Name: a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00
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著者らは、EPSRC(EP/R513313/1)の資金提供に感謝する。著者らはまた、チェスターフィールドのカローにあるR.Bエリオットとサンアバトワールに子羊の頭を提供し、プロジェクトの初期段階で非常に親切にしてくれたこと、このプロトコルの開発を通じてサポートしてくれたカシアエメリー、シェフィールド大学の感染、免疫、心血管疾患学部のフィオナライトに組織学サンプルを処理し、このプロジェクト全体で非常に役立ったことに感謝します。

R.Bエリオットとサンアモントワールの子羊の頭は、このプロジェクトの皮膚サンプルのソースとして使用されました。すべての子羊は食物として消費するために屠殺されました。頭を捨てる代わりに、これらは研究のために再利用されました。組織は食肉処理場から廃棄された廃棄物から供給されたため、倫理的承認は必要ありませんでした。
1.滅菌
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抗菌薬の開発は重要だが費用のかかるベンチャーであり、約10億ドルの費用がかかり、完了するまでに約15年かかると推定されています。抗菌薬の発見と抗菌薬の有効性の前臨床試験の90%以上は、学術研究者や通常50人未満の中小企業によって実施されています22。これらのチームは非常に財政的に制約されており、トランスレーショナルリサーチの後期段階での鉛分子の失?...

皮膚感染症は重要な地球規模の問題であり、世界中の医療提供者に大きな経済的コストがかかります。病原体による多剤耐性およびバイオフィルム形成の発達は、非治癒性創傷の有病率において重要な役割を果たす1,2,3,4。この結果、皮膚軟部組織の感染症は、長期入院とその後の再入院の最も一般的な理由の1つです5。創傷治癒の遅れは、患者と医療提供者の両方にとってコストがかかり、米国では年間約650万人の患者が罹患していることを示唆する推定もあります。英国では、皮膚感染症とそれに関連する合併症により、年間約75,000人が死亡しています2,4,6。
黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)は、患者の創傷から頻繁に単離される手ごわい創傷病原体である2、7。多剤耐性の出現率は2000年代に劇的に増加しました。この間、急性細菌性皮膚および皮膚構造感染症の約60%がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌1の培養陽性でした。ブドウ球菌、そして実際に他の病原体の間で過去20年以内に多剤耐性株の数が増加していることは、耐性を克服することができる新しい作用機序を備えた抗生物質の迅速な開発の緊急の必要性を示しています。
しかし、2000年代初頭以降、抗菌薬探索プログラムは、より長い開発期間と低い成功率によって支配されており、米国で臨床試験に入った新規抗菌薬のわずか17%が市場承認を達成しています8。これは、新興抗生物質のin vitro試験の結果とそれらの臨床転帰との間に格差があることを示唆しています。この格差は、in vitroの前臨床段階で抗生物質の有効性をテストする際のin vivo感染中および従来の微生物学的方法中の細菌生理機能の違いに大きく起因していると主張することができます。したがって、抗生物質発見プログラムの成功率を向上させるためには、感染中の細菌生理学をより代表する新しい実験室方法が必要です。
皮膚感染症を研究するための現在の方法には、生きた動物(マウスなど)、ex vivo皮膚モデル(ブタなど)、および3D組織工学皮膚モデル(ヒトなど)での研究が含まれます9,10,11,12。生きた動物での研究は厳しく規制されており、スループットは比較的低いです。動物モデルでは、創傷と感染は動物に重大な苦痛を引き起こし、倫理的懸念を引き起こします。ex vivoまたは組織工学によるヒト皮膚モデルは、倫理的承認、国内および世界の法律(ヒト組織法、ヘルシンキ宣言)の遵守が必要であり、組織の取得が困難であり、一部の要求を満たすのに数年かかる場合があります13,14。どちらのモデルタイプも労働集約的であり、実験を成功させるにはかなりの専門知識が必要です。現在のex vivo皮膚感染モデルの中には、感染を可能にするために創傷床に事前に接種された椎間板と添加剤を必要とするものがあります。これらのモデルは非常に有用であるが、添加剤が栄養源としての創傷床の利用を制限するため、感染プロセスには制限がある10、15、16、17。この研究で説明されているモデルは、創傷床に添加物を使用していないため、感染の病理と生細胞数は、唯一の栄養源としての創傷床の直接利用の結果であることを保証します。
新しい実験室法の必要性を考慮して、新しい抗生物質の有効性を評価するために使用するための皮膚感染症の新しいハイスループットex vivoヒツジモデルが開発されました。皮膚感染症の研究は、高コスト、倫理的懸念、全体像を示さないモデルなど、多くの課題に直面しています20,21。生体外モデルと3D外植片モデルにより、疾患プロセスをより適切に視覚化でき、より臨床的に関連性のあるモデルから治療がもたらす影響が可能になります。ここでは、単純で再現性があり、臨床的に関連性があり、高いスループットを有する新しいヒツジ皮膚モデルのセットアップについて説明する。ヒツジがin vivoでの感染に対する応答をモデル化するために一般的に使用される大型哺乳類の1つとして選択されたヒツジの皮膚。さらに、それらは食肉処理場から容易に入手でき、研究用の皮膚の安定した供給を保証し、それらの死体はやけどを負わず、良好な組織品質を保証します。この研究では、黄色ブドウ球菌を模範的な病原体として使用しました。ただし、このモデルは他の微生物でもうまく機能します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Companion Plate</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution, sterile</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colour Pro Style Cordless Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9639-2117X</td>
			<td>Hair Clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>458600-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Removal Cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212&#160;</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, Handheld</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, plastic blending cones</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15585819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert Individual 24 well 0.4um membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (MK media)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, cell culture Costar 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ESI-B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Allis Tissue Forceps</td>
			<td>Rocialle</td>
			<td>RSPU500-322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>14432-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>41298-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimoba Tablets</td>
			<td>Quip Labs</td>
			<td>VMTAB75BX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics

