+lymphatics.">Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics.</a> Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).</li></ol>

Mus xenograft hudtransplantasjonsmodell er en nøkkelteknikk for mekanistisk dissekering av menneskelige hudimmunresponser i en in vivo-innstilling 14. Vellykkede hud xenograft transplantasjoner stole på riktig forberedelse av mus og hudprøver og mus og overholdelse av aseptiske gnagere kirurgi metoder15. Rask nedkjøling og riktig lagring av hudprøver ved kalde temperaturer i medier (for eksempel steril saltvann) er viktig for å sikre fortsatt vevshelse før t...

Musemodeller brukes ofte til å gjøre slutninger om menneskelig biologi og sykdom, delvis på grunn av deres eksperimentelle reproduserbarhet og kapasitet for genetisk manipulasjon. Musefysiologi rekapitulerer imidlertid ikke humane organsystemer fullstendig, spesielt hud, og har derfor begrensninger for bruk som preklinisk modell i legemiddelutvikling1. Anatomiske forskjeller mellom mus og menneskelig hud inkluderer forskjeller i epiteltykkelser og arkitektur, mangel på murine ekkrine svettekjertler og variasjoner i hårsykling2. Videre er både immunsystemets medfødte og adaptive armer divergerende mellom de to artene3. Mushud inneholder en unik immunpopulasjon av dendritiske epidermale T-celler (DETCs), har en høyere overflod av dermale γδ T-celler, og varierer i immuncelleundergruppelokalisering sammenlignet med humant vev4. Derfor har eksperimentelle funn angående menneskelig hudbiologi og betennelse nytte av validering med menneskelig vev. Mens in vitro og organoide kultursystemer er mye brukt verktøy for å studere menneskelig vev, er disse systemene begrenset av fraværende eller ufullstendig immunrekonstituering og mangel på forbindelse til perifer vaskulatur5. Den humaniserte xenograft hudtransplantasjonsmodellen tar sikte på å tillate terapeutisk eller biologisk manipulering av immun- og ikke-immunveier i humant vev in vivo.
Den menneskelige hud xenograft-modellen har blitt brukt til å studere hudfysiologi og farmakologi, analysere immunavvisning og responser, dissekere menneskelige hudkreftmekanismer og forstå hudsykdommer og sårheling6. Selv om den gjelder for flere felt av hudforskning, har xenograft-modellen lavere gjennomstrømning enn in vitro-studier og mangler den enkle genetiske manipulasjonen som brukes i musemodeller. Tidspunkter innenfor denne modellen kan variere fra uker til måneder, og vellykket poding krever passende fasiliteter og utstyr for å utføre disse operasjonene. Xenograft-modellen leverer imidlertid biologisk og fysiologisk kontekst til eksperimenter, mens organoide kultursystemer, som vevseksplanter, ofte krever replikering av et mylder av bevegelige deler, for eksempel eksogene signaler, med bestemte tidsintervaller7. Derfor er denne modellen best utnyttet for ytterligere å validere funn observert in vitro og i musemodeller, eller for arbeid som ellers ikke er biologisk mulig. Hensiktsmessig bruk av xenograftmodellen gir en unik mulighet til å studere og manipulere intakt humant vev in vivo.
Optimalisering av xenograft hudtransplantasjonsmodellen har stolt på flere tiår med forskning for å bevare transplantatintegritet over tid. Kritisk for denne prosessen er å bruke ikke-overvektige diabetiker (NOD) -scid interleukin-2 gammakjedereseptor (NSG) mus, som mangler B- og T-adaptive immunceller, funksjonelle NK-celler, og har mangler i makrofag og dendrittiske celler8. Den immunsviktende naturen til disse NSG-vertene tillater transplantasjon av humane hematopoietiske celler, pasientavledede kreftformer og hud 8,9,10. Til tross for dette immunsuppressive vertsmiljøet er ytterligere undertrykkelse av muse-nøytrofile immunresponser ved anti-GR1-administrering nødvendig for transplantatsuksess10. De viktigste hindringene i transplantasjon av intakt vev er infeksjon, avvisning og vanskeligheter med å gjenopprette blodstrømmen til transplantatet, noe som noen ganger fører til tap av dermal og epidermal integritet11. Teknikker inkludert administrering av anti-FR1 og bruk av passende transplantatdybde forbedrer transplantatoverlevelse10. Grundig optimalisering gjør det mulig å utføre humane xenograft hudtransplantasjoner på NSG-mus med høy effektivitet og overlevelse, fra 90% -100%.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>surgical glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>56-0451-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GR1 clone RB6-8C5</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0075</td>
			<td>Anti-rejection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC mouse anti-human CD25&#160; (Clone 2A3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340939</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-9956-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave pouches</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>89140-800</td>
			<td>For autoclaving tools and paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317438</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301042</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317328</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex 0.3 mg/mL</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>059122</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NADA # 141-199</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4188</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D42 Dermatome blade</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>5.D42BL10</td>
			<td>dermatome (1 blade per sample)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermatome D42</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>4.D42</td>
			<td>dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371610</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-10915-03</td>
			<td>To pin skin specimen for dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>medicon</td>
			<td>02.04.10</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5521-00</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4776-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric clippers</td>
			<td>Kent</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765040</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Hematoxylin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765015</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 (Clone HI30)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0459-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>medicon</td>
			<td>07.60.07</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Morganville Scientific</td>
			<td>HL0100</td>
			<td>Post-surgical care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads 4&#34; x 10&#34;</td>
			<td>Pristech</td>
			<td>20415</td>
			<td>Surgical heat supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin 1cc 12.7 mm syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329410</td>
			<td>drug administration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>United States Pharmacopeia (USP)&#160;</td>
			<td>NDC 66794-013-25</td>
			<td>Anesthesia&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>911103</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair for Men</td>
			<td>Nair</td>
			<td>&#8206; 10022600588556</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>&#160;NDC 17478-235-35</td>
			<td>eye ointment to prevent drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Kleenex</td>
			<td>100848</td>
			<td>May be autoclaved for sterile surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td>Semitransparent sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557938</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561283</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-1529-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer 10x</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305-654</td>
			<td>Site preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-Iodine Swab stick</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S41350</td>
			<td>Site sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)</td>
			<td>Se Lab Group Inc</td>
			<td>NC9066511&#160;</td>
			<td>For supplementing poorly recovering mice post-surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Collection Cups</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-150-266</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile alcohol prep pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Media for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-02</td>
			<td>For drug dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Film 4&#8221; x 43/4&#8221;&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1626</td>
			<td>transparent film wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline Petrolatum Gauze 3&#8221; x 8&#8221;&#160;</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>414600</td>
			<td>wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet 510 Ghost Dye&#160;</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Viability dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo

