Name: a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics at JoVE.com

Forfatterne takker EPSRC (EP/R513313/1) for finansieringen. Forfatterne vil også takke R.B Elliot og Son Abattoir i Calow, Chesterfield, for å gi lammehoder og for å være så imøtekommende i de tidlige stadiene av prosjektet, Kasia Emery for hennes støtte gjennom utviklingen av denne protokollen, og Fiona Wright fra Institutt for infeksjon, immunitet og kardiovaskulær sykdom ved University of Sheffield for å behandle histologiprøvene og være så utrolig nyttig gjennom hele dette prosjektet.

Lammehoder fra R.B Elliott og Son Abattoir ble brukt som kilde til hudprøver i dette prosjektet. Alle lammene ble slaktet for konsum som mat. I stedet for å kaste hodene, ble disse gjenbrukt til forskning. Etisk godkjenning var ikke nødvendig da vevet ble hentet fra avfall som ble kastet fra slakterier.
1. Sterilisering
<ol><li>Desinfiser tang før oppsamling av hodene ved å ta rene tang og utføre tørr varmesterilisering i en ovn ved 200 °C i 1 time. Autoklav alle gla...

<ol>
	<li>Claeys, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+published+risk+factors+for+methicillin-resistant+S.+aureus+in+acute+bacterial+skin+and+skin+structure+infections.">Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).</li><li>Rahim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contribution+in+chronicity+of+wounds.">Bacterial contribution in chronicity of wounds.</a> Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+in+evaluating+management+of+unhealed+surgical+wounds+in+the+community+in+clinical+practice+in+the+UK:+A+cohort+study.">Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study.</a> BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).</li><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+A+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li><li>Wilcox, M. H., Dryden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology+of+healthcare-acquired+bacterial+infections:+Focus+on+complicated+skin+and+skin+structure+infections.">Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).</li><li>Han, G., Ceilley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+healing:+A+review+of+current+management+and+treatments.">Chronic wound healing: A review of current management and treatments.</a> Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).</li><li>Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+tolerance+and+the+significance+of+persister+cells+in+recalcitrant+chronic+wound+biofilms.">Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dheman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+antibacterial+drug+development+trends+in+the+United+States,+1980-2019.">An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019.</a> Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).</li><li>MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+tissue-engineered+skin+and+oral+mucosa+for+clinical+and+experimental+use.">Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+ex+vivo+porcine+skin+explant+model+for+the+assessment+of+mature+bacterial+biofilms.">Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).</li><li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+infection.">Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).</li><li>Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+murine+model+for+delayed+wound+healing+using+a+biological+wound+dressing+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).</li><li>Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+human+tissues+for+research:+What+investigators+need+to+know.">The use of human tissues for research: What investigators need to know.</a> Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).</li><li>Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+human+skin+model+for+studying+skin+barrier+repair.">An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair.</a> Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).</li><li>Torres, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+murine+skin+model+for+B.+burgdorferi+biofilm.">Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm.</a> Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).</li><li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+diabetic+(db/db)+mice+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+challenge:+A+model+for+the+study+of+chronic+wounds.">Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).</li><li>Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+biofilms+impair+wound+healing+by+delaying+reepithelialization+in+a+murine+cutaneous+wound+model.">Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).</li><li>Tr&#248;strup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB/c+mice+in+a+novel+chronic+wound+model.">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li><li>Thompson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gallium+citrate+formulations+against+a+multidrug-resistant+strain+of+Klebsiella+pneumoniae+in+a+murine+wound+model+of+infection.">Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).</li><li>Maboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+skin+explant+model+to+study+anaerobic+bacterial+infection.">A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).</li><li>Macneil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+opportunities+for+tissue-engineered+skin.">Progress and opportunities for tissue-engineered skin.</a> Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).</li><li>Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karl&#233;n, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+preclinical+antibacterial+pipeline.">The global preclinical antibacterial pipeline.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).</li><li>Miethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+sustainable+discovery+and+development+of+new+antibiotics.">Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics.</a> Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).</li><li>Guedes, G. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+situ+model+of+biofilm-associated+wounds:+Providing+a+host-like+environment+for+the+study+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).</li><li>Johnson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+the+activity+of+chlorhexidine+for+decolonization+of+Candida+auris+from+porcine+skin.">Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin.</a> Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).</li><li>Horton, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+auris+Forms+High-Burden+Biofilms+in+Skin+Niche+Conditions+and+on+Porcine+Skin.">Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin.</a> mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).</li><li>Ashrafi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+biofilm+formation+on+human+skin+wound+models+and+demonstration+of+clinically+translatable+bacteria-specific+volatile+signatures.">Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures.</a> Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).</li><li>Brackman, G., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biofilm+wound+models+and+their+application.">In vitro and in vivo biofilm wound models and their application.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Models+of+Biofilm+Infection.">In Vivo Models of Biofilm Infection.</a> Biofilm Infections. , 267-290 (2011).</li><li>Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sheep+model+to+investigate+the+role+of+fungal+biofilms+in+sinusitis:+Fungal+and+bacterial+synergy.">A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).</li><li>Williams, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+biofilm+implant-related+osteomyelitis+to+test+combination+biomaterials+using+biofilms+as+initial+inocula.">Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).</li><li>Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+sheep+models:+From+asthma+to+vaccines.">Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines.</a> Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).</li><li>Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+replacement+skin:+The+crossroads+of+biomaterials,+wound+healing,+embryonic+development,+stem+cells+and+regeneration.">Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration.</a> Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).</li><li>Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogenous+skin+fibroblast+transplantation+enhances+excisional+wound+healing+following+alloxan+diabetes+in+sheep,+a+randomized+controlled+trial.">Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial.</a> International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).</li><li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+mesenchymal+stem+cells+improve+the+wound+healing+process+of+sheep+skin.">Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).</li><li>Roberts, C. D., Windsor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+pain+management+solutions+in+animals+may+provide+improved+wound+pain+reduction+during+debridement+in+humans:+An+opinion+informed+by+veterinary+literature.">Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature.</a> International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).</li><li>Mazzone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+and+in+utero+transplantation+of+fetal+skin+in+the+sheep+model:+A+crucial+step+towards+clinical+application+in+human+fetal+spina+bifida+repair.">Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).</li><li>Olkowska, E., Gr&#382;ini&#263;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates.">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909 (2022).</li><li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model.">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li></ol>

