Name: a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics at JoVE.com

De auteurs willen EPSRC (EP/R513313/1) bedanken voor de financiering. De auteurs willen ook R.B Elliot en Son Abattoir in Calow, Chesterfield, bedanken voor het verstrekken van lammerenkoppen en voor het feit dat ze zo meegaand zijn in de vroege stadia van het project, Kasia Emery voor haar steun tijdens de ontwikkeling van dit protocol, en Fiona Wright van de afdeling Infectie, Immuniteit en Hart- en Vaatziekten aan de Universiteit van Sheffield voor het verwerken van de histologiemonsters en zo ongelooflijk behulpzaam zijn tijdens dit project.

Lammerenkoppen van het R.B Elliott and Son Abattoir werden in dit project gebruikt als bron van huidmonsters. Alle lammeren werden geslacht voor consumptie als voedsel. In plaats van de hoofden weg te gooien, werden deze hergebruikt voor onderzoek. Ethische goedkeuring was niet vereist omdat het weefsel afkomstig was van afval dat uit slachthuizen werd weggegooid.
1. Sterilisatie
<ol><li>Desinfecteer de tang voorafgaand aan het verzamelen van de koppen door een schone tang t...

<ol>
	<li>Claeys, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+published+risk+factors+for+methicillin-resistant+S.+aureus+in+acute+bacterial+skin+and+skin+structure+infections.">Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).</li><li>Rahim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contribution+in+chronicity+of+wounds.">Bacterial contribution in chronicity of wounds.</a> Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+in+evaluating+management+of+unhealed+surgical+wounds+in+the+community+in+clinical+practice+in+the+UK:+A+cohort+study.">Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study.</a> BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).</li><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+A+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li><li>Wilcox, M. H., Dryden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology+of+healthcare-acquired+bacterial+infections:+Focus+on+complicated+skin+and+skin+structure+infections.">Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).</li><li>Han, G., Ceilley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+healing:+A+review+of+current+management+and+treatments.">Chronic wound healing: A review of current management and treatments.</a> Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).</li><li>Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+tolerance+and+the+significance+of+persister+cells+in+recalcitrant+chronic+wound+biofilms.">Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dheman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+antibacterial+drug+development+trends+in+the+United+States,+1980-2019.">An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019.</a> Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).</li><li>MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+tissue-engineered+skin+and+oral+mucosa+for+clinical+and+experimental+use.">Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+ex+vivo+porcine+skin+explant+model+for+the+assessment+of+mature+bacterial+biofilms.">Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).</li><li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+infection.">Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).</li><li>Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+murine+model+for+delayed+wound+healing+using+a+biological+wound+dressing+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).</li><li>Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+human+tissues+for+research:+What+investigators+need+to+know.">The use of human tissues for research: What investigators need to know.</a> Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).</li><li>Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+human+skin+model+for+studying+skin+barrier+repair.">An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair.</a> Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).</li><li>Torres, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+murine+skin+model+for+B.+burgdorferi+biofilm.">Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm.</a> Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).</li><li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+diabetic+(db/db)+mice+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+challenge:+A+model+for+the+study+of+chronic+wounds.">Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).</li><li>Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+biofilms+impair+wound+healing+by+delaying+reepithelialization+in+a+murine+cutaneous+wound+model.">Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).</li><li>Tr&#248;strup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB/c+mice+in+a+novel+chronic+wound+model.">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li><li>Thompson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gallium+citrate+formulations+against+a+multidrug-resistant+strain+of+Klebsiella+pneumoniae+in+a+murine+wound+model+of+infection.">Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).</li><li>Maboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+skin+explant+model+to+study+anaerobic+bacterial+infection.">A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).</li><li>Macneil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+opportunities+for+tissue-engineered+skin.">Progress and opportunities for tissue-engineered skin.</a> Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).</li><li>Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karl&#233;n, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+preclinical+antibacterial+pipeline.">The global preclinical antibacterial pipeline.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).