Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

يتم تمويل NS من قبل منحة اليوبيل الماسي لمجلس الجامعة. يتم دعم JJP من خلال زمالة UKRI Future Leaders [رقم المنحة: MR/T02223X/1].

1. التعبير عن البروتين وتنقية aSyn
<ol><li>قم بإعداد aSyn بعد تقرير نشر مسبقا9.</li>
	<li>قم بالتحويل إلى مخزن مؤقت آمن للتخزين (على سبيل المثال ، Tris ، الرقم الهيدروجيني 7.2 ).</li>
	<li>إذا لزم الأمر، ركز العينة (على سبيل المثال، أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ذات المرشح المغزلي باس...

في هذه المقالة ، يتم وصف الإجراءات التالية: (1) إجراء تجارب رسم خرائط الببتيد على aSyn الأحادي للحصول على أعلى تغطية تسلسلية ، (2) الحصول على بيانات HDX-MS بالمللي ثانية على aSyn الأحادي في ظل الظروف الفسيولوجية ، و (3) إجراء تحليل البيانات وتفسير بيانات HDX-MS الناتجة. الإجراءات المقدمة سهلة التنفيذ بش...

مرض باركنسون (PD) هو مرض تنكسي عصبي يؤثر على ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم1. يتميز بتكوين شوائب سيتوبلازمية تعرف باسم أجسام ليوي وعصب ليوي في المادة السوداء في الدماغ في منطقة كومباكتا. وقد وجد أن هذه الشوائب السيتوبلازمية تحتوي على مجاميع من البروتين المضطرب جوهريا aSyn2. في PD وغيرها من اعتلالات synucleinopathies ، يتحول aSyn من حالة مضطربة قابلة للذوبان إلى حالة مرضية غير قابلة للذوبان وعالية الهيكلة. في شكله الأصلي ، يعتمد aSyn الأحادي مجموعة واسعة من التكوينات المستقرة من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية طويلة المدى بين التفاعلات N- و C-termini والتفاعلات الكارهة للماء بين منطقة C-terminus ومكون بيتا غير الأميلويد (NAC)3،4،5،6. أي اضطرابات في تلك التفاعلات المستقرة، مثل الطفرات، والتعديلات اللاحقة للترجمة، والتغيرات في البيئة المحلية، يمكن أن تؤدي إلى سوء طي المونومر، وبالتالي إطلاق عملية التجميع7.
في حين أن هناك قدرا هائلا من الأبحاث حول الأشكال قليلة القلة والألياف من aSyn 8,9,10,11 ، هناك حاجة ماسة لدراسة الشكل الأحادي للبروتين وفهم أفضل للمطابقات الوظيفية (وكيف) والتي هي عرضة لتجميع 8,9,10,11 . نظرا لكونه مضطربا في جوهره ، وحجمه 14 كيلوداد فقط ، ويصعب تبلوره ، فإن مونومر aSyn غير قابل لمعظم التقنيات البيولوجية الهيكلية. ومع ذلك ، فإن إحدى التقنيات القادرة على قياس الديناميكيات التوافقية ل aSyn الأحادي هي HDX-MS بالمللي ثانية ، والتي ولدت مؤخرا ملاحظات هيكلية مهمة من شأنها أن تكون صعبة أو مستحيلة الحصول عليها بخلاف ذلك12،13،14. يقيس Millisecond HDX-MS بحساسية متوسط المجموعة التوافقية للبروتين من خلال مراقبة تبادل النظائر في هيدروجين الأميد ، مما يشير إلى إمكانية الوصول إلى المذيبات ومشاركة شبكة الترابط الهيدروجيني لمنطقة بروتين معينة على مقياس زمني بالمللي ثانية. من الضروري التأكيد على جانب المللي ثانية من HDX-MS لأنه ، نظرا لطبيعته المستقرة أصلا ، يعرض aSyn حركية سريعة جدا لتبادل الهيدروجين تظهر أقل بكثير من الحد الأدنى لأنظمة HDX-MS التقليدية. على سبيل المثال ، قام معظم جزيء aSyn باستبدال الهيدروجين بالكامل بالديوتيريوم تحت ظروف داخل الخلايا في أقل من 1 ثانية. وقد قامت عدة مختبرات الآن ببناء أجهزة سريعة الخلط. في هذه الحالة ، يتم