Name: implementation of minimally invasive brain tumor resection in rodents for high viability tissue collection
Uploaded: 2022-05-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Minimally Invasive Brain Tumor Resection in Rodents for High Viability Tissue Collection at JoVE.com

Todos os estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Maryland e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins. Foram utilizados para o presente estudo camundongos C57BL/6, de 6 a 8 semanas de idade. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Todos os regulamentos de Biossegurança Nível 2 (BSL-2) foram seguidos, incluindo o uso de máscaras, luvas e vestidos.
1. Implantação ...

<ol>
	<li>Mineo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+factors+of+survival+time+in+patients+with+glioblastoma+multiforme:+a+multivariate+analysis+of+340+patients.">Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients.</a> Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).</li><li>Miyai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+trends+in+mouse+models+of+glioblastoma.">Current trends in mouse models of glioblastoma.</a> Journal of Neuro-Oncology. 135 (3), 423-432 (2017).</li><li>Raj, D., Agrawal, P., Gaitsch, H., Wicks, E., Tyler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+strategies+for+improving+the+prognosis+of+glioblastoma.">Pharmacological strategies for improving the prognosis of glioblastoma.</a> Expert Opinion on Pharmacotherapy. 22 (15), 2019-2031 (2021).</li><li>Alomari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+repurposing+for+Glioblastoma+and+current+advances+in+drug+delivery-a+comprehensive+review+of+the+literature.">Drug repurposing for Glioblastoma and current advances in drug delivery-a comprehensive review of the literature.</a> Biomolecules. 11 (12), 1870 (2021).</li><li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+intracranial+Acriflavine,+temozolomide+and+radiation+extends+survival+in+a+rat+glioma+model.">Combined intracranial Acriflavine, temozolomide and radiation extends survival in a rat glioma model.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics : Official Journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 170, 179-186 (2022).</li><li>Tang, B., Foss, K., Lichtor, T., Phillips, H., Roy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+orthotopic+murine+brain+glioma.">Resection of orthotopic murine brain glioma.</a> Neuroimmunology and Neuroinflammation. 8 (1), 64-69 (2021).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging.">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).</li><li>Poussard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+systems+(IVIS)+detection+of+a+neuro-invasive+encephalitic+virus.">In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).</li><li>Lachin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+statistical+analysis.">Nonparametric statistical analysis.</a> JAMA. 323 (20), 2080-2081 (2020).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods in Molecular Biology. 740, 7-12 (2011).</li><li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+drug+screening+system+for+the+identification+of+small+molecules+that+promote+cellular+differentiation+of+Glioblastoma+stem+cells.">Flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of Glioblastoma stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56176 (2018).</li><li>Rodgers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+histology+of+an+entire+mouse+brain+from+formalin+fixation+to+paraffin+embedding.+Part+2:+Volumetric+strain+fields+and+local+contrast+changes.">Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 2: Volumetric strain fields and local contrast changes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 365, 109385 (2022).</li><li>Connolly, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+fibroblast+growth+factor-inducible+14+expression+transforms+proneural-like+gliomas+into+more+aggressive+and+lethal+brain+cancer.">Elevated fibroblast growth factor-inducible 14 expression transforms proneural-like gliomas into more aggressive and lethal brain cancer.</a> GLIA. 69 (9), 2199-2214 (2021).</li><li>Stall, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T2+and+FLAIR+imaging+for+target+delineation+in+high+grade+gliomas.">Comparison of T2 and FLAIR imaging for target delineation in high grade gliomas.</a> Radiation Oncology. 5, 5 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+standardized+method+for+the+effective+intraoperative+collection+and+biological+preservation+of+brain+tumor+tissue+samples+using+a+novel+tissue+preservation+system:+a+pilot+study.">Establishing a standardized method for the effective intraoperative collection and biological preservation of brain tumor tissue samples using a novel tissue preservation system: a pilot study.</a> World Neurosurgery. , (2022).</li><li>Zusman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissues+harvested+using+an+automated+surgical+approach+confirm+molecular+heterogeneity+of+Glioblastoma+and+enhance+specimen's+translational+research+value.">Tissues harvested using an automated surgical approach confirm molecular heterogeneity of Glioblastoma and enhance specimen's translational research value.</a> Frontiers in Oncology. 9, (2019).</li><li>McLaughlin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side-cutting+aspiration+device+for+endoscopic+and+microscopic+tumor+removal.">Side-cutting aspiration device for endoscopic and microscopic tumor removal.</a> Journal of Neurological Surgery Part B. 73 (1), 11-20 (2012).</li></ol>

A ressecção tumoral é uma pedra angular dos planos de tratamento de oncologia neurocirúrgica para tumores cerebrais de baixo grau e de alto grau. A citoredução e a debulição do tumor se correlacionam com a melhora da função neurológica e a sobrevida geral em pacientes com tumores cerebrais 1,2,5,6. Embora os protocolos de ressecção cirúrgica tenham sido descritos anteriormente em ...

Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e agressivo em adultos. Apesar dos recentes avanços na neurocirurgia, no desenvolvimento de medicamentos direcionados e na radioterapia, a taxa de sobrevivência de 5 anos para pacientes com GBM é inferior a 5%, uma estatística que não melhorou significativamente em mais de três décadas1. Por isso, há necessidade de estratégias de tratamento mais eficazes.
Para desenvolver novas terapias, torna-se cada vez mais evidente que os protocolos de investigação precisam (1) utilizar modelos preclínicos traduzíveis que recapitulem com precisão a heterogeneidade e microambiente tumoral, (2) espelham o regime terapêutico padrão utilizado em pacientes com GBM, que atualmente inclui cirurgia, radioterapia e quimioterapia, e (3) explicam a diferença entre núcleo ressecado e residual, que atualmente inclui cirurgia, radioterapia e quimioterapia, e (3) explicam a diferença entre núcleo ressecado e residual, residual, tecidos tumorais invasivos 2,3,4,5. No entanto, a maioria dos modelos de tumor cerebral pré-clínicos atualmente disponíveis não implementam ressecção cirúrgica ou utilizam modelos de ressecção cirúrgica que são relativamente demorados, levando a uma quantidade significativa de perda de sangue ou falta de padronização. Além disso, a realização da ressecção de tumores cerebrais de roedores pode ser desafiadora devido à falta de ferramentas ou protocolos cirúrgicos clinicamente comparáveis e à ausência de uma plataformaestabelecida 6 para coleta sistemática de tecidos (Tabela 1).
O presente protocolo visa descrever um paradigma padronizado para ressecção do tumor cerebral de roedores e preservação do tecido utilizando um sistema de ressecção minimamente invasivo não ablativo multifuncional (MIRS) e um sistema integrado de preservação de tecidos (TPS) (Figura 1). Espera-se que essa técnica única forneça uma plataforma padronizada que possa ser utilizada em diversos estudos em pesquisas pré-científicas para GBM e outros tipos de modelos de tumor cerebral. Pesquisadores que investigam modalidades terapêuticas ou diagnósticas para tumores cerebrais podem implementar esse protocolo para alcançar uma ressecção padronizada em seus estudos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>PharmCo</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipettes</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SIG-SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL)</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia System</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78935903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesic Gas Waste Container</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78909457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench protector underpad</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>10328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6, 6-8 week old mice</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>Strain Code 027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChroMini Pro</td>
			<td>Moser</td>
			<td>Type 1591-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase-Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Hemacytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debris Removal Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>#130-109-398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12 media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Posi-Click</td>
			<td>1149K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>71073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>101-4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>PeproTech EC</td>
			<td>100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hFGF-b</td>
			<td>PeproTech EC</td>
			<td>1001-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78933388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Patterson Scientific</td>
			<td>78916954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695-0703-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Stereotactic frame</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightfield Microscope</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection Unit</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromotor drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>F210418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI system</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>7T Biospec Avance III MRI Scanner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NICO Myriad System</td>
			<td>NICO Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube vet ointment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>N1638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;#P4937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>A07260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>52380-1905-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-72400120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>7319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin marker</td>
			<td>Time Out</td>
			<td>D538,851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staple remover</td>
			<td>MikRon</td>
			<td>ACR9MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler</td>
			<td>MikRon</td>
			<td>ACA9MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staples</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic Frame</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, vicryl 4-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J494H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 culture flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3911-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BP10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MDT-25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of minimally invasive brain tumor resection in rodents for high viability tissue collection