Den humane hud xenograftmodellen, der human donorhud transplanteres på en immundefekt musevert, er et viktig alternativ for translasjonsforskning innen hudimmunologi. Murine og menneskelig hud varierer vesentlig i anatomi og immuncellesammensetning. Derfor har tradisjonelle musemodeller begrensninger for dermatologisk forskning og narkotikaforskning. Imidlertid er vellykkede xenotransplantasjoner teknisk utfordrende og krever optimal prøve- og musetransplantasjonsstedforberedelse for transplantat- og vertsoverlevelse. Den nåværende protokollen gir en optimalisert teknikk for å transplantere menneskelig hud på mus og diskuterer nødvendige hensyn for nedstrøms eksperimentelle mål. Denne rapporten beskriver riktig forberedelse av en hudprøve fra en menneskelig donor, montering av et kirurgisk oppsett, forberedelse av mus og operasjonssted, hudtransplantasjon og overvåking etter kirurgi. Overholdelse av disse metodene muliggjør vedlikehold av xenotransplantater i over 6 uker etter operasjonen. Teknikkene som er skissert nedenfor tillater maksimal podeeffektivitet på grunn av utvikling av tekniske kontroller, steril teknikk og pre- og postkirurgisk kondisjonering. Passende utførelse av xenograftmodellen resulterer i langlivede humane hudtransplantatprøver for eksperimentell karakterisering av human hud og preklinisk testing av forbindelser in vivo.