</li><li>Miethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+sustainable+discovery+and+development+of+new+antibiotics.">Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics.</a> Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).</li><li>Guedes, G. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+situ+model+of+biofilm-associated+wounds:+Providing+a+host-like+environment+for+the+study+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).</li><li>Johnson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+the+activity+of+chlorhexidine+for+decolonization+of+Candida+auris+from+porcine+skin.">Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin.</a> Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).</li><li>Horton, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+auris+Forms+High-Burden+Biofilms+in+Skin+Niche+Conditions+and+on+Porcine+Skin.">Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin.</a> mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).</li><li>Ashrafi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+biofilm+formation+on+human+skin+wound+models+and+demonstration+of+clinically+translatable+bacteria-specific+volatile+signatures.">Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures.</a> Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).</li><li>Brackman, G., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biofilm+wound+models+and+their+application.">In vitro and in vivo biofilm wound models and their application.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Models+of+Biofilm+Infection.">In Vivo Models of Biofilm Infection.</a> Biofilm Infections. , 267-290 (2011).</li><li>Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sheep+model+to+investigate+the+role+of+fungal+biofilms+in+sinusitis:+Fungal+and+bacterial+synergy.">A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).</li><li>Williams, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+biofilm+implant-related+osteomyelitis+to+test+combination+biomaterials+using+biofilms+as+initial+inocula.">Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).</li><li>Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+sheep+models:+From+asthma+to+vaccines.">Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines.</a> Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).</li><li>Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+replacement+skin:+The+crossroads+of+biomaterials,+wound+healing,+embryonic+development,+stem+cells+and+regeneration.">Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration.</a> Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).</li><li>Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogenous+skin+fibroblast+transplantation+enhances+excisional+wound+healing+following+alloxan+diabetes+in+sheep,+a+randomized+controlled+trial.">Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial.</a> International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).</li><li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+mesenchymal+stem+cells+improve+the+wound+healing+process+of+sheep+skin.">Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).</li><li>Roberts, C. D., Windsor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+pain+management+solutions+in+animals+may+provide+improved+wound+pain+reduction+during+debridement+in+humans:+An+opinion+informed+by+veterinary+literature.">Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature.</a> International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).</li><li>Mazzone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+and+in+utero+transplantation+of+fetal+skin+in+the+sheep+model:+A+crucial+step+towards+clinical+application+in+human+fetal+spina+bifida+repair.">Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).</li><li>Olkowska, E., Gr&#382;ini&#263;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates.">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909 (2022).</li><li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model.">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li></ol>

De ontwikkeling van antimicrobiële stoffen is een belangrijke maar dure onderneming die naar schatting ongeveer $ 1 miljard kost en ongeveer 15 jaar in beslag neemt. Meer dan 90% van de ontdekking van antimicrobiële geneesmiddelen en preklinische studies naar de werkzaamheid van antimicrobiële geneesmiddelen worden uitgevoerd door academische onderzoekers en kleine tot middelgrote bedrijven met doorgaans minder dan 50 werknemers22. Deze teams zijn zeer financieel beperkt, wat het falen van lood...

Huidinfecties zijn een belangrijk wereldwijd probleem, met grote economische kosten voor zorgverleners over de hele wereld. De ontwikkeling van multidrugresistentie en biofilmvorming door pathogenen speelt een sleutelrol in de prevalentie van niet-genezende wonden 1,2,3,4. Als gevolg hiervan zijn huid- en wekedeleninfecties een van de meest voorkomende redenen voor langdurige ziekenhuisopname en daaropvolgende heropname5. Vertragingen in wondgenezing zijn kostbaar voor zowel de patiënt als zorgverleners, met sommige schattingen die suggereren dat jaarlijks ongeveer 6,5 miljoen patiënten in de VS worden getroffen. In het Verenigd Koninkrijk resulteren huidinfecties en bijbehorende complicaties in ongeveer 75.000 sterfgevallen per jaar 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) is een formidabele wondpathogeen die vaak wordt geïsoleerd uit patiëntenwonden 2,7. De snelheid van opkomst van multidrugresistentie nam drastisch toe in de jaren 2000. Gedurende deze tijd was ongeveer 60% van de acute bacteriële huid- en huidstructuurinfecties cultuurpositief voor methicilline-resistente S. aureus1. Het toenemende aantal multiresistente stammen onder stafylokokken, en inderdaad andere pathogenen, in de afgelopen 2 decennia duidt op een dringende behoefte aan de snelle ontwikkeling van antibiotica met nieuwe werkingsmechanismen die resistentie kunnen overwinnen.