O presente protocolo descreve um paradigma padronizado para ressecção do tumor cerebral de roedores e preservação de tecidos. Na prática clínica, a ressecção máxima do tumor é o tratamento padrão de cuidados para a maioria dos tumores cerebrais. No entanto, os modelos de tumor cerebral pré-clínicos mais disponíveis atualmente não incluem ressecção, ou utilizam modelos de ressecção cirúrgica que consomem tempo e levam a morbidade, mortalidade ou variabilidade experimental significativas pós-operatórias. Além disso, a realização da ressecção em roedores pode ser assustadora por várias razões, incluindo a falta de ferramentas cirúrgicas ou protocolos clinicamente comparáveis e a ausência de uma plataforma estabelecida para coleta padronizada de tecidos. Este protocolo destaca o uso de um dispositivo de ressecção multifuncional e não ablativo e um sistema integrado de preservação de tecidos adaptado da versão clínica do dispositivo. O dispositivo aplicado no presente estudo combina sucção tífica e uma lâmina cilíndrica na abertura para precisamente sondar, cortar e tecido de sucção. O dispositivo de ressecção minimamente invasivo executa suas funções através do mesmo orifício de rebarba usado para a implantação inicial do tumor. Essa abordagem minimiza alterações na anatomia regional durante cirurgias de biópsia ou ressecção e reduz o risco de perda significativa de sangue. Esses fatores reduziram significativamente o tempo de operação (<2 min/animal), melhoraram a sobrevivência animal pós-operatória, reduziram a variabilidade em grupos experimentais e resultaram em alta viabilidade de tecidos e células ressecadas para análises futuras. Este processo é facilitado por uma velocidade da lâmina de ~1.400 ciclos/min, o que permite a colheita de tecidos em um sistema fechado estéril que pode ser preenchido com uma solução fisiológica de escolha. Dada a importância emergente de estudar e modelar com precisão o impacto da cirurgia, preservação e rigorosa análise comparativa de amostras de ressecção de tumores regionalizadas e terapêuticas fornecidas por intra-cavidade, este protocolo único ampliará as oportunidades de explorar questões sem resposta sobre o manejo perioperatório e a descoberta terapêutica para pacientes com tumor cerebral.

A ressecção cirúrgica utilizando o MIRS resulta em uma diminuição significativa da carga tumoral No grupo com menor carga tumoral, o sinal bioluminescente médio da linha de base foi de 5,5e+006 fótons/s ± 0,2e+006 no subgrupo submetido à ressecção. Após a ressecção, o sinal bioluminescente médio diminuiu para 3,09e+006 fótons/s ± 0,3e+006, (p <0.0001, teste de Mann-Whitney)9 (Figura 2). O sinal biolumines...

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Implementation of Minimally Invasive Brain Tumor Resection in Rodents for High Viability Tissue Collection

O presente protocolo descreve uma ressecção padronizada de tumores cerebrais em roedores através de uma abordagem minimamente invasiva com um sistema integrado de preservação de tecidos. Esta técnica tem implicações para espelhar com precisão o padrão de cuidado em roedores e outros modelos animais.

Implementação de ressecção de tumor cerebral minimamente invasiva em roedores para coleta de tecido de alta viabilidade

The present protocol describes a standardized paradigm for rodent brain tumor resection and tissue preservation. In clinical practice, maximal tumor ...

