Name: xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo
Uploaded: 2022-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo at JoVE.com

Эта работа частично финансировалась за счет спонсируемых исследовательских соглашений от TRex Bio и грантов от NIH (1R01AR075864-01A1). JMM поддерживается Обществом исследований рака (грант 26005). Мы признаем, что парнасское проточное цитометрическое ядро частично поддерживается грантами NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 и S10 1S10OD018040-01.

Настоящее исследование было одобрено и выполнено в соответствии с протоколами UCSF IACUC (AN191105-01H) и IRB (13-11307). Образцы кожи, выброшенные в рамках обычных плановых хирургических процедур, таких как грыжесечение, были использованы для настоящего исследования. Образцы кожи либо деидентифициро?...

<ol>
	<li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wound+healing+in+humans+and+mice:+Challenges+in+translational+research.">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).</li><li>Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+approaches+to+create+murine+models+of+human+wound+healing.">Surgical approaches to create murine models of human wound healing.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2011, 969618 (2011).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+skin+immunity+and+inflammation.">Mechanisms regulating skin immunity and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).</li><li>Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+skin+organoids:+potential+opportunities+and+challenges.">Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).</li><li>Crist&#243;bal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+human+skin+transplantation:+a+systematic+review.">Mouse models for human skin transplantation: a systematic review.</a> Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/&#947;cnull+mouse:+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/&#947;cnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Meraz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+patient-derived+xenograft+humanized+mouse+model+for+evaluation+of+lung+cancer+immune+responses.">An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses.</a> Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).</li><li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD-scid+IL2rgamma(null)+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection.">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li><li>Meehan, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+xenograft+model+of+human+vasculature+in+the+mouse+ear+pinna.">Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).</li><li>Gokkaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+graft+storage+in+platelet+rich+plasma+(PRP).">Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP).</a> Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).</li><li>. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA">https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA</a> (2021)</li><li>Rodriguez, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+regulatory+T+cells+reside+in+human+skin.">Memory regulatory T cells reside in human skin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).</li><li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+rodent+aseptic+surgery.">Techniques in rodent aseptic surgery.</a> Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).</li><li>Karim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ischemia+and+neovascularization+in+a+murine+model+of+full+thickness+human+wound+healing.">Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2R&#947;null+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2R&#947;null mice display a T-effector memory phenotype.</a> PloS One. 7 (8), 44219 (2012).</li><li>Souci, L., Denesvre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+skin+models+in+domestic+animals.">3D skin models in domestic animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).</li><li>Holtkamp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+guide+dendritic+cells+into+skin+lymphatics.">Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics.</a> Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).</li></ol>

Модель пересадки кожи ксенотрансплантата мыши является ключевым методом механистического препарирования иммунных реакций кожи человека в условиях in vivo 14. Успешная трансплантация ксенотрансплантата кожи зависит от соответствующей подготовки мышей и образцов кожи ?...

