Name: a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke EPSRC (EP/R513313/1) for finansieringen. Forfatterne vil også gerne takke R.B Elliot og Son Abattoir i Calow, Chesterfield, for at levere lammehoveder og for at være så imødekommende i de tidlige stadier af projektet, Kasia Emery for hendes støtte gennem hele udviklingen af denne protokol og Fiona Wright fra Institut for Infektion, Immunitet og Kardiovaskulær Sygdom ved University of Sheffield for at behandle histologiprøverne og være så utroligt hjælpsomme gennem hele dette projekt.

Lams hoveder fra R.B Elliott og Son Abattoir blev brugt som kilde til hudprøver i dette projekt. Alle lam blev slagtet til konsum som mad. I stedet for at kassere hovederne blev disse genbrugt til forskning. Etisk godkendelse var ikke påkrævet, da vævet stammede fra affald kasseret fra slagterier.
1. Sterilisering
<ol><li>Desinficer tang inden opsamling af hovederne ved at tage rene tang og udføre tør varmesterilisering i en ovn ved 200 ° C i 1 time. Autoklave alt gla...

<ol>
	<li>Claeys, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+published+risk+factors+for+methicillin-resistant+S.+aureus+in+acute+bacterial+skin+and+skin+structure+infections.">Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).</li><li>Rahim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contribution+in+chronicity+of+wounds.">Bacterial contribution in chronicity of wounds.</a> Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+in+evaluating+management+of+unhealed+surgical+wounds+in+the+community+in+clinical+practice+in+the+UK:+A+cohort+study.">Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study.</a> BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).</li><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+A+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li><li>Wilcox, M. H., Dryden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology+of+healthcare-acquired+bacterial+infections:+Focus+on+complicated+skin+and+skin+structure+infections.">Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).</li><li>Han, G., Ceilley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+healing:+A+review+of+current+management+and+treatments.">Chronic wound healing: A review of current management and treatments.</a> Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).</li><li>Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+tolerance+and+the+significance+of+persister+cells+in+recalcitrant+chronic+wound+biofilms.">Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dheman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+antibacterial+drug+development+trends+in+the+United+States,+1980-2019.">An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019.</a> Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).</li><li>MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+tissue-engineered+skin+and+oral+mucosa+for+clinical+and+experimental+use.">Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+ex+vivo+porcine+skin+explant+model+for+the+assessment+of+mature+bacterial+biofilms.">Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).</li><li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+infection.">Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).</li><li>Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+murine+model+for+delayed+wound+healing+using+a+biological+wound+dressing+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).</li><li>Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+human+tissues+for+research:+What+investigators+need+to+know.">The use of human tissues for research: What investigators need to know.</a> Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).</li><li>Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+human+skin+model+for+studying+skin+barrier+repair.">An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair.</a> Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).</li><li>Torres, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+murine+skin+model+for+B.+burgdorferi+biofilm.">Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm.</a> Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).</li><li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+diabetic+(db/db)+mice+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+challenge:+A+model+for+the+study+of+chronic+wounds.">Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).</li><li>Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+biofilms+impair+wound+healing+by+delaying+reepithelialization+in+a+murine+cutaneous+wound+model.">Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).</li><li>Tr&#248;strup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB/c+mice+in+a+novel+chronic+wound+model.">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li><li>Thompson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gallium+citrate+formulations+against+a+multidrug-resistant+strain+of+Klebsiella+pneumoniae+in+a+murine+wound+model+of+infection.">Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).</li><li>Maboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+skin+explant+model+to+study+anaerobic+bacterial+infection.">A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).</li><li>Macneil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+opportunities+for+tissue-engineered+skin.">Progress and opportunities for tissue-engineered skin.</a> Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).</li><li>Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karl&#233;n, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+preclinical+antibacterial+pipeline.">The global preclinical antibacterial pipeline.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).</li><li>Miethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+sustainable+discovery+and+development+of+new+antibiotics.">Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics.</a> Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).</li><li>Guedes, G. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+situ+model+of+biofilm-associated+wounds:+Providing+a+host-like+environment+for+the+study+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).</li><li>Johnson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+the+activity+of+chlorhexidine+for+decolonization+of+Candida+auris+from+porcine+skin.">Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin.</a> Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).</li><li>Horton, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+auris+Forms+High-Burden+Biofilms+in+Skin+Niche+Conditions+and+on+Porcine+Skin.">Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin.</a> mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).</li><li>Ashrafi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+biofilm+formation+on+human+skin+wound+models+and+demonstration+of+clinically+translatable+bacteria-specific+volatile+signatures.">Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures.</a> Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).</li><li>Brackman, G., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biofilm+wound+models+and+their+application.">In vitro and in vivo biofilm wound models and their application.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Models+of+Biofilm+Infection.">In Vivo Models of Biofilm Infection.</a> Biofilm Infections. , 267-290 (2011).</li><li>Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sheep+model+to+investigate+the+role+of+fungal+biofilms+in+sinusitis:+Fungal+and+bacterial+synergy.">A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).</li><li>Williams, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+biofilm+implant-related+osteomyelitis+to+test+combination+biomaterials+using+biofilms+as+initial+inocula.">Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).</li><li>Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+sheep+models:+From+asthma+to+vaccines.">Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines.</a> Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).</li><li>Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+replacement+skin:+The+crossroads+of+biomaterials,+wound+healing,+embryonic+development,+stem+cells+and+regeneration.">Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration.</a> Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).</li><li>Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogenous+skin+fibroblast+transplantation+enhances+excisional+wound+healing+following+alloxan+diabetes+in+sheep,+a+randomized+controlled+trial.">Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial.</a> International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).</li><li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+mesenchymal+stem+cells+improve+the+wound+healing+process+of+sheep+skin.">Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).</li><li>Roberts, C. D., Windsor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+pain+management+solutions+in+animals+may+provide+improved+wound+pain+reduction+during+debridement+in+humans:+An+opinion+informed+by+veterinary+literature.">Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature.</a> International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).</li><li>Mazzone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+and+in+utero+transplantation+of+fetal+skin+in+the+sheep+model:+A+crucial+step+towards+clinical+application+in+human+fetal+spina+bifida+repair.">Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).</li><li>Olkowska, E., Gr&#382;ini&#263;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates.">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909 (2022).</li><li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model.">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li></ol>