Sinds de vroege jaren 2000 worden antibiotica-ontdekkingsprogramma's echter gedomineerd door langere ontwikkelingstijden en lage slagingspercentages, waarbij slechts 17% van de nieuwe antibiotica die klinische proeven in de VS binnenkomen, marktgoedkeuring hebben verkregen8. Dit suggereert een verschil tussen de resultaten van in vitro testen van opkomende antibiotica en hun klinische uitkomsten. Er kan worden gesteld dat deze ongelijkheid grotendeels te wijten is aan verschillen in bacteriële fysiologie tijdens infecties in vivo en tijdens conventionele microbiologische methoden bij het testen van de werkzaamheid van antibiotica in de in vitro preklinische stadia. Daarom zijn nieuwe laboratoriummethoden nodig die meer representatief zijn voor bacteriële fysiologie tijdens infectie om de slagingspercentages in antibiotica-ontdekkingsprogramma's te verbeteren.
Huidige methoden voor het bestuderen van huidinfecties omvatten studies bij levende dieren (bijv. Muizen), ex vivo huidmodellen (bijv. Varkens) en 3D-weefselmanipulatie huidmodellen (bijv. Menselijk)9,10,11,12. Studies bij levende dieren zijn strikt gereguleerd en hebben een relatief lage doorvoer. In diermodellen veroorzaken verwonding en infectie aanzienlijk leed voor de dieren en roepen ze ethische zorgen op. Menselijke huidmodellen, ex vivo of tissue-engineered, vereisen ethische goedkeuring, naleving van lokale en wereldwijde wetgeving (de Human Tissue Act, de Verklaring van Helsinki), en er is moeite met het verkrijgen van weefsels, waarbij sommige verzoeken jaren duren om aan13,14 te voldoen. Beide modeltypen zijn arbeidsintensief en vereisen aanzienlijke expertise om experimenteel succes te garanderen. Sommige huidige ex vivo huidinfectiemodellen vereisen vooraf geënte schijven en additieven voor het wondbed om infectie mogelijk te maken; hoewel deze modellen ongelooflijk nuttig zijn, zijn er beperkingen in het infectieproces omdat additieven het gebruik van het wondbed als voedingsbron beperken 10,15,16,17. Het model dat in deze studie wordt beschreven, gebruikt geen additieven voor het wondbed, wat ervoor zorgt dat de pathologie van infectie en levensvatbare celtellingen het resultaat zijn van direct gebruik van het wondbed als de enige voedingsbron.
