Name: a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier EPSRC (EP/R513313/1) pour son financement. Les auteurs aimeraient également remercier R.B Elliot and Son Abattoir à Calow, Chesterfield, pour avoir fourni des têtes d’agneau et pour avoir été si accommodantes dans les premières étapes du projet, Kasia Emery pour son soutien tout au long de l’élaboration de ce protocole, et Fiona Wright du Département des infections, de l’immunité et des maladies cardiovasculaires de l’Université de Sheffield pour le traitement des échantillons histologiques et leur aide incroyable tout au long de ce projet.

Les têtes d’agneau de l’abattoir R.B Elliott and Son ont été utilisées comme source d’échantillons de peau dans le cadre de ce projet. Tous les agneaux ont été abattus pour être consommés comme aliments. Au lieu de jeter les têtes, celles-ci ont été réutilisées pour la recherche. L’approbation éthique n’était pas requise puisque les tissus provenaient de déchets jetés dans les abattoirs.
1. Stérilisation
<ol><li>Désinfecter les pinces avant la c...

<ol>
	<li>Claeys, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+published+risk+factors+for+methicillin-resistant+S.+aureus+in+acute+bacterial+skin+and+skin+structure+infections.">Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).</li><li>Rahim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contribution+in+chronicity+of+wounds.">Bacterial contribution in chronicity of wounds.</a> Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+in+evaluating+management+of+unhealed+surgical+wounds+in+the+community+in+clinical+practice+in+the+UK:+A+cohort+study.">Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study.</a> BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).</li><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+A+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li><li>Wilcox, M. H., Dryden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology+of+healthcare-acquired+bacterial+infections:+Focus+on+complicated+skin+and+skin+structure+infections.">Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).</li><li>Han, G., Ceilley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+healing:+A+review+of+current+management+and+treatments.">Chronic wound healing: A review of current management and treatments.</a> Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).</li><li>Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+tolerance+and+the+significance+of+persister+cells+in+recalcitrant+chronic+wound+biofilms.">Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dheman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+antibacterial+drug+development+trends+in+the+United+States,+1980-2019.">An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019.</a> Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).</li><li>MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+tissue-engineered+skin+and+oral+mucosa+for+clinical+and+experimental+use.">Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+ex+vivo+porcine+skin+explant+model+for+the+assessment+of+mature+bacterial+biofilms.">Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).</li><li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+infection.">Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).</li><li>Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+murine+model+for+delayed+wound+healing+using+a+biological+wound+dressing+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).</li><li>Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+human+tissues+for+research:+What+investigators+need+to+know.">The use of human tissues for research: What investigators need to know.</a> Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).</li><li>Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+human+skin+model+for+studying+skin+barrier+repair.">An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair.</a> Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).</li><li>Torres, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+murine+skin+model+for+B.+burgdorferi+biofilm.">Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm.</a> Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).</li><li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+diabetic+(db/db)+mice+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+challenge:+A+model+for+the+study+of+chronic+wounds.">Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).</li><li>Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+biofilms+impair+wound+healing+by+delaying+reepithelialization+in+a+murine+cutaneous+wound+model.">Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).</li><li>Tr&#248;strup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB/c+mice+in+a+novel+chronic+wound+model.">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li><li>Thompson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gallium+citrate+formulations+against+a+multidrug-resistant+strain+of+Klebsiella+pneumoniae+in+a+murine+wound+model+of+infection.">Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).</li><li>Maboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+skin+explant+model+to+study+anaerobic+bacterial+infection.">A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).</li><li>Macneil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+opportunities+for+tissue-engineered+skin.">Progress and opportunities for tissue-engineered skin.</a> Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).</li><li>Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karl&#233;n, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+preclinical+antibacterial+pipeline.">The global preclinical antibacterial pipeline.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).</li><li>Miethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+sustainable+discovery+and+development+of+new+antibiotics.">Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics.</a> Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).</li><li>Guedes, G. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+situ+model+of+biofilm-associated+wounds:+Providing+a+host-like+environment+for+the+study+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).</li><li>Johnson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+the+activity+of+chlorhexidine+for+decolonization+of+Candida+auris+from+porcine+skin.">Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin.</a> Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).</li><li>Horton, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+auris+Forms+High-Burden+Biofilms+in+Skin+Niche+Conditions+and+on+Porcine+Skin.">Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin.</a> mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).</li><li>Ashrafi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+biofilm+formation+on+human+skin+wound+models+and+demonstration+of+clinically+translatable+bacteria-specific+volatile+signatures.">Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures.</a> Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).</li><li>Brackman, G., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biofilm+wound+models+and+their+application.">In vitro and in vivo biofilm wound models and their application.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Models+of+Biofilm+Infection.">In Vivo Models of Biofilm Infection.</a> Biofilm Infections. , 267-290 (2011).</li><li>Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sheep+model+to+investigate+the+role+of+fungal+biofilms+in+sinusitis:+Fungal+and+bacterial+synergy.">A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).</li><li>Williams, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+biofilm+implant-related+osteomyelitis+to+test+combination+biomaterials+using+biofilms+as+initial+inocula.">Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).</li><li>Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+sheep+models:+From+asthma+to+vaccines.">Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines.</a> Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).</li><li>Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+replacement+skin:+The+crossroads+of+biomaterials,+wound+healing,+embryonic+development,+stem+cells+and+regeneration.">Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration.</a> Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).</li><li>Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogenous+skin+fibroblast+transplantation+enhances+excisional+wound+healing+following+alloxan+diabetes+in+sheep,+a+randomized+controlled+trial.">Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial.</a> International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).</li><li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+mesenchymal+stem+cells+improve+the+wound+healing+process+of+sheep+skin.">Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).</li><li>Roberts, C. D., Windsor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+pain+management+solutions+in+animals+may+provide+improved+wound+pain+reduction+during+debridement+in+humans:+An+opinion+informed+by+veterinary+literature.">Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature.</a> International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).</li><li>Mazzone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+and+in+utero+transplantation+of+fetal+skin+in+the+sheep+model:+A+crucial+step+towards+clinical+application+in+human+fetal+spina+bifida+repair.">Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).</li><li>Olkowska, E., Gr&#382;ini&#263;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates.">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909 (2022).</li><li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model.">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li></ol>