Мышиные модели часто используются для того, чтобы делать выводы о биологии и болезнях человека, отчасти из-за их экспериментальной воспроизводимости и способности к генетическим манипуляциям. Однако физиология мышей не полностью повторяет системы органов человека, особенно кожи, и поэтому имеет ограничения для использования в качестве доклинической модели при разработке лекарств1. Анатомические различия между кожей мыши и человека включают различия в толщине и архитектуре эпителия, отсутствие мышиных эккриновых потовых желез и вариации в круговороте волос2. Кроме того, как врожденные, так и адаптивные ветви иммунной системы расходятся между двумя видами3. Кожа мыши содержит уникальную иммунную популяцию дендритных эпидермальных Т-клеток (DETC), имеет более высокое обилие дермальных γδ-Т-клеток и варьируется по локализации подмножества иммунных клеток по сравнению с тканями человека4. Таким образом, экспериментальные результаты, касающиеся биологии кожи человека и воспаления, выигрывают от проверки с человеческими тканями. В то время как системы культуры in vitro и органоидные культуры широко используются для изучения тканей человека, эти системы ограничены отсутствующим или неполным восстановлением иммунитета и отсутствием связи с периферической сосудистой системой5. Гуманизированная модель трансплантации кожи ксенотрансплантата направлена на то, чтобы позволить терапевтические или биологические манипуляции с иммунными и неиммунными путями в тканях человека in vivo.
Модель ксенотрансплантата кожи человека была использована для изучения физиологии и фармакологии кожи, анализа иммунного отторжения и реакций, анализа механизмов рака кожи человека и понимания кожных заболеваний и заживления ран6. Хотя модель ксенотрансплантата применима к нескольким областям исследований кожи, она имеет более низкую пропускную способность, чем исследования in vitro , и ей не хватает простоты генетических манипуляций, используемых в мышиных моделях. Временные точки в этой модели могут варьироваться от недель до месяцев, и для успешной трансплантации требуются соответствующие средства и оборудование для выполнения этих операций. Тем не менее, модель ксенотрансплантата обеспечивает биологический и физиологический контекст для экспериментов, в то время как системы органоидных культур, такие как тканевые экспланты, часто требуют воспроизведения множества движущихся частей, таких как экзогенные сигналы, через определенные промежутки времени7. Поэтому эту модель лучше всего использовать для дальнейшей проверки результатов, наблюдаемых in vitro и в мышиных моделях, или для работы, которая в противном случае биологически невозможна. Надлежащее использование модели ксенотрансплантата дает уникальную возможность изучать и манипулировать неповрежденными тканями человека in vivo.
Оптимизация модели пересадки кожи ксенотрансплантата опиралась на десятилетия исследований для сохранения целостности трансплантата с течением времени. Критически важным для этого процесса является использование мыши без ожирения диабетического (NOD)-scid интерлейкина-2 рецептора гамма-цепи (NSG), у которого отсутствуют B и T-адаптивные иммунные клетки, функциональные NK-клетки и недостатки в макрофагах и дендритных клетках8. Иммунодефицитная природа этих хозяев NSG позволяет трансплантировать человеческие кроветворные клетки, рак пациента и кожу 8,9,10. Несмотря на эту иммуносупрессивную среду хозяина, дополнительное подавление нейтрофильных иммунных реакций мышей путем введения анти-GR1 необходимо для успеха трансплантата10. Основными препятствиями при пересадке неповрежденной ткани являются инфекция, отторжение и трудности с восстановлением притока крови к трансплантату, иногда приводящие к потере кожной и эпидермальной целостности11. Методы, включая введение анти-FR1 и использование соответствующей глубины трансплантата, улучшают выживаемость трансплантата10. Тщательная оптимизация позволяет выполнять пересадку кожи ксенотрансплантата человека на мышах NSG с высокой эффективностью и выживаемостью, в пределах 90%-100%.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>surgical glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>56-0451-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GR1 clone RB6-8C5</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0075</td>
			<td>Anti-rejection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC mouse anti-human CD25&#160; (Clone 2A3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340939</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-9956-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave pouches</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>89140-800</td>
			<td>For autoclaving tools and paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317438</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301042</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317328</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex 0.3 mg/mL</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>059122</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NADA # 141-199</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4188</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D42 Dermatome blade</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>5.D42BL10</td>
			<td>dermatome (1 blade per sample)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermatome D42</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>4.D42</td>
			<td>dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371610</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-10915-03</td>
			<td>To pin skin specimen for dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>medicon</td>
			<td>02.04.10</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5521-00</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4776-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric clippers</td>
			<td>Kent</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765040</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Hematoxylin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765015</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 (Clone HI30)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0459-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>medicon</td>
			<td>07.60.07</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Morganville Scientific</td>
			<td>HL0100</td>
			<td>Post-surgical care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads 4&#34; x 10&#34;</td>
			<td>Pristech</td>
			<td>20415</td>
			<td>Surgical heat supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin 1cc 12.7 mm syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329410</td>
			<td>drug administration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>United States Pharmacopeia (USP)&#160;</td>
			<td>NDC 66794-013-25</td>
			<td>Anesthesia&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>911103</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair for Men</td>
			<td>Nair</td>
			<td>&#8206; 10022600588556</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>&#160;NDC 17478-235-35</td>
			<td>eye ointment to prevent drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Kleenex</td>
			<td>100848</td>
			<td>May be autoclaved for sterile surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td>Semitransparent sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557938</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561283</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-1529-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer 10x</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305-654</td>
			<td>Site preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-Iodine Swab stick</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S41350</td>
			<td>Site sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)</td>
			<td>Se Lab Group Inc</td>
			<td>NC9066511&#160;</td>
			<td>For supplementing poorly recovering mice post-surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Collection Cups</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-150-266</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile alcohol prep pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Media for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-02</td>
			<td>For drug dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Film 4&#8221; x 43/4&#8221;&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1626</td>
			<td>transparent film wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline Petrolatum Gauze 3&#8221; x 8&#8221;&#160;</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>414600</td>
			<td>wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet 510 Ghost Dye&#160;</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Viability dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo

Модель ксенотрансплантата кожи человека, в которой донорская кожа человека пересаживается иммунодефицитному мышиному хозяину, является важным вариантом для трансляционных исследований в иммунологии кожи. Мышиная и человеческая кожа существенно различаются по анатомии и составу иммунных клеток. Поэтому традиционные мышиные модели имеют ограничения для дерматологических исследований и открытия лекарств. Тем не менее, успешные ксенотрансплантаты являются технически сложными и требуют оптимальной подготовки образца и участка трансплантата мыши для выживания трансплантата и хозяина. Настоящий протокол предоставляет оптимизированную технику для трансплантации кожи человека мышам и обсуждает необходимые соображения для последующих экспериментальных целей. В этом отчете описывается надлежащая подготовка образца кожи донора человека, сборка хирургической установки, подготовка мыши и хирургического участка, трансплантация кожи и послеоперационный мониторинг. Соблюдение этих методов позволяет поддерживать ксенотрансплантаты в течение более 6 недель после операции. Методы, описанные ниже, обеспечивают максимальную эффективность прививки благодаря разработке инженерных средств контроля, стерильной техники и пред- и послеоперационного кондиционирования. Соответствующая производительность модели ксенотрансплантата приводит к получению образцов долгоживущих трансплантатов кожи человека для экспериментальной характеристики кожи человека и доклинического тестирования соединений in vivo.

Ксенотрансплантаты человеческой кожи были выполнены на мышах NSG внутри супербарьерного животного объекта. Успех был определен длительным выживанием трансплантата и мыши и поведенческим здоровьем мышей после трансплантации. Плохая выживаемость в течение недели после операции первон...

Watch this Scientific Journal Video about Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo at JoVE.com

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

Настоящий протокол описывает, как трансплантировать кожу человека мышам, не страдающим ожирением диабетического (NOD)-scid интерлейкина-2 рецептора гамма-цепи (NSG). В отчет включено подробное описание подготовки кожи человека к пересадке, подготовки мышей к пересадке, трансплантации расщепленной кожи человека и процедуры посттрансплантационного восстановления.

Ксенотрансплантатная модель кожи для манипулирования иммунными реакциями человека In Vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