Xenotransplantater fra human hud ble utført på NSG-mus inne i et superbarriereanlegg for dyr. Suksess ble definert av den langvarige transplantat- og museoverlevelsen og atferdshelsen til mus etter transplantasjon. Dårlig overlevelse i løpet av uken etter operasjonen ble opprinnelig observert som den største barrieren for eksperimentell suksess, med opptil 50% av musene som krever eutanasi. Forbedring av steril teknikk og bedre støtte av musens kroppstemperatur under og umiddelbart etter operasjonen økte kirurgisk...

Watch this Scientific Journal Video about Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo at JoVE.com

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

Den nåværende protokollen beskriver hvordan man poder menneskelig hud på ikke-overvektige diabetiske (NOD) -scid interleukin-2 gammakjedereseptor (NSG) mus. En detaljert beskrivelse av preparatet av menneskelig hud for transplantasjon, forberedelse av mus for transplantasjon, transplantasjon av menneskelig hud med delt tykkelse og gjenopprettingsprosedyre etter transplantasjon er inkludert i rapporten.

Xenograft hudmodell for å manipulere menneskelige immunresponser in vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

Vi skisserer teknikker som er nødvendige for den humane xenograft hudtransplantasjonsmodellen, et viktig verktøy for manipulering av immun- og ikke-immunveier i humant vev in vivo. Denne teknikken rekapitulerer bedre menneskelig hudfysiologi enn in vitro-metoder, noe som muliggjør preklinisk eksperimentell manipulasjon in vivo. Xenograft hudtransplantasjoner kan brukes til preklinisk testing av forbindelser rettet mot menneskelig hudbetennelse in vivo.Bandasjering av mus kan være spesielt utfordrende, så vi vil anbefale å øve bandasjeringsprosessen på sunne bedøvede mus før du utfører operasjoner. For å begynne, forberede seg på å dermatome den menneskelige hudprøven i en sterilisert undertrykksvevskulturhette på et sterilisert disseksjonsbrett. Plasser hudprøven med epidermis side opp på disseksjonstavlen og tørk epidermis med en steril alkohol prep pad etterfulgt av PBS.Bruk nå en 1,5 tommers dissekerende T-pin for å fikse den nærmere kanten av huden. Deretter dermatom hudprøven ved 400 mikrometer tykkelse og påfør jevnt trykk mens du skjærer fremover i en vinkel på 30 til 45 grader. Plasser en steril gasbind gjennomvåt i steril PBS i bunnen av petriskålen og legg huden med epidermissiden opp på det våte gasbindet.Forsegl og dekk platekantene med en halvtransparent tetningsfilm for å sikre at prøven ikke er forurenset, og oppbevar prøven ved fire grader Celsius før poding. Forbered de sterile instrumentene og kirurgisk stasjon for podning og bruk autoklaverte papirhåndklær som sterile overflater for plassering av instrument og mus. Etter anestesiinduksjon, overfør musen til en varmepute eller en annen varmekilde og administrer oftalmisk salve ved å dabbe en liten dråpe salve på øyet med en hansket finger.Klyp huden og injiser analgetika subkutant i en vinkel parallelt med kroppen. Etter å ha løftet musen ved halen, utsett magen og injiser 100 mikrogram per 100 mikroliter anti-Gr1 intraperitonealt i en 30 graders vinkel ved bruk av en milliliter insulinsprøyte. Bruk deretter dyresikre elektriske klippere til å barbere de midtre og øvre delene av den dorsale siden av musen.Etter å ha ryddet alle hårene, påfør en sjenerøs mengde hårfjerningssalve på den barberte huden. Vent i 30 sekunder til ett minutt, og tørk deretter hårfjerningssalven helt med et papirhåndkle og PBS. Etter å ha overført musen til kirurgisk stasjon, steriliser det kirurgiske området og legg en steril plastfolie over musen.Klipp et vindu i plasten litt større enn størrelsen på