Udviklingen af antimikrobielle stoffer er et vigtigt, men dyrt foretagende, der anslås at koste omkring 1 milliard dollars og tage omkring 15 år at gennemføre. Over 90% af antimikrobielle lægemiddelopdagelser og prækliniske undersøgelser af antimikrobiel lægemiddeleffektivitet udføres af akademiske forskere og små til mellemstore virksomheder med typisk mindre end 50 ansatte22. Disse hold er meget økonomisk begrænsede, hvilket gør blymolekylernes svigt i senere stadier af translationel...

Hudinfektioner er et vigtigt globalt problem med store økonomiske omkostninger for sundhedsudbydere over hele verden. Udviklingen af multiresistens og biofilmdannelse af patogener spiller en central rolle i forekomsten af ikke-helbredende sår 1,2,3,4. Som et resultat af dette er hud- og bløddelsinfektioner en af de mere almindelige årsager til forlænget indlæggelse og efterfølgende genindlæggelse5. Forsinkelser i sårheling er dyre for både patienten og sundhedsudbydere, med nogle skøn, der tyder på, at omkring 6,5 millioner patienter påvirkes årligt i USA. I Storbritannien resulterer hudinfektioner og tilhørende komplikationer i ca. 75.000 dødsfald årligt 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) er et formidabelt sårpatogen, der ofte isoleres fra patientsår 2,7. Fremkomsten af multiresistens steg drastisk i 2000'erne. I løbet af denne tid var omkring 60% af akutte bakterielle hud- og hudstrukturinfektioner kulturpositive for methicillinresistente S. aureus1. Det stigende antal multiresistente stammer blandt stafylokokker og faktisk andre patogener inden for de sidste 2 årtier indikerer et presserende behov for hurtig udvikling af antibiotika med nye virkningsmåder, der kan overvinde resistens.
Siden begyndelsen af 2000'erne har antibiotikaopdagelsesprogrammer imidlertid været domineret af længere udviklingstider og lave succesrater, hvor kun 17% af nye antibiotika, der indgår i kliniske forsøg i USA, opnår markedsgodkendelse8. Dette tyder på en forskel mellem resultaterne fra in vitro-test af nye antibiotika og deres kliniske resultater. Det kan hævdes, at denne forskel i vid udstrækning skyldes forskelle i bakteriel fysiologi under infektioner in vivo og under konventionelle mikrobiologiske metoder, når man tester effektiviteten af antibiotika i in vitro prækliniske stadier. Derfor er der behov for nye laboratoriemetoder, der er mere repræsentative for bakteriel fysiologi under infektion, for at forbedre succesraterne i antibiotikaopdagelsesprogrammer.
De nuværende metoder til undersøgelse af hudinfektioner omfatter undersøgelser af levende dyr (f.eks. mus), ex vivo-hudmodeller (f.eks. svin) og hudmodeller konstrueret til 3D-væv (f.eks. mennesker)9,10,11,12. Undersøgelser af levende dyr er strengt regulerede og har relativt lav gennemstrømning. I dyremodeller forårsager sår og infektion betydelig nød for dyrene og giver anledning til etiske bekymringer. Modeller af menneskelig hud, ex vivo- eller vævsmodeller, kræver etisk godkendelse, overholdelse af lokal og global lovgivning (loven om humant væv, Helsingforserklæringen), og der er vanskeligheder med at erhverve væv, idet nogle anmodninger tager år at opfylde13,14. Begge modeltyper er arbejdskrævende og kræver betydelig ekspertise for at sikre eksperimentel succes. Nogle nuværende ex vivo-hudinfektionsmodeller kræver præpodede diske og tilsætningsstoffer til sårbunden for at muliggøre infektion; Selvom disse modeller er utroligt nyttige, er der begrænsninger i infektionsprocessen, da tilsætningsstoffer begrænser brugen af sårbunden som næringskilde10,15,16,17. Den model, der er beskrevet i denne undersøgelse, bruger ingen tilsætningsstoffer til sårlejet, hvilket sikrer, at infektionspatologien og levedygtige celletal er et resultat af direkte udnyttelse af sårlejet som den eneste næringskilde.