Мы описываем методы, необходимые для модели трансплантации кожи ксенотрансплантата человека, важного инструмента для манипулирования иммунными и неиммунными путями в тканях человека in vivo. Этот метод лучше повторяет физиологию кожи человека, чем методы in vitro, что позволяет проводить доклинические экспериментальные манипуляции in vivo. Пересадка кожи ксенотрансплантатом может быть использована для доклинического тестирования соединений, нацеленных на воспаление кожи человека in vivo.Перевязка мышей может быть особенно сложной задачей, поэтому мы бы посоветовали практиковать процесс перевязки на здоровых обезболенных мышах перед выполнением операций. Для начала подготовьте к дерматом образец кожи человека в стерилизованном вытяжке для культивирования тканей с отрицательным давлением на стерилизованной рассеченной доске. Поместите образец кожи с эпидермисом стороной вверх на рассеченную доску и протрите эпидермис стерильной прокладкой для приготовления спирта, а затем PBS.Теперь используйте 1,5-дюймовый рассекающий Т-образный штифт, чтобы зафиксировать более близкий край кожи. Затем дерматом обрабатывают кожу образца толщиной 400 микрометров и применяют устойчивое давление при разрезании вперед под углом от 30 до 45 градусов. Поместите стерильную марлю, смоченную в стерильном PBS, на дно чашки Петри и поместите кожу с эпидермисом стороной вверх на влажную марлю.Запечатайте и накройте края пластин полупрозрачной уплотнительной пленкой, чтобы убедиться, что образец не загрязнен, и храните образец при четырех градусах Цельсия перед прививкой. Подготовьте стерильные инструменты и хирургическую станцию к пересадке и используйте автоклавные бумажные полотенца в качестве стерильных поверхностей для размещения инструментов и мышей. После индукции анестезии перенесите мышь на грелку или другой источник тепла и введите офтальмологическую мазь, нанеся небольшую каплю мази на глаз пальцем в перчатке.Защемляют кожу и подкожно вводят анальгетики под углом, параллельным телу. Подняв мышь за хвост, обнажите брюшко и введите 100 мкг на 100 микролитров анти-Gr1 внутрибрюшинно под углом 30 градусов с помощью одного миллилитра инсулинового шприца. Затем используйте безопасные для животных электрические кусачки, чтобы побрить среднюю и верхнюю части спинной стороны мыши.После очистки всех волосков нанесите обильное количество мази для удаления волос на бритую кожу. Подождите от 30 секунд до одной минуты, затем полностью протрите мазь для удаления волос бумажным полотенцем и PBS. После переноса мыши на хирургическую станцию стерилизуйте хирургическую область и наденьте на мышь стерильную полиэтиленовую пленку.Вырежьте из пластика окно, немного превышающее размер участка, подлежащего прививке. Крепко удерживайте донорскую кожу на месте щипцами сзади и вырежьте прямоугольную часть донорской кожи в форме 10 на 10 миллиметров, которая будет пересажена вместе с щипцами скальпелем. Оттяните кожу от тела, чтобы избежать глубокого врезания в фасцию.Чтобы создать трансплантатную кровать, отрежьте прямоугольную область кожи мыши, соответствующую размеру куска кожи донора. Затем поместите донорский кусочек кожи эпидермисом стороной вверх на подготовленную ложе трансплантата. Используя заднюю часть щипцов, манипулируйте кожей, скользящей взад и вперед, пока донорская кожа не ляжет совершенно ровно на трансплантатную кровать.Добавьте хирургические клеевые тканевые адгезивные капли там, где донорская кожа встречается с кожей мыши, и удерживайте кожу мыши и донора вместе с щипцами в течение одной-двух секунд, чтобы клей прилип к тканям. Полностью запечатайте край трансплантата и дайте клею тщательно высохнуть. Далее нарежьте вазелиновую марлю, достаточно большую, чтобы полностью покрыть область трансплантата.Накройте трансплантат вазелиновой марлей и слегка прижмите марлю к коже с помощью щипцов. Вырежьте полоску прозрачной пленки, повязочной вдоль, чтобы ширина была достаточно большой, чтобы покрыть рану мыши. Плотно прижмите прозрачную пленочную повязку клеевой стороной вниз поверх марли.Быстро сверните мышь, чтобы полностью обернуть повязку вокруг туловища, гарантируя, что она плотно прилегает, не препятствуя дыханию, и все конечности свободны для движения. Поместив мышь в клетку восстановления, следите за ней, пока она не станет бдительной и не будет двигаться. Обеспечьте источник тепла со стороны клетки в течение не менее 15 минут после рекуперации.Анализ трансплантатов через 10-21 день после трансплантации показал, что трансплантат оставался прилипшим по краям, где кожа донора встречается с кожей мыши, а трансплантат оставался толще и более воспаленным, чем здоровая кожа человека. Анализ с помощью проточной цитометрии показал устойчивое присутствие иммунных клеток человека в большинстве трансплантатов, но количество варьировалось между ксенотрансплантатами. Успешный трансплантат поддерживал иммунные клетки человека.Однако, несмотря на продолжающуюся приверженность и выживание донорской ткани, трансплантаты, которые не смогли сохранить иммунные клетки человека, считаются неудачными. Анализ окрашенных гематоксилином и эозином участков трансплантата через 35 дней показал интактный эпидермис и дерму умеренно клеточную, состоящую из пухлых овальных фибробластов с бледной синцитиальной цитоплазмой и рассеянными лимфоцитами. Анализ трансплантата через 50 дней показал аналогичные результаты при интактном эпидермисе и дерме, содержащих овальные фибробласты и слегка усиленное отложение внеклеточного матрикса.Успешные ксенотрансплантаты кожи полагаются на надлежащую подготовку образцов кожи, подавление нейтрофильных иммунных реакций мышей путем введения анти-Gr1, соблюдение методов асептической хирургии грызунов и безопасную перевязку мышей. Модель трансплантации кожи ксенотрансплантата человека позволяет исследователям изучать иммунные реакции человека в интактном органе in vivo, обеспечивая новый путь для трансляционных исследований.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Ортотопическая Модель серозного рака яичников у иммунокомпетентных мышей для В естественных условиях Опухоль изображений и мониторинг иммунного ответа опухоли

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Seven Steps to Stellate Cells

Семь шагов к звездчатых клеток

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Измерение бактериальной нагрузки и иммунного ответа в мышей, инфицированных Listeria моноцитогенес</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура клеток

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель для измерения иммунных ответов на малярией в контексте ВИЧ-инфекцией

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Использование данио рерио модели человеческого вируса гриппа А инфекций экрана противовирусных препаратов и характеризации иммунных клеток-хозяев ответов

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Всасывания блистер протокол для изучения человеческий Т-клеточный вспомнить ответы в естественных условиях

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...