Gezien de behoefte aan nieuwe laboratoriummethoden, is een nieuw high-throughput ex vivo schapenmodel van huidinfecties ontwikkeld voor gebruik bij het evalueren van de werkzaamheid van opkomende antibiotica. Huidinfectiestudies worden geconfronteerd met vele uitdagingen - hoge kosten, ethische zorgen en modellen die geen volledig beeld laten zien 20,21. Ex vivo modellen en 3D explant modellen zorgen voor een betere visualisatie van het ziekteproces en de impact die behandelingen kunnen hebben vanuit een meer klinisch relevant model. Hier wordt de opzet van een nieuw schapenhuidmodel beschreven, dat eenvoudig, reproduceerbaar en klinisch relevant is en een hoge doorvoer heeft. Schapenhuid werd gekozen omdat schapen een van de grote zoogdieren zijn die vaak worden gebruikt om reacties op infecties in vivo te modelleren. Bovendien zijn ze gemakkelijk verkrijgbaar bij slachthuizen, wat zorgt voor een constante aanvoer van huid voor onderzoek, en hun karkassen zijn niet verbrand, wat een goede weefselkwaliteit garandeert. Deze studie gebruikte S. aureus als de voorbeeldpathogeen; het model werkt echter goed met andere micro-organismen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Companion Plate</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution, sterile</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colour Pro Style Cordless Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9639-2117X</td>
			<td>Hair Clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>458600-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Removal Cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212&#160;</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, Handheld</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, plastic blending cones</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15585819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert Individual 24 well 0.4um membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (MK media)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, cell culture Costar 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ESI-B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Allis Tissue Forceps</td>
			<td>Rocialle</td>
			<td>RSPU500-322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>14432-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>41298-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimoba Tablets</td>
			<td>Quip Labs</td>
			<td>VMTAB75BX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics

De ontwikkeling van antimicrobiële stoffen is een duur proces met steeds lagere slagingspercentages, wat verdere investeringen in antimicrobieel ontdekkingsonderzoek minder aantrekkelijk maakt. Antimicrobiële geneesmiddelenontdekking en daaropvolgende commercialisering kunnen lucratiever worden gemaakt als een fail-fast-and-fail-cheap-benadering kan worden geïmplementeerd binnen de leidende optimalisatiefasen waar onderzoekers meer controle hebben over het ontwerp en de formulering van geneesmiddelen. In dit artikel wordt de opstelling beschreven van een ex vivo schapenwond huidmodel geïnfecteerd met Staphylococcus aureus, dat eenvoudig, kosteneffectief, hoge doorvoer en reproduceerbaar is. De bacteriële fysiologie in het model bootst na dat tijdens infectie als bacteriële proliferatie afhankelijk is van het vermogen van de ziekteverwekker om het weefsel te beschadigen. De vaststelling van wondinfectie wordt geverifieerd door een toename van het aantal levensvatbare bacteriën in vergelijking met het entmateriaal. Dit model kan worden gebruikt als een platform om de werkzaamheid van opkomende antimicrobiële stoffen in de leadoptimalisatiefase te testen. Er kan worden gesteld dat de beschikbaarheid van dit model onderzoekers die antimicrobiële stoffen ontwikkelen een fail-fast-and-fail-cheap model zal bieden, wat zal helpen de slagingspercentages in volgende dierproeven te verhogen. Het model zal ook de vermindering en verfijning van het gebruik van dieren voor onderzoek vergemakkelijken en uiteindelijk een snellere en kosteneffectievere vertaling van nieuwe antimicrobiële stoffen voor huid- en wekedeleninfecties naar de kliniek mogelijk maken.

Het identificeren van een route om de huid te steriliseren voordat het wondinfectiemodel werd opgezet, was een uitdaging. De uitdaging lag in het steriliseren van de huid zonder de verschillende huidlagen te beschadigen, wat vervolgens onbedoelde gevolgen kan hebben in de uitkomst van de infectie. Om een geschikt sterilisatieregime te identificeren, werden verschillende behandelingen geprobeerd voor verschillende tijdsduur, zoals beschreven in tabel 1. Besmetting werd geregistreerd als de ontwikkeling va...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics at JoVE.com

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om een ex vivo schapen gewonde huidmodel op te zetten dat geïnfecteerd is met Staphylococcus aureus. Dit high-throughput model simuleert infecties beter in vivo in vergelijking met conventionele microbiologische technieken en biedt onderzoekers een fysiologisch relevant platform om de werkzaamheid van opkomende antimicrobiële stoffen te testen.