Le développement d’antimicrobiens est une entreprise importante mais coûteuse qui devrait coûter environ 1 milliard de dollars et prendre environ 15 ans. Plus de 90 % des découvertes de médicaments antimicrobiens et des études précliniques sur l’efficacité des médicaments antimicrobiens sont réalisées par des chercheurs universitaires et des petites et moyennes entreprises comptant généralement moins de 50 employés22. Ces équipes sont très contraintes financièrement, ce qui re...

Les infections cutanées sont un problème mondial important, avec des coûts économiques importants pour les prestataires de soins de santé du monde entier. Le développement de la multirésistance aux médicaments et la formation de biofilms par des agents pathogènes jouent un rôle clé dans la prévalence des plaies non cicatrisantes 1,2,3,4. En conséquence, les infections de la peau et des tissus mous sont l’une des raisons les plus courantes d’hospitalisation prolongée et de réadmission ultérieure5. Les retards dans la cicatrisation des plaies sont coûteux pour le patient et les prestataires de soins de santé, certaines estimations suggérant qu’environ 6,5 millions de patients sont touchés chaque année aux États-Unis. Au Royaume-Uni, les infections cutanées et les complications associées entraînent environ 75 000 décès par an 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) est un pathogène redoutable des plaies fréquemment isolé des plaies des patients 2,7. Le taux d’émergence de la multirésistance a considérablement augmenté dans les années 2000. Pendant ce temps, environ 60% des infections bactériennes aiguës de la peau et de la structure de la peau étaient positives à la culture pour S. aureus1 résistant à la méthicilline. Le nombre croissant de souches multirésistantes parmi les staphylocoques, et même d’autres agents pathogènes, au cours des 2 dernières décennies indique un besoin urgent de développement rapide d’antibiotiques avec de nouveaux modes d’action capables de surmonter la résistance.
Cependant, depuis le début des années 2000, les programmes de découverte d’antibiotiques ont été dominés par des temps de développement plus longs et de faibles taux de réussite, avec seulement 17% des nouveaux antibiotiques entrant dans les essais cliniques aux États-Unis obtenant l’approbation de mise sur le marché8. Cela suggère une disparité entre les résultats des tests in vitro d’antibiotiques émergents et leurs résultats cliniques. On peut soutenir que cette disparité est en grande partie due aux différences de physiologie bactérienne au cours des infections in vivo et au cours des méthodes microbiologiques conventionnelles lors de l’essai de l’efficacité des antibiotiques aux stades précliniques in vitro . Par conséquent, de nouvelles méthodes de laboratoire plus représentatives de la physiologie bactérienne pendant l’infection sont nécessaires pour améliorer les taux de réussite des programmes de découverte d’antibiotiques.
Les méthodes actuelles d’étude des infections cutanées comprennent des études sur des animaux vivants (p. ex. souris), des modèles cutanés ex vivo (p. ex. porcins) et des modèles cutanés issus de l’ingénierie tissulaire 3D (p. ex. humains)9,10,11,12. Les études sur des animaux vivants sont strictement réglementées et ont un débit relativement faible. Dans les modèles animaux, les blessures et les infections causent une détresse importante aux animaux et soulèvent des préoccupations éthiques. Les modèles de peau humaine, ex vivo ou tissulaires, nécessitent une approbation éthique, le respect de la législation locale et mondiale (la loi sur les tissus humains, la déclaration d’Helsinki), et il est difficile d’acquérir des tissus, certaines demandes prenant des années à satisfaire13,14. Les deux types de modèles exigent beaucoup de main-d’œuvre et nécessitent une expertise importante pour assurer le succès expérimental. Certains modèles actuels d’infection cutanée ex vivo nécessitent des disques pré-inoculés et des additifs pour le lit de la plaie afin de permettre l’infection; Bien que ces modèles soient incroyablement utiles, il existe des limites dans le processus d’infection car les additifs limitent l’utilisation du lit de la plaie comme source de nutriments10,15,16,17. Le modèle décrit dans cette étude n’utilise aucun additif au lit de la plaie, ce qui garantit que la pathologie de l’infection et le nombre de cellules viables sont le résultat de l’utilisation directe du lit de la plaie comme seule source de nutriments.