抗菌薬の開発は費用のかかるプロセスであり、成功率はますます低くなっているため、抗菌薬発見研究へのさらなる投資はそれほど魅力的ではありません。抗菌薬の発見とその後の商品化は、研究者が医薬品の設計と処方をより細かく制御できるリード最適化段階でフェイルファストアンドフェイルチープアプローチを実装できれば、より収益性の高いものにすることができます。この記事では、黄色ブドウ球菌に感染したex vivoヒツジ創傷皮膚モデルのセットアップについて説明しますが、これはシンプルで費用効果が高く、スループットが高く、再現性があります。モデルの細菌生理機能は、感染中の細菌増殖が病原体の組織を損傷する能力に依存することを模倣しています。創傷感染の確立は、接種材料と比較して生存細菌数の増加によって検証される。このモデルは、リード最適化段階で新しい抗菌薬の有効性をテストするためのプラットフォームとして使用できます。このモデルの利用可能性は、抗菌薬を開発する研究者にフェイルファストアンドフェイルチープモデルを提供し、その後の動物試験の成功率を高めるのに役立つと主張することができます。このモデルはまた、研究のための動物使用の削減と改良を促進し、最終的には皮膚および軟部組織感染症に対する新規抗菌剤の臨床へのより迅速かつ費用効果の高い翻訳を可能にします。

創傷感染モデルを設定する前に皮膚を滅菌する経路を特定することは困難でした。課題は、さまざまな皮膚層に損傷を与えることなく皮膚を滅菌することにあり、感染の結果に意図しない結果をもたらす可能性があります。適切な滅菌レジームを特定するために、 表1に概説されているように、さまざまな治療をさまざまな長さで試行しました。汚染は、皮膚サンプルを維持する...

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A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

プロトコルは、黄色ブドウ球菌に感染したex vivoヒツジ創傷皮膚モデルをセットアップするための段階的な方法を説明しています。このハイスループットモデルは、従来の微生物学技術と比較してin vivoでの感染をよりよくシミュレートし、新しい抗菌薬の有効性をテストするための生理学的に関連するプラットフォームを研究者に提供します。