I betragtning af behovet for nye laboratoriemetoder er der udviklet en ny ex vivo-fåremodel med høj kapacitet af hudinfektioner til brug ved evaluering af virkningen af nye antibiotika. Hudinfektionsundersøgelser står over for mange udfordringer - høje omkostninger, etiske bekymringer og modeller, der ikke viser et fuldt billede20,21. Ex vivo-modeller og 3D-explant-modeller giver mulighed for bedre visualisering af sygdomsprocessen og den indvirkning, behandlinger kan have fra en mere klinisk relevant model. Her beskrives opsætningen af en ny fårehudsmodel, som er enkel, reproducerbar og klinisk relevant og har høj gennemstrømning. Fåreskind blev valgt som får er et af de store pattedyr, der almindeligvis bruges til at modellere reaktioner på infektioner in vivo. Desuden er de let tilgængelige fra slagterier, hvilket sikrer en stabil forsyning af hud til forskning, og deres kroppe er ikke skoldede, hvilket sikrer god vævskvalitet. Denne undersøgelse brugte S. aureus som det eksemplariske patogen; Modellen fungerer dog godt med andre mikroorganismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Companion Plate</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution, sterile</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colour Pro Style Cordless Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9639-2117X</td>
			<td>Hair Clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>458600-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Removal Cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212&#160;</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, Handheld</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, plastic blending cones</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15585819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert Individual 24 well 0.4um membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (MK media)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, cell culture Costar 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ESI-B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Allis Tissue Forceps</td>
			<td>Rocialle</td>
			<td>RSPU500-322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>14432-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>41298-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimoba Tablets</td>
			<td>Quip Labs</td>
			<td>VMTAB75BX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics

Udviklingen af antimikrobielle stoffer er en dyr proces med stadig lavere succesrater, hvilket gør det mindre attraktivt at investere yderligere i forskning i antimikrobielle opdagelser. Opdagelse af antimikrobielle lægemidler og efterfølgende kommercialisering kan gøres mere lukrativ, hvis en fail-fast-and-fail-cheap-tilgang kan implementeres inden for blyoptimeringsfaserne, hvor forskere har større kontrol over lægemiddeldesign og formulering. I denne artikel beskrives opsætningen af en ex vivo får såret hudmodel inficeret med Staphylococcus aureus, som er enkel, omkostningseffektiv, høj gennemstrømning og reproducerbar. Bakteriefysiologien i modellen efterligner, at under infektion som bakteriel spredning er afhængig af patogenets evne til at beskadige vævet. Etableringen af sårinfektion verificeres af en stigning i levedygtige bakterietal sammenlignet med podningen. Denne model kan bruges som en platform til at teste effektiviteten af nye antimikrobielle stoffer i blyoptimeringsfasen. Det kan hævdes, at tilgængeligheden af denne model vil give forskere, der udvikler antimikrobielle stoffer, en fail-fast-and-fail-cheap-model, som vil bidrage til at øge succesraten i efterfølgende dyreforsøg. Modellen vil også lette reduktionen og forfinelsen af dyrenes brug til forskning og i sidste ende muliggøre hurtigere og mere omkostningseffektiv oversættelse af nye antimikrobielle stoffer til hud- og bløddelsinfektioner til klinikken.