Compte tenu de la nécessité de nouvelles méthodes de laboratoire, un nouveau modèle ovin ex vivo à haut débit d’infections cutanées a été mis au point pour évaluer l’efficacité des antibiotiques émergents. Les études sur les infections cutanées font face à de nombreux défis - coûts élevés, préoccupations éthiques et modèles qui ne donnent pas une image complète20,21. Les modèles ex vivo et les modèles 3D explant permettent une meilleure visualisation du processus de la maladie et de l’impact que les traitements peuvent avoir à partir d’un modèle plus pertinent sur le plan clinique. Ici, la configuration d’un nouveau modèle de peau ovine est décrite, qui est simple, reproductible et cliniquement pertinente et a un débit élevé. La peau d’ovins a été choisie car les moutons sont l’un des grands mammifères couramment utilisés pour modéliser les réponses aux infections in vivo. De plus, ils sont facilement disponibles dans les abattoirs, ce qui assure un approvisionnement régulier en peau pour la recherche, et leurs carcasses ne sont pas ébouillantées, ce qui garantit une bonne qualité des tissus. Cette étude a utilisé S. aureus comme agent pathogène exemplaire; Cependant, le modèle fonctionne bien avec d’autres micro-organismes.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Companion Plate</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution, sterile</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colour Pro Style Cordless Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9639-2117X</td>
			<td>Hair Clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>458600-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Removal Cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212&#160;</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, Handheld</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, plastic blending cones</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15585819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert Individual 24 well 0.4um membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (MK media)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, cell culture Costar 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ESI-B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Allis Tissue Forceps</td>
			<td>Rocialle</td>
			<td>RSPU500-322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>14432-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>41298-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimoba Tablets</td>
			<td>Quip Labs</td>
			<td>VMTAB75BX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics

Le développement d’antimicrobiens est un processus coûteux avec des taux de réussite de plus en plus faibles, ce qui rend les investissements supplémentaires dans la recherche sur la découverte d’antimicrobiens moins attrayants. La découverte de médicaments antimicrobiens et leur commercialisation subséquente peuvent être rendues plus lucratives si une approche rapide et peu coûteuse peut être mise en œuvre au cours des étapes d’optimisation des pistes où les chercheurs ont un plus grand contrôle sur la conception et la formulation des médicaments. Dans cet article, la configuration d’un modèle ex vivo de peau blessée ovine infectée par Staphylococcus aureus est décrite, ce qui est simple, rentable, à haut débit et reproductible. La physiologie bactérienne dans le modèle imite que pendant l’infection, la prolifération bactérienne dépend de la capacité de l’agent pathogène à endommager le tissu. L’établissement de l’infection de la plaie est vérifié par une augmentation du nombre de bactéries viables par rapport à l’inoculum. Ce modèle peut être utilisé comme plateforme pour tester l’efficacité des antimicrobiens émergents à l’étape de l’optimisation des prospects. On peut soutenir que la disponibilité de ce modèle fournira aux chercheurs qui développent des antimicrobiens un modèle d’échec rapide et bon marché, ce qui contribuera à augmenter les taux de réussite dans les essais ultérieurs sur les animaux. Le modèle facilitera également la réduction et le perfectionnement de l’utilisation des animaux pour la recherche et, en fin de compte, permettra une application plus rapide et plus rentable de nouveaux antimicrobiens pour les infections de la peau et des tissus mous à la clinique.