新しい抗生物質をテストするための新しいハイスループット Ex Vivo ヒツジ皮膚創傷モデル

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

このモデルにより、重要な前臨床段階にある研究者は、新規製剤の抗菌効果をより正確に判断でき、研究者は医薬品の設計と製剤をより細かく制御できるようになります。このモデルは、代表的な創傷環境で迅速に再現性のある結果を可能にします。目的繁殖動物の必要性を減らし、創傷感染症のための局所抗菌薬の診療所への迅速な翻訳を促進します。主な課題は汚染と器用さです。厳密な無菌技術と組織処理の忍耐が不可欠であり、この方法の成功には正確で意図的なフラップ除去が必要です。鉗子を摂氏200度で1時間乾熱滅菌にさらすことによって鉗子の消毒から始めます。使用前に、すべてのガラス製品を摂氏121度で15分間オートクレーブします。ランプの額部分を消毒しますamp サンプル領域に約100ミリリットルの200PPM二酸化塩素溶液を注ぎます。電気バリカンを使用して額部分を剃り、続いて200ミリリットルの200PPM二酸化塩素溶液で洗浄します。エタノールと青いロールを使用して領域を拭き、サンプル領域を脱毛クリームで覆います。35分後、掻き取りツールを使用して脱毛クリームをそっとこすり落とし、サンプル領域を評価します。かなりの量の髪が残っている場合は、脱毛プロセスを繰り返します。きれいなサンプル領域を200ミリリットルの二酸化塩素溶液とそれに続くエタノールと青いロールですすいでください。滅菌8ミリメートル生検パンチを使用して、準備された領域から8ミリメートルの皮膚サンプルを切り取ります。次に、滅菌鉗子と15番のブレードメスを使用してサンプルを取り除き、すべての皮膚脂肪が除去されていることを確認します。サンプルを滅菌PBSで満たされた滅菌0.5リットルの瓶に入れます。次に、それらを50ミリリットルの200 PPM二酸化塩素溶液で満たされた滅菌50ミリリットルのチューブに移します。チューブを2回反転させ、30分間滅菌します。サンプルを40ミリリットルの滅菌PBSで満たされた50ミリリットルのチューブに移します。PBS洗浄後、各皮膚サンプルを24ウェルプレートの別々のウェルに入れます。サンプルを気液界面に維持しながら、350マイクロリットルの予熱した培地をウェルに加えます。24ウェルプレートを気体透過性プレートシールで密封してから、5%二酸化炭素、37°Cの加湿組織インキュベーターに24時間インキュベーションします。インキュベーション後、培養液を取り出し、500マイクロリットルの滅菌PBSでサンプルをすすぎます。抗生物質を含まない培地で5%二酸化炭素、摂氏37度で24時間処理することにより、サンプルから残留抗生物質を除去します。抗生物質を含まない培地で濁りや真菌感染症が発生した場合は、サンプルを廃棄してください。次に、10ミリリットルの滅菌トリプシン大豆スープを入れた50ミリリットルのチューブを準備します。次に、黄色ブドウ球菌のコロニーをいくつか黄色ブドウ球菌の新鮮な寒天プレートからブロスに移し、チューブを摂氏37度、150 RPMで18時間インキュベートします。チューブを4, 000 Gで3分間遠心分離した後、上清を取り除き、細胞ペレットを10ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。滅菌PBSを使用して接種材料を600ナノメートルの波長で0.6光学密度に調整する前に、PBS洗浄を2回繰り返します。手動で実行可能なプレートカウントで接種材料の負荷を確認します。皮膚サンプルを感染させるには、400マイクロリットルの予熱した抗生物質を含まない培地を含む新しい24ウェルプレートを準備し、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートを追加します。皮膚サンプルから培地を除去します。500マイクロリットルの滅菌PBSでそれらを洗浄し、洗浄液を取り除きます。滅菌鉗子を使用して、サンプルをウェルの底にそっと保持します。4ミリメートルのパンチ生検を使用して、皮膚サンプルを1〜2ミリメートルの大まかな深さまで突き刺し、中央の創傷フラップを作成します。次に、15番のブレードメスと滅菌歯のアリス組織鉗子を使用して、創傷フラップの最上層を取り除きます。すべてのサンプルが負傷したら、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートに移します。加湿組織インキュベーター内で摂氏37度で24時間インキュベートする前に、15マイクロリットルの細菌接種材料を創傷床にピペットで入れます。インキュベーション期間を長くする場合は、培地を取り出し、24時間ごとに新しい培地と交換し、同じ条件下でプレートをインキュベートします。細菌負荷を決定するには、ウェルの底から培地を取り除きます。そして滅菌鉗子を使用して、各サンプルを1ミリリットルの滅菌PBSで満たされた別々の50ミリリットルのチューブに移します。次に、先端の細かいホモジナイザーでサンプル表面を均質化することにより、創傷床の表面から細菌を剥離します。創傷床がホモジナイザーの先端に直接接触していることを確認してください。すべてのサンプルが処理されたら、各サンプルをボルテックスしてから、20マイクロリットルのホモジネートを180マイクロリットルの滅菌PBSを含む96ウェルプレートの対応するウェルに移します。各サンプルホモジネートを10倍から負7に段階希釈し、希釈したホモジネート10マイクロリットルをトリプティック大豆寒天プレート上に3連でピペットで入れます。トリプシン大豆寒天プレートを摂氏37度でインキュベートし、18時間後に、コロニー数をカウントし、各サンプルのコロニー形成単位またはCFUを決定した。適切な皮膚滅菌レジメンが、さまざまな期間のさまざまな治療を使用して特定されました。.組織の完全性を組織学によってモニターし、続いて治療直後にヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。二酸化塩素による30分間の治療が最も効果的な治療法であり、組織の完全性を維持しながら皮膚組織を再現可能な滅菌を行いました。創傷床の白いフィルムは、感染後48時間で組織に明らかでした。スクラッチモデルは24時間後にCFUの平均数が多くなりましたが、フラップ除去創傷技術はより一貫した結果を生み出しました。48時間後、接種材料と比較して約100倍多くの細菌CFUが創傷組織から回収され、感染が成功したことを示しています。感染組織のグラム染色された組織学切片は、創傷床に黄色ブドウ球菌細胞が存在することを示し、非感染組織の切片には存在しなかった。この手順に続いて、免疫組織化学を実行して組織反応を研究し、グラム染色を修正して細菌の局在を視覚化し、抗菌曝露後の生菌プレート数を実行して抗菌効果をテストできます。新しい抗菌薬を開発する研究者にとって、このモデルは鉛の最適化をより細かく制御し、高価で厳しく規制された動物試験への依存を減らし、抗菌薬の臨床への迅速な翻訳を可能にします。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

監視形成との抗真菌薬感受性試験のための96ウェルマイクロタイタープレートベースの方法カンジダアルビカンスバイオフィルム

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と<em&gt; ex vivoで</em&gt;細胞培養

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

生体内でマウスにおける活性酸素種のイメージング創モデル

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

後部皮下ポリビニルアルコールスポンジの移植と切除テール皮膚創傷モデルを用いた急性創傷治癒の評価

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

細菌性角膜炎に対する薬物治療を研究するためのブタEx Vivoコルネアモデルの確立

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...