Name: xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo
Uploaded: 2022-06-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo at JoVE.com

Detta arbete finansierades delvis av sponsrade forskningsavtal från TRex Bio och bidrag från NIH (1R01AR075864-01A1). JMM stöds av Cancer Research Society (bidrag 26005). Vi erkänner Parnassus Flow Cytometry Core som delvis stöds av bidrag NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 och S10 1S10OD018040-01.

Denna studie godkändes och utfördes i enlighet med UCSF IACUC (AN191105-01H) och IRB (13-11307) protokoll. Hudprover, kasserade som en del av rutinmässiga elektiva kirurgiska ingrepp, såsom bråckreparation, användes för den nuvarande forskningen. Hudproverna är antingen avidentifierade och certifierade som Not Human Subjects Research eller, om kliniskt identifierande information krävs för nedströmsanalyser, gav patienter skriftligt samtycke enligt IRB-protokoll 13-11307. Inga andra inklusions- eller exklusions...

<ol>
	<li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+wound+healing+in+humans+and+mice:+Challenges+in+translational+research.">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).</li><li>Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+approaches+to+create+murine+models+of+human+wound+healing.">Surgical approaches to create murine models of human wound healing.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2011, 969618 (2011).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+skin+immunity+and+inflammation.">Mechanisms regulating skin immunity and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).</li><li>Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+skin+organoids:+potential+opportunities+and+challenges.">Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).</li><li>Crist&#243;bal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+human+skin+transplantation:+a+systematic+review.">Mouse models for human skin transplantation: a systematic review.</a> Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD/SCID/&#947;cnull+mouse:+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells.">NOD/SCID/&#947;cnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li><li>Meraz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+patient-derived+xenograft+humanized+mouse+model+for+evaluation+of+lung+cancer+immune+responses.">An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses.</a> Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).</li><li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOD-scid+IL2rgamma(null)+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection.">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li><li>Meehan, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+xenograft+model+of+human+vasculature+in+the+mouse+ear+pinna.">Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna.</a> Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).</li><li>Gokkaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+graft+storage+in+platelet+rich+plasma+(PRP).">Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP).</a> Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).</li><li>. The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA">https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA</a> (2021)</li><li>Rodriguez, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+regulatory+T+cells+reside+in+human+skin.">Memory regulatory T cells reside in human skin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).</li><li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+rodent+aseptic+surgery.">Techniques in rodent aseptic surgery.</a> Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).</li><li>Karim, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+ischemia+and+neovascularization+in+a+murine+model+of+full+thickness+human+wound+healing.">Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2R&#947;null+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2R&#947;null mice display a T-effector memory phenotype.</a> PloS One. 7 (8), 44219 (2012).</li><li>Souci, L., Denesvre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+skin+models+in+domestic+animals.">3D skin models in domestic animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).</li><li>Holtkamp, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+guide+dendritic+cells+into+skin+lymphatics.">Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics.</a> Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).</li></ol>

Musxenograft-hudtransplantationsmodellen är en nyckelteknik för att mekanistiskt dissekera människors immunsvar i en in vivo-inställning 14. Framgångsrika hudxenografttransplantationer är beroende av lämplig beredning av möss och hudprover och möss och vidhäftning till aseptiska gnagarkirurgimetoder15. Snabb kylning och korrekt förvaring av hudprover vid kalla temperaturer i media (t.ex. steril saltlösning) är viktigt för att säkerställa fortsatt v?...