Utviklingen av antimikrobielle midler er et viktig, men dyrt venture som anslås å koste rundt 1 milliard dollar og ta rundt 15 år å fullføre. Over 90% av antimikrobiell legemiddeloppdagelse og prekliniske studier av antimikrobiell legemiddeleffekt utføres av akademiske forskere og små og mellomstore bedrifter med typisk mindre enn 50 ansatte22. Disse lagene er svært økonomisk begrenset, noe som gjør svikt i blymolekyler i senere stadier av translasjonsforskning katastrofal. Økningen i a...

Hudinfeksjoner er et viktig globalt problem, med store økonomiske kostnader for helsepersonell over hele verden. Utvikling av multiresistens og biofilmdannelse av patogener spiller en nøkkelrolle i forekomsten av ikke-helbredende sår 1,2,3,4. Som et resultat av dette er hud- og bløtvevsinfeksjoner en av de vanligste årsakene til utvidet sykehusinnleggelse og påfølgende reinnleggelse5. Forsinkelser i sårheling er kostbare for både pasienten og helsepersonell, med noen estimater som tyder på at rundt 6,5 millioner pasienter påvirkes årlig i USA. I Storbritannia resulterer hudinfeksjoner og tilhørende komplikasjoner i omtrent 75 000 dødsfall årlig 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) er et formidabelt sårpatogen som ofte isoleres fra pasientsår 2,7. Fremveksten av multiresistens økte drastisk på 2000-tallet. I løpet av denne tiden var rundt 60% av akutte bakterielle hud- og hudstrukturinfeksjoner dyrkningspositive for meticillinresistente S. aureus1. Det økende antallet multiresistente stammer blant stafylokokker, og faktisk andre patogener, i løpet av de siste 2 tiårene indikerer et presserende behov for rask utvikling av antibiotika med nye virkningsmåter som kan overvinne resistens.
Siden begynnelsen av 2000-tallet har imidlertid antibiotikaoppdagelsesprogrammer blitt dominert av lengre utviklingstider og lave suksessrater, med bare 17% av nye antibiotika som går inn i kliniske studier i USA og oppnår markedsgodkjenning8. Dette antyder en forskjell mellom resultater fra in vitro-testing av nye antibiotika og deres kliniske resultater. Det kan hevdes at denne forskjellen i stor grad skyldes forskjeller i bakteriell fysiologi under infeksjoner in vivo og under konvensjonelle mikrobiologiske metoder ved testing av effekten av antibiotika i in vitro prekliniske stadier. Derfor er det behov for nye laboratoriemetoder som er mer representative for bakteriell fysiologi under infeksjon for å forbedre suksessraten i antibiotikaoppdagelsesprogrammer.
Nåværende metoder for å studere hudinfeksjoner inkluderer studier på levende dyr (f.eks. Mus), ex vivo hudmodeller (f.eks. Svin) og 3D-vevskonstruerte hudmodeller (f.eks. Menneske)9,10,11,12. Studier på levende dyr er strengt regulert og har relativt lav gjennomstrømning. I dyremodeller forårsaker sår og infeksjon betydelig nød for dyrene og reiser etiske bekymringer. Menneskelige hudmodeller, ex vivo eller vevskonstruerte, krever etisk godkjenning, overholdelse av lokal og global lovgivning (Human Tissue Act, Helsinkideklarasjonen), og det er vanskelig å skaffe vev, med noen forespørsler som tar år å oppfylle13,14. Begge modelltypene er arbeidsintensive og krever betydelig kompetanse for å sikre eksperimentell suksess. Noen nåværende ex vivo hudinfeksjonsmodeller krever pre-inokulerte plater og tilsetningsstoffer for sårsengen for å muliggjøre infeksjon; Selv om disse modellene er utrolig nyttige, er det begrensninger i infeksjonsprosessen da tilsetningsstoffer begrenser bruken av sårbunnen som næringskilde10,15,16,17. Modellen beskrevet i denne studien bruker ingen tilsetningsstoffer til sårbunnen, noe som sikrer at infeksjonspatologien og levedyktige celletall er et resultat av direkte utnyttelse av sårbunnen som eneste næringskilde.