Identifikationen af en rute til sterilisering af huden, før sårinfektionsmodellen blev oprettet, var udfordrende. Udfordringen lå i at sterilisere huden uden at beskadige de forskellige hudlag, som så kan få utilsigtede konsekvenser for udfaldet af infektionen. For at identificere et passende steriliseringsregime blev forskellige behandlinger forsøgt i varierende tid, som beskrevet i tabel 1. Forurening blev registreret som udvikling af turbiditet efter 48 timer i MK-mediet, der blev brugt til at v...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics at JoVE.com

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Protokollen beskriver en trinvis metode til opstilling af en ex vivo-model for såret hud, der er inficeret med Staphylococcus aureus. Denne high-throughput-model simulerer bedre infektioner in vivo sammenlignet med konventionelle mikrobiologiske teknikker og præsenterer forskere for en fysiologisk relevant platform til at teste effekten af nye antimikrobielle stoffer.

En ny ex vivo ovine hudsårsmodel med høj kapacitet til test af nye antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Denne model vil gøre det muligt for forskerne i de kritiske prækliniske stadier mere præcist at bestemme den antimikrobielle effekt af nye formuleringer og giver forskerne større kontrol over lægemiddeldesign og formulering. Denne model muliggør hurtige reproducerbare resultater i et repræsentativt sårmiljø. Det reducerer behovet for dyr, der opdrættes til formål, og letter hurtigere oversættelse af topiske antimikrobielle stoffer til sårinfektioner til klinikken.De største udfordringer er forurening og fingerfærdighed. En streng aseptisk teknik og tålmodighed med vævsbehandling er afgørende; præcis og målrettet fjernelse af klapper er nødvendig for succesen med denne metode. Begynd med desinfektion af tang ved at udsætte dem for tør varmesterilisering ved 200 grader Celsius i en time.Autoklave alle glasvarer ved 121 grader Celsius i 15 minutter før brug. Desinficer lampens pandesektion ved at hælde ca. 100 ml 200 PPM klordioxidopløsning på prøveområdet. Barber pandesektionen ved hjælp af elektriske klippere efterfulgt af en vask med 200 ml 200 PPM klordioxidopløsning.Tør området af med ethanol og en blå rulle, og dæk prøveområdet med hårfjerningscreme. Efter 35 minutter skrabes hårfjerningscremen forsigtigt af ved hjælp af et skrabeværktøj og vurderer prøveområdet. Gentag hårfjerningsprocessen, hvis der er en betydelig mængde hår tilbage.Skyl det rene prøveområde med 200 ml klordioxidopløsning efterfulgt af ethanol og en blå rulle. Brug en steril otte millimeter biopsistans til at skære en otte millimeter hudprøve ud af det forberedte område. Fjern derefter prøven ved hjælp af steril tang og nummer 15 blade skalpel, hvilket sikrer, at alt kutant fedt fjernes.Anbring prøverne i en steril 0,5 liters krukke fyldt med steril PBS. Overfør dem derefter til sterile 50 ml rør fyldt med 50 ml 200 PPM klordioxidopløsning. Vend røret to gange og lad det sterilisere i 30 minutter.Prøverne overføres til et 50 ml rør fyldt med 40 ml steril PBS. Efter PBS-vasken anbringes hver hudprøve i en separat brønd på en 24-brøndsplade. Tilsæt 350 mikroliter af det forvarmede medium i en brønd, samtidig med at prøven opretholdes ved luft-væske-grænsefladen.Forsegl de 24-brøndsplader med en gasgennemtrængelig pladeforsegling, inden pladen placeres til inkubation i en befugtet vævsinkubator ved 5% kuldioxid og 37 grader Celsius i 24 timer. Efter inkubation fjernes kulturmediet og prøverne skylles i 500 mikroliter steril PBS. Fjern de resterende antibiotika fra prøven ved at behandle dem med antibiotikafrie medier ved 5% kuldioxid og 37 grader Celsius i 24 timer.Hvis turbiditet eller svampeinfektion udvikler sig i det antibiotikafrie medie, skal prøven kasseres. Forbered derefter et 50 ml rør med 10 ml steril tryptisk soja bouillon. Overfør derefter flere Staphylococcus aureus-kolonier fra en frisk agarplade af S.aureus til bouillonen, og inkuber røret ved 37 grader Celsius og 150 o / min i 18 timer.Efter centrifugering af rørene ved 4.000 G i tre minutter fjernes supernatanten og resuspenderer cellepelleten i 10 ml steril PBS. Gentag PBS-vasken to gange, før podningen justeres til 0,6 optisk densitet ved 600 nanometer bølgelængder ved hjælp af steril PBS. Bekræft