Musmodeller används ofta för att dra slutsatser om mänsklig biologi och sjukdom, delvis på grund av deras experimentella reproducerbarhet och förmåga till genetisk manipulation. Musfysiologi rekapitulerar dock inte helt mänskliga organsystem, särskilt hud, och har därför begränsningar för användning som preklinisk modell vid läkemedelsutveckling1. Anatomiska skillnader mellan mus och mänsklig hud inkluderar skillnader i epiteltjocklekar och arkitektur, brist på murina ekkrina svettkörtlar och variationer i hårcykling2. Dessutom skiljer sig både immunsystemets medfödda och adaptiva armar mellan de två arterna3. Mushud innehåller en unik immunpopulation av dendritiska epidermala T-celler (DETC), har ett högre överflöd av dermala γδ T-celler och varierar i immuncelldelmängd lokalisering jämfört med mänsklig vävnad4. Därför drar experimentella fynd om mänsklig hudbiologi och inflammation nytta av validering med mänsklig vävnad. Medan in vitro - och organoidodlingssystem är allmänt använda verktyg för att studera mänsklig vävnad, är dessa system begränsade av frånvarande eller ofullständig immunrekonstitution och brist på anslutning till perifer vaskulatur5. Den humaniserade xenograft-hudtransplantationsmodellen syftar till att möjliggöra terapeutisk eller biologisk manipulation av immun- och icke-immunvägar i mänskliga vävnader in vivo.
Den mänskliga hudxenograftmodellen har använts för att studera hudfysiologi och farmakologi, analysera immunavstötning och svar, dissekera mänskliga hudcancermekanismer och förstå hudsjukdomar och sårläkning6. Även om den är tillämplig på flera områden av hudforskning, har xenograftmodellen lägre genomströmning än in vitro-studier och saknar den lätthet av genetisk manipulation som används i musmodeller. Tidpunkter inom denna modell kan variera från veckor till månader, och framgångsrik ympning kräver lämpliga anläggningar och utrustning för att utföra dessa operationer. Xenograftmodellen levererar emellertid biologiskt och fysiologiskt sammanhang till experiment, medan organoidodlingssystem, såsom vävnadsutplanteringar, ofta kräver replikering av en myriad av rörliga delar, såsom exogena signaler, vid specifika tidsintervall7. Därför används denna modell bäst för att ytterligare validera fynd som observerats in vitro och inom musmodeller, eller för arbete som annars inte är biologiskt genomförbart. Lämplig användning av xenograftmodellen ger en unik möjlighet att studera och manipulera intakt mänsklig vävnad in vivo.
Optimering av xenograft hudtransplantationsmodell har förlitat sig på årtionden av forskning för att bevara transplantatintegriteten över tid. Avgörande för denna process är att använda den icke-överviktiga diabetiska (NOD) -scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) musen, som saknar B- och T-adaptiva immunceller, funktionella NK-celler och har brister i makrofag och dendritiska celler8. Den immunbristiga naturen hos dessa NSG-värdar möjliggör transplantation av humana hematopoetiska celler, patient-härledda cancerformer och hud 8,9,10. Trots denna immunsuppressiva värdmiljö är ytterligare undertryckande av musens neutrofila immunsvar genom administrering av anti-GR1 nödvändig för transplantatframgång10. De viktigaste hindren vid transplantation av intakt vävnad är infektion, avstötning och svårigheter att återupprätta blodflödet till transplantatet, vilket ibland leder till förlust av dermal och epidermal integritet11. Tekniker inklusive administrering av anti-FR1 och användning av lämpligt transplantatdjup förbättrartransplantatöverlevnaden 10. Noggrann optimering gör det möjligt att utföra mänskliga xenografthudtransplantationer på NSG-möss med hög effektivitet och överlevnad, från 90% -100%.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>Fixative for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>surgical glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>56-0451-82</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GR1 clone RB6-8C5</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0075</td>
			<td>Anti-rejection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC mouse anti-human CD25&#160; (Clone 2A3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340939</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-9956-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave pouches</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>89140-800</td>
			<td>For autoclaving tools and paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317438</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301042</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>317328</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex 0.3 mg/mL</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>059122</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen 50 mg/mL</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NADA # 141-199</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4188</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D42 Dermatome blade</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>5.D42BL10</td>
			<td>dermatome (1 blade per sample)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermatome D42</td>
			<td>Humeca</td>
			<td>4.D42</td>
			<td>dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>371610</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-10915-03</td>
			<td>To pin skin specimen for dermatome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>medicon</td>
			<td>02.04.10</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td>Skin digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5521-00</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-4776-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric clippers</td>
			<td>Kent</td>
			<td>CL8787-KIT</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765040</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Shandon Instant Hematoxylin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6765015</td>
			<td>H&#38;E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD45 (Clone HI30)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0459-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>medicon</td>
			<td>07.60.07</td>
			<td>sample preparation and mouse dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-362-178</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating lamp</td>
			<td>Morganville Scientific</td>
			<td>HL0100</td>
			<td>Post-surgical care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pads 4&#34; x 10&#34;</td>
			<td>Pristech</td>
			<td>20415</td>
			<td>Surgical heat supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin 1cc 12.7 mm syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>329410</td>
			<td>drug administration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>United States Pharmacopeia (USP)&#160;</td>
			<td>NDC 66794-013-25</td>
			<td>Anesthesia&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>911103</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair for Men</td>
			<td>Nair</td>
			<td>&#8206; 10022600588556</td>
			<td>hair removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>&#160;NDC 17478-235-35</td>
			<td>eye ointment to prevent drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Kleenex</td>
			<td>100848</td>
			<td>May be autoclaved for sterile surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td>Semitransparent sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557938</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Surface protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561283</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-1529-42</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer 10x</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Wrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305-654</td>
			<td>Site preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone-Iodine Swab stick</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S41350</td>
			<td>Site sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar)</td>
			<td>Se Lab Group Inc</td>
			<td>NC9066511&#160;</td>
			<td>For supplementing poorly recovering mice post-surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Collection Cups</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-150-266</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile alcohol prep pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td>skin preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Media for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-02</td>
			<td>For drug dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Film 4&#8221; x 43/4&#8221;&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1626</td>
			<td>transparent film wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline Petrolatum Gauze 3&#8221; x 8&#8221;&#160;</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>414600</td>
			<td>wound dressing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Violet 510 Ghost Dye&#160;</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>13-0870-T100</td>
			<td>Flow cytometry analysis: Viability dye</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenograft skin model to manipulate human immune responses in vivo