Gitt behovet for nye laboratoriemetoder, er det utviklet en ny høy gjennomstrømning ex vivo ovine modell av hudinfeksjoner til bruk for å evaluere effekten av nye antibiotika. Hudinfeksjonsstudier står overfor mange utfordringer - høye kostnader, etiske bekymringer og modeller som ikke viser et fullstendig bilde20,21. Ex vivo-modeller og 3D-eksplantasjonsmodeller gir bedre visualisering av sykdomsprosessen, og effekten behandlinger kan ha fra en mer klinisk relevant modell. Her beskrives oppsettet av en ny saueskinnsmodell, som er enkel, reproduserbar og klinisk relevant og har høy gjennomstrømning. Saueskinn ble valgt som sau er et av de store pattedyrene som vanligvis brukes til å modellere responser på infeksjoner in vivo. Dessuten er de lett tilgjengelige fra slakterier, noe som sikrer en jevn tilførsel av hud til forskning, og deres blir ikke skoldet, noe som sikrer god vevskvalitet. Denne studien brukte S. aureus som eksemplarisk patogen; Modellen fungerer imidlertid bra med andre mikroorganismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Companion Plate</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution, sterile</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colour Pro Style Cordless Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9639-2117X</td>
			<td>Hair Clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>458600-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Removal Cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212&#160;</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, Handheld</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, plastic blending cones</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15585819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert Individual 24 well 0.4um membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (MK media)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, cell culture Costar 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ESI-B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Allis Tissue Forceps</td>
			<td>Rocialle</td>
			<td>RSPU500-322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>14432-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>41298-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimoba Tablets</td>
			<td>Quip Labs</td>
			<td>VMTAB75BX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics

Utviklingen av antimikrobielle midler er en kostbar prosess med stadig lavere suksessrate, noe som gjør videre investeringer i antimikrobiell oppdagelsesforskning mindre attraktiv. Antimikrobiell legemiddeloppdagelse og påfølgende kommersialisering kan gjøres mer lukrativ hvis en fail-fast-and-fail-cheap tilnærming kan implementeres innenfor de ledende optimaliseringsstadiene der forskere har større kontroll over stoffdesign og formulering. I denne artikkelen beskrives oppsettet av en ex vivo ovine såret hudmodell infisert med Staphylococcus aureus, som er enkel, kostnadseffektiv, høy gjennomstrømning og reproduserbar. Bakteriefysiologien i modellen etterligner at under infeksjon som bakteriell spredning er avhengig av patogenets evne til å skade vevet. Etableringen av sårinfeksjon verifiseres ved en økning i levedyktige bakterietall sammenlignet med inokulum. Denne modellen kan brukes som en plattform for å teste effekten av nye antimikrobielle stoffer i blyoptimaliseringsstadiet. Det kan hevdes at tilgjengeligheten av denne modellen vil gi forskere som utvikler antimikrobielle stoffer med en fail-fast-and-fail-cheap modell, noe som vil bidra til å øke suksessraten i påfølgende dyreforsøk. Modellen vil også legge til rette for reduksjon og forbedring av dyrebruk for forskning og til slutt muliggjøre raskere og mer kostnadseffektiv oversettelse av nye antimikrobielle stoffer for hud- og bløtvevsinfeksjoner til klinikken.