Een nieuw ex vivo schapenhuidwondmodel met hoge doorvoer voor het testen van opkomende antibiotica

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Dit model stelt de onderzoekers in de kritieke preklinische stadia in staat om de antimicrobiële werkzaamheid van nieuwe formuleringen nauwkeuriger te bepalen en geeft onderzoekers meer controle over het ontwerp en de formulering van geneesmiddelen. Dit model maakt snelle reproduceerbare resultaten mogelijk in een representatieve wondomgeving. Het vermindert de behoefte aan speciaal gefokte dieren en vergemakkelijkt de snellere vertaling van actuele antimicrobiële stoffen voor wondinfecties naar de kliniek.De belangrijkste uitdagingen zijn vervuiling en behendigheid. Een strikte aseptische techniek en geduld met weefselverwerking zijn essentieel; nauwkeurige en doelgerichte flapverwijdering is nodig voor het succes van deze methode. Begin met de desinfectie van een tang door ze gedurende een uur bloot te stellen aan droge hittesterilisatie bij 200 graden Celsius.Autoclaaf al het glaswerk op 121 graden Celsius gedurende 15 minuten voor gebruik. Desinfecteer het voorhoofdsgedeelte van de lamp door ongeveer 100 milliliter chloordioxide-oplossing van 200 PPM op het monstergebied te gieten. Scheer het voorhoofdsgedeelte met behulp van elektrische tondeuses, gevolgd door een wasbeurt met 200 milliliter chloordioxide-oplossing van 200 PPM.Veeg het gebied af met ethanol en een blauwe rol en bedek het monstergebied met ontharingscrème. Schraap na 35 minuten voorzichtig de ontharingscrème af met behulp van een schraapgereedschap en beoordeel het monstergebied. Herhaal het ontharingsproces als er een aanzienlijke hoeveelheid haar overblijft.Spoel het schone monstergebied af met 200 milliliter chloordioxide-oplossing gevolgd door ethanol en een blauwe rol. Gebruik een steriele biopsiepunch van acht millimeter om een huidmonster van acht millimeter uit het voorbereide gebied te snijden. Verwijder vervolgens het monster met een steriele tang en het scalpel van het mes nummer 15, zodat al het huidvet wordt verwijderd.Plaats de monsters in een steriele pot van 0,5 liter gevuld met steriel PBS. Breng ze vervolgens over in steriele buizen van 50 milliliter gevuld met 50 milliliter chloordioxide-oplossing van 200 PPM. Keer de buis twee keer om en laat deze 30 minuten steriliseren.Breng de monsters over in een buis van 50 milliliter gevuld met 40 milliliter steriel PBS. Plaats na de PBS-wasbeurt elk huidmonster in een apart putje van een plaat met 24 putten. Voeg 350 microliter van het voorverwarmde medium toe in een putje, terwijl het monster op de lucht-vloeistofinterface blijft.Sluit de 24-well platen af met een gasdoorlatende plaatafdichting voordat de plaat voor incubatie in een bevochtigde weefselincubator gedurende 24 uur op 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius wordt geplaatst. Verwijder na incubatie het kweekmedium en spoel de monsters in 500 microliter steriel PBS. Verwijder de resterende antibiotica uit het monster door ze gedurende 24 uur te behandelen met antibioticavrije media op 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius.Als troebelheid of schimmelinfectie zich ontwikkelt in de antibioticavrije media, gooit u het monster weg. Bereid vervolgens een buis van 50 milliliter met 10 milliliter steriele Tryptic Soy Bouillon. Breng vervolgens verschillende Staphylococcus aureus-kolonies over van een verse agarplaat van S.aureus naar de bouillon en incubeer de buis bij 37 graden Celsius en 150 RPM gedurende 18 uur.Nadat u de buisjes gedurende drie minuten op 4.000 G hebt gecentrifugeerd, verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de celpellet in 10 milliliter steriel PBS. Herhaal de PBS-was tweemaal voordat u het entmateriaal aanpast aan 0,6 optische dichtheid bij 600 nanometergolflengten met behulp van steriele PBS. Bevestig de entbelasting door een handmatig aantal levensvatbare platen.Om het huidmonster te infecteren, bereidt u een verse 24-wellsplaat met 400 microliter voorverwarmde antibioticavrije media en voegt u de 24 putinzetstukken toe met een