Den mänskliga hudxenograftmodellen, där mänsklig donatorhud transplanteras på en immunbristmusvärd, är ett viktigt alternativ för translationell forskning inom hudimmunologi. Murin och mänsklig hud skiljer sig väsentligt i anatomi och immuncellsammansättning. Därför har traditionella musmodeller begränsningar för dermatologisk forskning och läkemedelsupptäckt. Framgångsrika xenotransplanter är dock tekniskt utmanande och kräver optimal förberedelse av prov- och mustransplantatplats för transplantat och värdöverlevnad. Detta protokoll tillhandahåller en optimerad teknik för att transplantera mänsklig hud på möss och diskuterar nödvändiga överväganden för nedströms experimentella mål. Denna rapport beskriver lämplig beredning av ett humant donatorhudprov, montering av en kirurgisk installation, förberedelse av mus och kirurgisk plats, hudtransplantation och postkirurgisk övervakning. Anslutning till dessa metoder möjliggör underhåll av xenografter i över 6 veckor efter operationen. De tekniker som beskrivs nedan möjliggör maximal ympningseffektivitet på grund av utvecklingen av tekniska kontroller, steril teknik och pre- och postkirurgisk konditionering. Lämplig prestanda för xenograftmodellen resulterar i långlivade humana hudtransplantatprover för experimentell karakterisering av mänsklig hud och preklinisk testning av föreningar in vivo.

Människohudxenografter utfördes på NSG-möss inuti en superbarriärdjuranläggning. Framgång definierades av den långvariga transplantat- och musöverlevnaden och beteendehälsan hos möss efter transplantation. Dålig överlevnad under veckan efter operationen observerades ursprungligen som det största hindret för experimentell framgång, med upp till 50% av mössen som krävde eutanasi. Förbättrad steril teknik och bättre stöd för muskroppstemperaturer under och omedelbart efter operationen ökade kirurgisk...

Watch this Scientific Journal Video about Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo at JoVE.com

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

Detta protokoll beskriver hur man ympar mänsklig hud på icke-överviktiga diabetiker (NOD) -scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) möss. En detaljerad beskrivning av beredningen av mänsklig hud för transplantation, förberedelse av möss för transplantation, transplantation av mänsklig hud med delad tjocklek och återhämtningsförfarande efter transplantation ingår i rapporten.

Xenograft hudmodell för att manipulera mänskliga immunsvar in vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