Identifiseringen av en måte å sterilisere huden på før man satte opp sårinfeksjonsmodellen var utfordrende. Utfordringen lå i å sterilisere huden uten å skade de forskjellige hudlagene, som deretter kan få utilsiktede konsekvenser i utfallet av infeksjon. For å identifisere et passende steriliseringsregime ble ulike behandlinger prøvd i varierende tidsperioder, som beskrevet i tabell 1. Forurensning ble registrert som utvikling av turbiditet etter 48 timer i MK-mediet som ble brukt til å oppr...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics at JoVE.com

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Protokollen beskriver en trinnvis metode for å sette opp en ex vivo sau såret hudmodell infisert med Staphylococcus aureus. Denne høykapasitetsmodellen simulerer infeksjoner in vivo bedre sammenlignet med konvensjonelle mikrobiologiteknikker og presenterer forskere med en fysiologisk relevant plattform for å teste effekten av nye antimikrobielle stoffer.

En ny høy gjennomstrømning ex vivo ovine hud sårmodell for testing av nye antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Denne modellen vil tillate forskerne i de kritiske prekliniske stadiene å bestemme den antimikrobielle effekten av nye formuleringer mer nøyaktig, og gir forskerne større kontroll over stoffdesign og formulering. Denne modellen muliggjør raske reproduserbare resultater i et representativt sårmiljø. Det reduserer behovet for spesialavlede dyr, og letter raskere oversettelse av aktuelle antimikrobielle stoffer for sårinfeksjoner til klinikken.Hovedutfordringene er forurensning og fingerferdighet. En streng aseptisk teknikk og tålmodighet med vevsbehandling er avgjørende, presis og målrettet fjerning av klaff er nødvendig for å lykkes med denne metoden. Begynn med desinfeksjon av tang ved å utsette dem for tørr varmesterilisering ved 200 grader Celsius i en time.Autoklav alle glass ved 121 grader Celsius i 15 minutter før bruk. Desinfiser panneseksjonen av lampen ved å helle ca. 100 ml 200 PPM klordioksidoppløsning på prøveområdet. Barber panneseksjonen ved hjelp av elektriske klippere, etterfulgt av en vask med 200 milliliter 200 PPM klordioksidløsning.Tørk av området med etanol og en blå rull, og dekk prøveområdet med hårfjerningskrem. Etter 35 minutter skraper du forsiktig av hårfjerningskremen ved hjelp av et skrapeverktøy og vurderer prøveområdet. Gjenta hårfjerningsprosessen hvis en betydelig mengde hår forblir.Skyll det rene prøveområdet med 200 ml klordioksidløsning etterfulgt av etanol og en blå rulle. Bruk en steril åtte millimeter biopsistans for å kutte ut en åtte millimeter hudprøve fra det forberedte området. Fjern deretter prøven med steril tang og skalpell nummer 15, slik at alt kutant fett fjernes.Plasser prøvene i en steril 0,5 liters krukke fylt med steril PBS. Overfør dem deretter til sterile 50 milliliter rør fylt med 50 milliliter 200 PPM klordioksidoppløsning. Inverter røret to ganger og la det sterilisere i 30 minutter.Overfør prøvene til et 50 milliliter rør fylt med 40 milliliter steril PBS. Etter PBS-vask, legg hver hudprøve i en separat brønn på en 24-brønns plate. Tilsett 350 mikroliter av det forvarmede mediet i en brønn, mens du opprettholder prøven ved luft-væske-grensesnittet.Forsegl platene med 24 brønner med en gasspermeabel platetetning før du plasserer platen for inkubering i en fuktet vevsinkubator ved 5% karbondioksid og 37 grader Celsius i 24 timer. Etter inkubasjon, fjern kulturmediet og skyll prøvene i 500 mikroliter steril PBS. Fjern resterende antibiotika fra prøven ved å behandle dem med antibiotikafrie medier ved 5% karbondioksid og 37 grader Celsius i 24 timer.Hvis turbiditet eller soppinfeksjon utvikler seg i antibiotikafrie medier, kast prøven. Deretter tilbereder du et 50 milliliter rør med 10 milliliter steril tryptisk soyabuljong. Overfør deretter flere Staphylococcus aureus-kolonier fra en fersk agarplate av S.aureus til buljongen, og inkuber røret ved 37 grader Celsius og 150 RPM i 18 timer.Etter sentrifugering av rørene ved 4.000 G i tre minutter, fjern supernatanten og resuspend cellepelleten i 10 ml steril PBS. Gjenta PBS-vasken to ganger før du justerer inokulumet til 0,6 optisk tetthet ved 600 nanometer bølgelengder ved bruk av steril PBS. Bekreft inokulumbelastningen med et manuelt levedyktig