L’identification d’une voie de stérilisation de la peau avant la mise en place du modèle d’infection de la plaie a été difficile. Le défi consistait à stériliser la peau sans endommager les différentes couches de la peau, ce qui peut avoir des conséquences imprévues sur l’issue de l’infection. Pour identifier un régime de stérilisation approprié, différents traitements ont été essayés pour des durées variables, comme indiqué dans le tableau 1. La contamination a été enregis...

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A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Le protocole décrit une méthode étape par étape pour mettre en place un modèle ex vivo de peau blessée ovine infectée par Staphylococcus aureus. Ce modèle à haut débit simule mieux les infections in vivo par rapport aux techniques de microbiologie conventionnelles et offre aux chercheurs une plateforme physiologiquement pertinente pour tester l’efficacité des antimicrobiens émergents.

Un nouveau modèle ex vivo de plaies cutanées ovines à haut débit pour tester les antibiotiques émergents

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Ce modèle permettra aux chercheurs aux stades précliniques critiques de déterminer avec plus de précision l’efficacité antimicrobienne des nouvelles formulations et donnera aux chercheurs un plus grand contrôle sur la conception et la formulation des médicaments. Ce modèle permet des résultats rapidement reproductibles dans un environnement de plaie représentatif. Il réduit le besoin d’animaux élevés à des fins spéciales et facilite la traduction plus rapide des antimicrobiens topiques pour les infections des plaies à la clinique.Les principaux défis sont la contamination et la dextérité. Une technique aseptique stricte et la patience avec le traitement des tissus sont essentielles; un retrait précis et ciblé du lambeau est nécessaire pour le succès de cette méthode. Commencez par la désinfection des forceps en les exposant à une stérilisation à la chaleur sèche à 200 degrés Celsius pendant une heure.Autoclaver toute la verrerie à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes avant utilisation. Désinfectez la section frontale de la lampe en versant environ 100 millilitres de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm sur la zone d’échantillonnage. Raser la section frontale à l’aide d’une tondeuse électrique, suivie d’un lavage avec 200 millilitres de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm.Essuyez la zone avec de l’éthanol et un rouleau bleu, et couvrez la zone d’échantillon avec de la crème dépilatoire. Après 35 minutes, grattez doucement la crème dépilatoire à l’aide d’un outil de grattage et évaluez la zone d’échantillonnage. Répétez le processus d’épilation s’il reste une quantité importante de poils.Rincer la zone d’échantillon propre avec 200 millilitres de solution de dioxyde de chlore suivie d’éthanol et d’un rouleau bleu. Utilisez un poinçon de biopsie stérile de huit millimètres pour découper un échantillon de peau de huit millimètres de la zone préparée. Ensuite, retirez l’échantillon à l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel à lame numéro 15, en veillant à ce que toute la graisse cutanée soit éliminée.Placez les échantillons dans un pot stérile de 0,5 litre rempli de PBS stérile. Ensuite, transférez-les dans des tubes stériles de 50 millilitres remplis de 50 millilitres de solution de dioxyde de chlore de 200 ppm. Retourner le tube deux fois et le laisser stériliser pendant 30 minutes.Transférer les échantillons dans un tube de 50 millilitres rempli de 40 millilitres de PBS stérile. Après le lavage PBS, placez chaque échantillon de peau dans un puits séparé d’une assiette de 24 puits. Ajouter 350 microlitres du milieu préchauffé dans un puits, tout en maintenant l’échantillon à l’interface air-liquide.Scellez les plaques de 24 puits avec un joint de plaque perméable aux gaz avant de placer la plaque pour l’incubation dans un incubateur de tissus humidifiés à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, retirer le milieu de culture et rincer les échantillons dans 500 microlitres de PBS stérile. Retirez les antibiotiques résiduels de l’échantillon en les traitant avec des milieux sans antibiotiques à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Si une turbidité ou une infection fongique se développe dans le milieu exempt d’antibiotiques, jeter l’échantillon. Ensuite, préparez un tube de 50 millilitres avec 10 millilitres de bouillon de soja tryptique stérile. Ensuite, transférez plusieurs colonies de Staphylococcus aureus d’une plaque de gélose fraîche de S. aureus au bouillon et incuber le tube à 37 degrés Celsius et 150 RPM pendant 18 heures.Après avoir centrifugé les tubes à 4 000 G pendant trois minutes, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de PBS stérile. Répétez le lavage PBS deux fois avant d’ajuster l’inoculum à une densité optique de 0,6 à des longueurs d’onde de 600 nanomètres à l’aide de PBS stérile. Confirmer la charge