Vi beskriver tekniker som är nödvändiga för den mänskliga xenografthudtransplantationsmodellen, ett viktigt verktyg för manipulation av immun- och icke-immunvägar i mänskliga vävnader in vivo. Denna teknik rekapitulerar bättre mänsklig hudfysiologi än in vitro-metoder, vilket möjliggör preklinisk experimentell manipulation in vivo. Xenograft hudtransplantationer kan användas för preklinisk testning av föreningar som riktar sig mot inflammation i huden hos människa in vivo.Bandaging möss kan vara särskilt utmanande, så vi rekommenderar att du övar bandageprocessen på friska bedövade möss innan du utför operationer. För att börja, förbered dig på att dermatomera det mänskliga hudprovet i en steriliserad vävnadsodlingshuv med negativt tryck på ett steriliserat dissektionskort. Placera hudprovet med epidermis sida uppåt på dissektionskortet och torka av överhuden med en steril alkoholförberedande dyna följt av PBS.Använd nu en 1,5 tums dissekerande T-stift för att fixa hudens närmare kant. Dermatom sedan hudprovet vid 400 mikrometers tjocklek och applicera stadigt tryck medan du skär framåt i en vinkel på 30 till 45 grader. Placera en steril gasbindning som blötläggs i steril PBS i botten av petriskålen och placera huden med epidermis sida upp på den våta gasbindningen.Försegla och täck plattkanterna med en halvtransparent tätningsfilm för att säkerställa att provet inte är förorenat och förvara provet vid fyra grader Celsius före ympning. Förbered de sterila instrumenten och kirurgistationen för ympning och använd autoklaverade pappershanddukar som sterila ytor för instrument- och musplacering. Efter anestesiinduktion, överför musen till en värmepanna eller annan värmekälla och administrera den oftalmiska salvan genom att dabba en liten droppe salva på ögat med ett handskefinger.Nyp huden och injicera subkutant smärtstillande medel i en vinkel parallellt med kroppen. Efter att ha lyft musen i svansen, exponera buken och injicera 100 mikrogram per 100 mikroliter anti-Gr1 intraperitonealt i 30 graders vinkel med en en milliliter insulinspruta. Använd sedan djursäkra elektriska klippare för att raka de mellersta och övre delarna av musens dorsala sida.Efter att ha rensat alla hårstrån, applicera en generös mängd hårborttagningssalva på den rakade huden. Vänta i 30 sekunder till en minut och torka sedan av hårborttagningssalvan helt med en pappershandduk och PBS. Efter överföring av musen till kirurgiska stationen, sterilisera det kirurgiska området och placera en steril plastfolie över musen.Skär ett fönster i plasten som är något större än storleken på området som ska ympas. Håll donatorhuden stadigt på plats med tångens baksida och skär en rektangel formad 10 x 10 millimeter del av donatorhuden som ska ympas tillsammans med tången med en skalpell. Dra bort huden från kroppen för att undvika att skära djupt in i fascian.För att skapa en transplantatbädd, klipp ett rektangulärt område av mushud som matchar storleken på givarhudstycket. Placera sedan donatorhudstycket med epidermis sida uppåt på den förberedda transplantatbädden. Använd baksidan av tången och manipulera huden som glider fram och tillbaka tills donatorhuden ligger helt platt mot transplantatbädden.Tillsätt kirurgiska limvävnadslimdroppar där donatorhuden möter mushuden och håll musen och donatorhuden tillsammans med pincett i en till två sekunder så att limet fäster vid vävnaderna. Försegla transplantatets kant helt och låt limet torka ordentligt. Skär sedan petrolatumgasväv som är tillräckligt stor för att täcka transplantatområdet helt.Täck transplantatet med petrolatumgasväven och tryck lätt gasbindningen mot huden med pincett. Skär en remsa av en transparent filmförband på längden så att bredden är tillräckligt stor för att täcka musens sår. Tryck fast den genomskinliga filmförbandet med limsidan nedåt över gasbindningen.Rulla snabbt musen för att linda förbandet helt runt bålen, se till att det sitter tätt utan att hindra andning och alla lemmar är fria för rörelse. När du har placerat musen i en återhämtningsbur, övervaka den tills den är vaken och rör sig. Ge en värmekälla från burens sida i minst 15 minuter efter återhämtning.Analys av transplantat 10 till 21 dagar efter transplantation visade att transplantatet förblev vidhäftande runt kanterna där donatorns hud möter musens hud och transplantatet förblev tjockare och mer inflammerat än frisk mänsklig hud. Analys med flödescytometri avslöjade den ihållande närvaron av humana immunceller i de flesta transplantat, men antalet varierade mellan xenografter. Det framgångsrika transplantatet upprätthöll de mänskliga immuncellerna.Trots fortsatt följsamhet och överlevnad av donatorvävnad anses transplantat som inte lyckades upprätthålla de mänskliga immuncellerna dock vara misslyckade. Analys av hematoxylin och eosinfärgade delar av transplantatet efter 35 dagar visade intakt epidermis och dermis är måttligt cellulär bestående av fylliga ovala fibroblaster med blek syncytial cytoplasma och spridda lymfocyter. Analys av transplantatet efter 50 dagar visade liknande resultat med intakt epidermis och dermis innehållande ovala fibroblaster och något förbättrad extracellulär matrisavsättning.Framgångsrika hudxenografter förlitar sig på lämplig beredning av hudprover, undertryckande av musens neutrofila immunsvar genom administrering av anti-Gr1, efterlevnad av aseptiska gnagarkirurgimetoder och säker bandage av möss. Den mänskliga xenograft-hudtransplantationsmodellen gör det möjligt för forskare att studera mänskliga immunsvar i det intakta organet in vivo, vilket ger en ny väg för translationell forskning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

En Orthotopic Modell av serös äggstockscancer hos immunkompetenta möss In vivo Bildgivande och övervakning av tumör Immunsvar

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Att mäta bakteriehalten och immunsvar hos möss som blivit infekterade med Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation av Tail Hud att Studera Allogen CD4 T-cellsvar hos möss

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocytisolering från human hud för fenotypisk analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell för mätning av immunsvar mot malaria som led av HIV-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Använda Zebrafish Modeller av mänsklig influensa A-virus infektioner till skärm antivirala läkemedel och karakterisera värdens immuncellsvar

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ett sug Blister protokoll att studera mänsklig T-cell Recall Svaren In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...