plateantall.For å infisere hudprøven, lag en fersk 24-brønnsplate med 400 mikroliter forvarmede antibiotikafrie medier, og tilsett de 24 brønninnsatsene ved hjelp av sterile tang. Fjern mediet fra hudprøvene. Vask dem med 500 mikroliter steril PBS og fjern vasken.Bruk steril tang til å holde prøven forsiktig til bunnen av brønnen. Bruk en fire millimeter stansebiopsi for å stikke gjennom hudprøven til en grov dybde på en til to millimeter og lage en sentral sårklaff. Bruk deretter en nummer 15 bladskalpell og steriltannet Allis vevstang for å fjerne det øverste laget av sårklaffen.Når alle prøvene er såret, overføres de til de 24 brønninnsatsene med steril tang. Pipette 15 mikroliter av bakteriell inokulum i sårsengen før inkubering i 24 timer ved 37 grader Celsius i en fuktet vevsinkubator. For lengre inkubasjonsperioder, fjern mediet, erstatt det med ferske medier hver 24. time, og inkuber platene under de samme forholdene.For å bestemme bakteriebelastningen, fjern mediet fra bunnen av brønnene. Og ved hjelp av sterile tang, overfør hver prøve til et eget 50 milliliter rør fylt med en milliliter steril PBS. Løsne deretter bakteriene fra overflaten av sårsengen ved å homogenisere prøveoverflaten med en finspisset homogenisator.Sørg for at sårsengen er i direkte kontakt med spissen av homogenisatoren. Når alle prøvene er behandlet, vortex hver prøve før du overfører 20 mikroliter homogenat til den tilsvarende brønnen på en 96-brønnsplate som inneholder 180 mikroliter steril PBS. Fortynn serielt hvert prøvehomogenat til 1 ganger 10 til det negative 7, og pipette 10 mikroliter av det fortynnede homogenatet på en tryptisk soya agarplate i tre eksemplarer.Inkuber Tryptic Soy Agar-platen ved 37 grader Celsius, og etter 18 timer, telle antall kolonier for å bestemme kolonidannende enheter eller CFU for hver prøve. Et passende hudsteriliseringsregime ble identifisert ved hjelp av forskjellige behandlinger i varierende tidsperioder. Vevsintegritet ble overvåket med histologi, etterfulgt av farging med hematoksylin og eosin umiddelbart etter behandlingen.En 30-minutters behandling med klordioksid var den mest effektive behandlingen, med reproduserbar sterilisering av hudvevet samtidig som vevets integritet ble bevart. En hvit film i sårsengen var tydelig på vevet 48 timer etter infeksjon. Selv om scratch-modellen hadde et høyere gjennomsnittlig antall CFUer etter 24 timer, ga klafffjerningssårteknikken mer konsistente resultater.Etter 48 timer ble omtrent 100 ganger flere bakterielle CFUer gjenopprettet fra det sårede vevet sammenlignet med inokulumet, noe som indikerer en vellykket infeksjon. Gramfargede histologiseksjoner av det infiserte vevet indikerte tilstedeværelsen av S.aureus-celler i sårsengen, som var fraværende i seksjonene av uinfisert vev. Etter denne prosedyren kan man utføre immunhistokjemi for å studere vevsrespons, modifisert gramflekk for å visualisere bakteriell lokalisering og levedyktige platetall etter antimikrobiell eksponering for å teste antimikrobiell effekt.For forskerne som utvikler nye antimikrobielle stoffer, vil denne modellen gi større kontroll over blyoptimalisering, redusere avhengigheten av dyre og tett regulerte dyreforsøk, og muliggjøre rask oversettelse av antimikrobielle stoffer til klinikken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Method for influensavirus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyttisolasjonsmetoder fra menneskelig hud for fenotypeanalyser og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Høy gjennomstrømning, Real-time, Dual-avlesning Testing av intracellulær antimikrobiell aktivitet og eukaryote celle Cytotoksisitet

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

En roman In Vitro sår helbredelse analysen for å vurdere celle migrasjon

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

I Vivo Avbildning av reaktive oksygen arter i et murint sår modell

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Vurdering av akutt sårheling ved hjelp av Dorsal Subkutan Polyvinyl Alkohol Svamp Implantation og Excisional Tail Skin Wound Modeller.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Etablere en svin Ex Vivo Cornea modell for å studere narkotika behandlinger mot bakteriell keratitt

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...