استخدام نموذج أولي لأداة تدفق التبريد سريعة الخلط القادرة على أداء HDX-MS مع وقت ميت يبلغ 50 مللي ثانية ودقة زمنية تبلغ 1 مللي ثانية15. في حين أن HDX-MS بالمللي ثانية كان مؤخرا مهما للغاية في دراسة aSyn ، إلا أنه سيكون ذا قيمة في دراسة البروتينات / المناطق المضطربة داخليا على نطاق أوسع وعدد كبير من البروتينات ذات الحلقات / المناطق التي تكون مستقرة بشكل ضعيف فقط. على سبيل المثال ، أدوية الببتيد (على سبيل المثال ، الأنسولين; GLP-1 / الجلوكاجون. tirzepatide) وبروتينات اندماج الببتيد (على سبيل المثال ، مثبط فيروس نقص المناعة البشرية FN3-L35-T1144) هي أشكال دوائية رئيسية حيث يمكن أن تكون المعلومات الهيكلية والمستقرة في مرحلة الحل مدخلا حاسما لقرارات تطوير الأدوية ، ومع ذلك ، فإن الببتيد moiety غالبا ما يكون مستقرا بشكل ضعيف ومستعصيا بواسطة HDX-MS في الثواني الزمنية16،17،18،19،20 . وقد ثبت أن طرق HDX-MS الناشئة مع وضع العلامات في نطاقات الثواني / الدقائق تستمد معلومات هيكلية للحمض النووي G-quadruplexes ، ولكن يجب أن يكون من الممكن توسيع نطاق ذلك ليشمل هياكل قليلة النوكليوتيد الأكثر تنوعا عن طريق تطبيق HDX-MS21 بالمللي ثانية.
يمكن إجراء تجارب HDX-MS على ثلاثة مستويات مختلفة: (1) من أسفل إلى أعلى (حيث يتم هضم البروتين المسمى بشكل بروتيني) ، (2) من الوسط إلى الأسفل (حيث يتم هضم البروتين المسمى بشكل بروتيني ، ويتم تفتيت الببتيدات الناتجة بشكل أكبر بواسطة تقنيات التجزئة الناعمة) ، و (3) من أعلى إلى أسفل (حيث تقوم تقنيات التجزئة الناعمة بتجزئة البروتين المسمى مباشرة)22 . وبالتالي ، فإن بيانات HDX-MS دون الجزيئية تسمح لنا بتوطين سلوك التبادل إلى مناطق محددة من البروتين ، مما يجعل من الأهمية بمكان الحصول على تغطية تسلسل كافية لمثل هذه التجارب. تعتمد الدقة الهيكلية لأي تجربة HDX-MS على عدد الببتيدات المحللة للبروتين أو الشظايا المشتقة من البروتين عند الهضم أو التجزئة الناعمة ، على التوالي. في كل نوع من أنواع التجارب الثلاثة الموضحة أعلاه ، يتم تعيين التغيير في تبادل الأميد في كل ببتيد / جزء مرة أخرى على البنية الأساسية للبروتين للإشارة إلى سلوك المناطق الموضعية من البروتين. في حين يتم تحقيق أعلى دقة هيكلية من خلال التجزئة الناعمة ، فإن وصف هذه التجارب خارج نطاق الدراسة الحالية ، التي تركز على قياس تشكيلات مونومر aSyn. يمكن الحصول على نتائج ممتازة من خلال سير العمل "من أسفل إلى أعلى" المطبق بشكل شائع والموضح هنا.
هنا ، يتم توفير إجراءات حول (1) كيفية إعداد عينات aSyn والمخازن المؤقتة HDX-MS والتعامل معها ، (2) كيفية إجراء رسم خرائط الببتيد لتجربة HDX-MS من أسفل إلى أعلى ، (3) كيفية الحصول على بيانات HDX-MS على aSyn الأحادي في ظل الظروف الفسيولوجية ، وتحديدا في مجال الوقت بالمللي ثانية (باستخدام أداة مصممة خصيصا ؛ كما تم وصف الأدوات البديلة لوضع العلامات بالمللي ثانية) ، و (4) كيفية معالجة وتحليل بيانات HDX-MS. يتم توضيح الطرق التي تستخدم aSyn الأحادي عند درجة الحموضة الفسيولوجية (7.40) في حالتين من ظروف الحل هنا. على الرغم من أنها مفيدة للغاية في دراسة aSyn ، إلا أنه يمكن تطبيق هذه الإجراءات على أي بروتين ولا تقتصر على البروتينات المضطربة في جوهرها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