området som skal podes. Hold donorskinnet godt på plass med tangens bakside og skjær et rektangel formet 10 x 10 millimeter del av donorhuden som skal podes sammen med tangen med en skalpell. Trekk huden bort fra kroppen for å unngå å kutte dypt inn i fascia.For å lage en transplantatseng, klipp et rektangulært område av musehud som samsvarer med størrelsen på donorhudstykket. Legg deretter donorhudstykket med epidermissiden opp på den forberedte transplantatsengen. Bruk baksiden av tangen til å manipulere huden som glir frem og tilbake til donorhuden ligger helt flatt mot transplantatsengen.Legg kirurgisk limvev lim dråper der donorhuden møter musehuden og hold musen og donorhuden sammen med tang i ett til to sekunder slik at limet fester seg til vevet. Forsegl transplantatets kant helt og la limet tørke grundig. Deretter kutter petrolatum gasbind stor nok til å dekke graftområdet helt.Dekk transplantatet med petrolatumgassen og trykk gasbindet lett mot huden ved hjelp av tang. Klipp en stripe av en gjennomsiktig film dressing på langs slik at bredden er stor nok til å dekke musens sår. Trykk godt på den gjennomsiktige filmdressingen med limsiden ned over gasbindet.Rull musen raskt for å vikle bandasjen helt rundt overkroppen, slik at den passer tett uten å hindre respirasjon og alle lemmer er fri for bevegelse. Etter å ha plassert musen i et gjenopprettingsbur, må du overvåke den til den er våken og bevege seg rundt. Gi en varmekilde fra burets side i minst 15 minutter etter utvinning.Analyse av transplantater 10 til 21 dager etter transplantasjonen viste at transplantatet forble festet rundt kantene der donorens hud møter musens hud og transplantatet forble tykkere og mer betent enn sunn menneskelig hud. Analyse ved flowcytometri viste vedvarende tilstedeværelse av humane immunceller i de fleste transplantater, men tellingene varierte mellom xenotransplantater. Det vellykkede transplantatet opprettholdt de menneskelige immuncellene.Til tross for fortsatt etterlevelse og overlevelse av donorvev, anses transplantater som ikke klarte å opprettholde de humane immuncellene som mislykket. Analyse av hematoksylin- og eosinfargede seksjoner av transplantatet etter 35 dager viste intakt epidermis og dermis er moderat cellulær sammensatt av klumpete ovale fibroblaster med blek syncytial cytoplasma og spredte lymfocytter. Analyse av transplantatet etter 50 dager viste lignende resultater med intakt epidermis og dermis som inneholdt ovale fibroblaster og litt forbedret ekstracellulær matriksavsetning.Vellykkede hud xenografts stole på riktig forberedelse av hudprøver, undertrykkelse av mus nøytrofile immunresponser ved anti-Gr1 administrasjon, overholdelse av aseptiske gnagere kirurgi metoder, og sikker bandasjering av mus. Den humane xenograft-hudtransplantasjonsmodellen gjør det mulig for forskere å studere menneskelige immunresponser i det intakte organet in vivo, noe som gir en ny vei for translasjonsforskning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantasjon av Tail Skin Study Cell Responses Allogen CD4 T i Mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyttisolasjonsmetoder fra menneskelig hud for fenotypeanalyser og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell for måling av immunresponser mot Malaria i sammenheng med HIV Samtidig infeksjon

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Ved hjelp av sebrafisk modeller av menneskelig influensa A virus infeksjoner til skjerm antivirale medikamenter og karakter vertens immuncellere

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

En suge blemme protokoll å studere Human T-celle tilbakekalling svar i Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...