d’inoculum par une numération manuelle sur plaque viable.Pour infecter l’échantillon de peau, préparez une nouvelle plaque de 24 puits avec 400 microlitres de milieu préchauffé sans antibiotique et ajoutez les 24 inserts de puits à l’aide de pinces stériles. Retirez le média des échantillons de peau. Lavez-les avec 500 microlitres de PBS stérile et retirez le lavage.Utilisez des pinces stériles pour maintenir doucement l’échantillon au fond du puits. Utilisez une biopsie à l’emporte-pièce de quatre millimètres pour percer l’échantillon de peau à une profondeur approximative d’un à deux millimètres et faire un lambeau central de la plaie. Utilisez ensuite un scalpel à lame numéro 15 et une pince à tissus Allis à dents stériles pour enlever la couche supérieure du lambeau de la plaie.Une fois que tous les échantillons ont été blessés, transférez-les dans les 24 inserts de puits à l’aide de pinces stériles. Pipeter 15 microlitres de l’inoculum bactérien dans le lit de la plaie avant d’incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de tissus humidifiés. Pour des périodes d’incubation plus longues, retirez le média, remplacez-le par un média frais toutes les 24 heures et incuber les plaques dans les mêmes conditions.Pour déterminer la charge bactérienne, retirez le média du fond des puits. Et à l’aide de pinces stériles, transférez chaque échantillon dans un tube séparé de 50 millilitres rempli d’un millilitre de PBS stérile. Ensuite, détachez les bactéries de la surface du lit de la plaie en homogénéisant la surface de l’échantillon avec un homogénéisateur à pointe fine.Assurez-vous que le lit de la plaie est en contact direct avec l’extrémité de l’homogénéisateur. Une fois tous les échantillons traités, vortex chaque échantillon avant de transférer 20 microlitres d’homogénat dans le puits correspondant d’une plaque de 96 puits contenant 180 microlitres de PBS stérile. Diluer en série chaque homogénat d’échantillon à 1 fois 10 au négatif 7, et pipeter 10 microlitres de l’homogénat dilué sur une plaque de gélose de soja tryptique en trois exemplaires.Incuber la plaque de gélose au soja tryptique à 37 degrés Celsius et, après 18 heures, compter le nombre de colonies pour déterminer les unités formant des colonies ou UFC pour chaque échantillon. Un régime approprié de stérilisation de la peau a été identifié en utilisant différents traitements pour des durées variables. L’intégrité des tissus a été surveillée par histologie, suivie d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine immédiatement après le traitement.Un traitement de 30 minutes au dioxyde de chlore était le traitement le plus efficace, avec stérilisation reproductible du tissu cutané tout en préservant l’intégrité des tissus. Une pellicule blanche dans le lit de la plaie était évidente sur le tissu 48 heures après l’infection. Bien que le modèle de rayure abritait un nombre moyen plus élevé d’UFC après 24 heures, la technique de blessure par enlèvement de lambeau a produit des résultats plus cohérents.Après 48 heures, environ 100 fois plus d’UFC bactériennes ont été récupérées dans le tissu blessé par rapport à l’inoculum, indiquant une infection réussie. Des coupes histologiques colorées de Gram du tissu infecté indiquaient la présence de cellules de S. aureus dans le lit de la plaie, qui était absente dans les sections de tissu non infecté. En suivant cette procédure, on peut effectuer une immunohistochimie pour étudier la réponse tissulaire, la coloration de Gram modifiée pour visualiser la localisation bactérienne et la numération sur plaque viable après une exposition aux antimicrobiens pour tester l’efficacité antimicrobienne.Pour les chercheurs qui mettent au point de nouveaux antimicrobiens, ce modèle permettra de mieux contrôler l’optimisation des prospects, de réduire la dépendance à l’égard d’essais coûteux et étroitement réglementés sur les animaux et de permettre la traduction rapide des antimicrobiens en clinique.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Une plaque de microtitrage à 96 puits à base Méthode de formation suivi et les tests de sensibilité antifongique des Candida albicans Les biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Recherche

Immunologie et infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture cellulaire

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Un roman In Vitro de la plaie guérison test afin d’évaluer la Migration cellulaire

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imagerie des espèces réactives de l’oxygène dans un murin plaie modèle

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Évaluation de la guérison aigue des plaies à l’aide de l’implantation d’éponge d’alcool polyvinyl subcutanée et des modèles excisionaux de blessure de peau de queue.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Établissement d’un modèle de cornée Porcine Ex Vivo pour l’étude des traitements médicamenteux contre la kératite bactérienne

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...