steriele tang. Verwijder de media uit de huidmonsters. Was ze met 500 microliter steriel PBS en verwijder de was.Gebruik een steriele tang om het monster voorzichtig op de bodem van de put te houden. Gebruik een ponsbiopsie van vier millimeter om door het huidmonster te prikken tot een ruwe diepte van één tot twee millimeter en maak een centrale wondflap. Gebruik vervolgens een scalpel met een mes met een nummer 15 en een steriel getande Allis-weefseltang om de bovenste laag van de wondflap te verwijderen.Zodra alle monsters gewond zijn, brengt u ze met een steriele tang over naar de 24 putinzetstukken. Pipetteer 15 microliter van het bacteriële entmateriaal in het wondbed voordat u gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius broedt in een bevochtigde weefselincubator. Verwijder voor langere incubatieperioden de media, vervang deze elke 24 uur door verse media en incubeer de platen onder dezelfde omstandigheden.Om de bacteriële belasting te bepalen, verwijdert u de media van de bodem van de putten. En breng elk monster met behulp van een steriele tang over in een afzonderlijke buis van 50 milliliter gevuld met één milliliter steriel PBS. Maak vervolgens de bacteriën los van het oppervlak van het wondbed door het monsteroppervlak te homogeniseren met een fijnpunthomogenisator.Zorg ervoor dat het wondbed in direct contact staat met de punt van de homogenisator. Zodra alle monsters zijn verwerkt, vortex elk monster voordat 20 microliter homogenaat wordt overgebracht in de overeenkomstige put van een 96-well plaat met 180 microliter steriel PBS. Verdun elk monster homogenaat serieel tot 1 maal 10 tot negatief 7 en pipetteer 10 microliter van het verdunde homogenaat op een Tryptic Soy Agar plaat in drievoud.Incubeer de Tryptic Soy Agar-plaat op 37 graden Celsius en tel na 18 uur het aantal kolonies om de kolonievormende eenheden of CFU voor elk monster te bepalen. Een geschikt huidsterilisatieregime werd geïdentificeerd met behulp van verschillende behandelingen voor verschillende tijdsduur. De weefselintegriteit werd gecontroleerd door histologie, gevolgd door kleuring met hematoxyline en eosine onmiddellijk na de behandeling.Een behandeling van 30 minuten met chloordioxide was de meest effectieve behandeling, waarbij het huidweefsel reproduceerbaar werd gesteriliseerd met behoud van de weefselintegriteit. Een witte film in het wondbed was zichtbaar op het weefsel 48 uur na infectie. Hoewel het krasmodel na 24 uur een hoger gemiddeld aantal CFU's herbergde, leverde de flapverwijderingswondtechniek consistentere resultaten op.Na 48 uur werden ongeveer 100 keer meer bacteriële CFU's hersteld van het gewonde weefsel in vergelijking met het entmateriaal, wat wijst op een succesvolle infectie. Gram-gekleurde histologiesecties van het geïnfecteerde weefsel wezen op de aanwezigheid van S.aureus-cellen in het wondbed, dat afwezig was in de secties van niet-geïnfecteerd weefsel. Na deze procedure kan men immunohistochemie uitvoeren om de weefselrespons te bestuderen, gemodificeerde gramkleuring om de bacteriële lokalisatie te visualiseren en levensvatbare plaattellingen na antimicrobiële blootstelling om antimicrobiële werkzaamheid te testen.Voor de onderzoekers die nieuwe antimicrobiële stoffen ontwikkelen, zal dit model meer controle bieden over loodoptimalisatie, de afhankelijkheid van dure en strak gereguleerde dierproeven verminderen en de snelle vertaling van antimicrobiële stoffen naar de kliniek mogelijk maken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Beeldvorming van reactieve zuurstof soorten in een RattenUitrustingen wond Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Een High-throughput Shigella-specifieke bactericide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Beoordeling van acute wondgenezing met behulp van de dorsale subcutane polyvinyl alcohol spons implantatie en excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Het opzetten van een Porcine Ex Vivo Cornea Model voor het bestuderen van medicamenteuze behandelingen tegen bacteriële keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...