Este é um paradigma de ressecção de tumor cerebral que é altamente necessário em pesquisas pré-clínicas sobre terapêutica para tumores cerebrais. Permite uma ressecção padronizada através de uma abordagem minimamente invasiva, enquanto, ao mesmo tempo, também é acoplado a um sistema automatizado de preservação de tecidos. Esse protocolo permite que o animal sobreviva após a cirurgia e, assim, auxilia na compreensão das mudanças no estado da doença após a terapia no mesmo animal.Isso ajuda em aplicações terapêuticas sequenciais e de lapso de tempo. Utilizando essa técnica, podemos avaliar a biologia da doença e planejar uma possível gestão subsequente. Isso tem implicações e oportunidades significativas na descoberta de drogas e novas terapêuticas.Os conceitos de ressecção padronizada, uma abordagem minimamente invasiva e preservação automatizada de tecidos podem ser estendidos a outros tipos de tumores em diferentes sistemas de órgãos, como tumores hepáticos e cânceres de cabeça e pescoço. O protocolo é simples e o sistema é fácil de usar. É melhor ler o protocolo publicado, que contém todas as etapas necessárias e solução de problemas.Comece o experimento avaliando o mouse para sedação beliscando o dedo do dedo do sol. Aplique pomada oftalmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. Em seguida, coloque o mouse em uma moldura estereotática.Remova o grampo da cirurgia anterior e desinfete a pele com ciclos alternados de um esfoliante à base de clorexidina ou betaina e álcool. Em seguida, crie uma incisão longitudinal de um centímetro ao longo da cicatriz cirúrgica anterior usando um bisturi estéril. Conecte a peça da mão MIRS ao braço estereotático através do adaptador de palco.Para configurar a máquina MIRS, insira o cabo de alimentação no painel traseiro no recipiente do cabo de alimentação. Ligue ou desligue a energia do sistema, toggling entre zero e um. Insira uma extremidade da mangueira de nitrogênio no encaixe masculino no painel traseiro do console.Gire a porca de conexão no sentido horário para apertá-la. Certifique-se de que a pressão de alimentação não exceda 100 PSIG e conecte a mangueira ao suprimento de nitrogênio. Sele a tampa da porta de vácuo para evitar qualquer vazamento.Verifique se o botão de aspiração na parte frontal do console está definido em 100, que não há vazamento no sistema de aspiração, e que a pressão de fornecimento de entrada de nitrogênio está correta. Insira o conector do pedal do pé cinza em seu recipiente cinza até que ele clique. Da mesma forma, insira o conector de peça de mão azul em seu recipiente azul.Prime cada peça de mão aspirando fluido estéril na abertura através da tubulação e peça de mão e, em seguida, para dentro do recipiente para garantir que o interior do tubo e a peça de mão sejam lubrificados. Selecione o modo para aspiração no painel frontal do console e inicie usando o pedal do pé. Insira a cânula MIRS de 23 G no orifício da rebarba a uma profundidade de 2,5 milímetros.Inicie o processo de ressecção pressionando o pedal do pé conectado à cânula. Realize ciclos completos de ressecção usando o botão de controle na peça de mão. Após o processo de ressecção, retire a cânula MIRS de calibre 23 e adicione cinco mililitros de 1X PBS para lavar o tubo e desalojar quaisquer detritos residuais.Em seguida, feche a ferida com um grampeador e remova o mouse do quadro estereotático. Devolva o mouse ao bloco de aquecimento para se recuperar da anestesia antes de colocá-lo de volta em sua gaiola. Após o experimento, purga a cânula com mídia gelada e ar para empurrar todo o tecido ressecado de volta para o recipiente de coleta.Remova o recipiente de coleta do sistema e coloque uma tampa. Em seguida, coloque a ponta distal da cânula em peróxido de hidrogênio de 3% e aplique sucção para preencher a linha de sucção de volta ao recipiente de coleta de sucção. Deixe-o ficar de pé por 60 a 90 segundos e pulso intermitente ar e mídia para lavá-lo.Mergulhe a amostra de tumor em um prato de cultura tecidual contendo meio de lise RBC por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, coloque um filtro de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros e use um êmbolo de seringa para passar a amostra do tumor através do filtro. Com uma pipeta de transferência, use a mídia RPMI 1640 para passar as células e qualquer massa tecidual através do filtro.Centrifugar a 428 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque cada amostra em cinco mililitros de meio RPMI 1640 preparado. Coloque as amostras em uma incubadora de shaker por 20 minutos a 200 RPM a 37 graus Celsius.Após a incubação, centrifufique as amostras a 428 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o supernaspe. Filtre células únicas através de um coador de células de 70 mícrons e centrífuga a 274 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius. Realizar análise de viabilidade celular com azul trypan e hemótmetro.A ressecção cirúrgica em camundongos que utilizam MIRS causou uma diminuição significativa da carga tumoral, conforme indicado pela redução do sinal bioluminescente médio para grupos com carga tumoral grande e pequena. Em comparação com as imagens de ressonância magnética pré-ressecção dos tumores, a cavidade de ressecção pode ser identificada nos exames pós-ressecção como uma grande área de hipointense redondo no local da inoculação do tumor. Nas seções manchadas de H&E, observou-se uma cavidade de ressecção circular clara com uma borda de produtos sanguíneos, inflamação e células tumorais residuais.O volume de ressecção aumentou significativamente quando foram realizadas duas rotações da abertura de corte, o que permitiu a otimização do volume de ressecção conforme a carga tumoral. A comparação da sobrevida em camundongos com tumores não tratados versus camundongos submetidos à ressecção de tumores pelo MIRS mostrou um aumento na sobrevida de 16 a 22 dias no pequeno grupo tumoral. Da mesma forma, no grupo com maior carga tumoral, a sobrevida mediana aumentou de 12 para 19 dias.Imagens leves de microscopia das amostras retiradas do sistema de preservação do tecido apareceram como células únicas com a presença de alguns pequenos pedaços de tecido no dia zero. Após sete dias, as células colhidas com MIRS apresentaram formação da neurosfera em culturas de suspensão, o que indicou seu potencial de iniciação tumoral. É importante limpar e lavar o sistema de tubos logo após o procedimento para evitar um entupimento do sistema.Após esse procedimento, estudos de eficácia de terapêuticas e estudos sobre marcadores diagnósticos e prognósticos podem ser utilizados em animais sobreviventes após a ressecção cirúrgica com o sistema de ressecção minimamente invasivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Pesquisa do câncer

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

A aplicação clínica do Tumor, tratamento de terapia de campos em Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Medição da resposta de drogas em tempo real em fatias de tecido tumoral organotípico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...