podebelastningen ved hjælp af et manuelt levedygtigt pladeantal.For at inficere hudprøven skal du forberede en frisk 24-brøndplade med 400 mikroliter forvarmede antibiotikafrie medier og tilføje de 24 brøndindsatser ved hjælp af sterile tang. Fjern mediet fra hudprøverne. Vask dem med 500 mikroliter steril PBS og fjern vasken.Brug steril tang til forsigtigt at holde prøven til bunden af brønden. Brug en fire millimeter punch biopsi til at gennembore hudprøven til en grov dybde på en til to millimeter og lave en central sårklap. Brug derefter en 15-bladet skalpel og steriltandede Allis-vævstang til at fjerne det øverste lag af sårklappen.Når alle prøverne er blevet såret, overføres de til de 24 brøndindsatser ved hjælp af steril tang. Pipetter 15 mikroliter af bakteriepodet i sårlejet, inden det inkuberes i 24 timer ved 37 grader Celsius i en befugtet vævsinkubator. I længere inkubationsperioder skal du fjerne mediet, udskifte det med friske medier hver 24. time og inkubere pladerne under de samme forhold.For at bestemme bakteriebelastningen skal du fjerne mediet fra bunden af brøndene. Og ved hjælp af sterile tang overføres hver prøve til et separat 50 milliliter rør fyldt med en milliliter steril PBS. Derefter løsnes bakterierne fra overfladen af sårlejet ved at homogenisere prøveoverfladen med en finspidset homogenisator.Sørg for, at sårlejet er i direkte kontakt med homogenisatorens spids. Når alle prøverne er behandlet, skal hver prøve fortyndes, inden der overføres 20 mikroliter homogenat til den tilsvarende brønd i en 96-brøndplade indeholdende 180 mikroliter steril PBS. Serielt fortyndes hver prøve homogenat til 1 gange 10 til den negative 7, og pipetter 10 mikroliter af det fortyndede homogenat på en tryptisk soja agarplade i tre eksemplarer.Inkuber tryptic Soy Agar-pladen ved 37 grader Celsius, og efter 18 timer tælles antallet af kolonier for at bestemme kolonidannende enheder eller CFU for hver prøve. Et passende hudsteriliseringsregime blev identificeret ved hjælp af forskellige behandlinger i varierende tid. Vævsintegritet blev overvåget af histologi efterfulgt af farvning med hæmatoxylin og eosin umiddelbart efter behandlingen.En 30-minutters behandling med klordioxid var den mest effektive behandling, hvor reproducerbar sterilisering af hudvævet samtidig bevarede vævets integritet. En hvid film i sårbunden var tydelig på vævet 48 timer efter infektion. Selvom skrabemodellen havde et højere gennemsnitligt antal CFU'er efter 24 timer, gav klapfjernelsessviklingsteknikken mere ensartede resultater.Efter 48 timer blev ca. 100 gange flere bakterielle CFU'er genvundet fra det sårede væv sammenlignet med podningen, hvilket indikerer en vellykket infektion. Gramfarvede histologiske sektioner af det inficerede væv indikerede tilstedeværelsen af S.aureus-celler i sårlejet, som var fraværende i sektionerne af uinficeret væv. Efter denne procedure kan man udføre immunhistokemi for at studere vævsrespons, modificeret gramplet for at visualisere bakterielokaliseringen og levedygtige pladetællinger efter antimikrobiel eksponering for at teste antimikrobiel effekt.For forskerne, der udvikler nye antimikrobielle stoffer, vil denne model give større kontrol med blyoptimering, reducere afhængigheden af dyre og tæt regulerede dyreforsøg og muliggøre hurtig oversættelse af antimikrobielle stoffer til klinikken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Metode til Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Højt gennemløb, realtid, Dual-udlæsning Test af Intracellulær antimikrobielle aktivitet og eukaryote celle cytotoksicitet

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

En roman In Vitro sår Healing Assay for at evaluere celle Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Billeddannelse af reaktive ilt arter i en Murine sår Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høj overførselshastighed Shigella-specifikke bakteriedræbende Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Vurdering af akut sårheling ved hjælp af Dorsale subkutane Polyvinyl Alkohol Sponge Implantation og Excisional Tail Hud Sår Modeller.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Etablering af en Porcine Ex Vivo Hornhinde Model for at studere medicinske behandlinger mod bakteriel Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...