ألفا سينوكلين (aSyn) هو بروتين مضطرب في جوهره ، حيث تكون مجاميع الألياف وفيرة في أجسام ليوي والأعصاب ، والتي هي السمات المميزة لمرض باركنسون. ومع ذلك ، فإن الكثير من نشاطه البيولوجي ، وكذلك تجميعه ، ينطوي بشكل مركزي على شكل مونومر قابل للذوبان من البروتين. يتطلب توضيح الآليات الجزيئية لبيولوجيا aSyn والفيزيولوجيا المرضية طرقا عالية الحل هيكليا وحساسة للظروف البيولوجية. هياكلها المستقرة في الأصل تجعل aSyn الأحادي المستعصي على العديد من تقنيات البيولوجيا الهيكلية. هنا ، يتم وصف تطبيق أحد هذه النهج: قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX-MS) على مقياس زمني بالمللي ثانية لدراسة البروتينات ذات الاستقرار الديناميكي الحراري المنخفض وعوامل الحماية الضعيفة ، مثل aSyn. على النطاق الزمني للميلي ثانية ، تحتوي بيانات HDX-MS على معلومات حول إمكانية الوصول إلى المذيبات والبنية المستعبدة بالهيدروجين ل aSyn ، والتي يتم فقدانها في أوقات وضع العلامات الأطول ، مما يؤدي في النهاية إلى دقة هيكلية تصل إلى مستوى الأحماض الأمينية. لذلك ، يمكن أن يوفر HDX-MS معلومات بدقة هيكلية وزمنية عالية حول الديناميات التوافقية والديناميكا الحرارية ، والتفاعلات داخل الجزيئات وفيما بينها ، والتأثير الهيكلي للطفرات أو التغييرات في الظروف البيئية. على الرغم من أنه قابل للتطبيق على نطاق واسع ، إلا أنه تم توضيح كيفية الحصول على قياسات HDX-MS بالمللي ثانية وتحليلها وتفسيرها في aSyn الأحادية.

نظرا لطبيعته المضطربة في جوهره ، من الصعب التقاط التغيرات الهيكلية المعقدة في aSyn عند درجة الحموضة الفسيولوجية. يراقب HDX-MS تبادل النظائر في هيدروجينات أميد العمود الفقري ، ويبحث في ديناميكيات وتفاعلات تكوين البروتين. إنها واحدة من التقنيات القليلة للحصول على هذه المعلومات بدقة هيكلية وزم?...

Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

تؤثر المجموعة الهيكلية لألفا سينوكلين أحادي اللون على وظيفتها الفسيولوجية وخصائصها الفيزيائية الكيميائية. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم بالمللي ثانية وتحليلات البيانات اللاحقة لتحديد المعلومات التوافقية عن مونومر هذا البروتين المضطرب جوهريا في ظل الظروف الفسيولوجية.

قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم بالمللي ثانية لدراسة الديناميات الهيكلية ألفا سينوكلين في ظل الظروف الفسيولوجية

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

جميع الكائنات الحية لديها اضطراب في البروتيوم ، يقدر ما يصل إلى 33 ٪ يمكن ملاحظة هذه المناطق عن طريق قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم ، ولكن فقط في النطاق الزمني للميلي ثانية. سيوضح لك بروتوكولنا كيفية القيام بذلك بنجاح. هذه تقنية تحليلية مؤتمتة بالكامل.ما عليك سوى إعداد كل شيء ، وبرمجة قياسات الوقت المطلوبة ، وضرب الذهاب والمشي بعيدا. تفتح هذه التقنية فرصة مثيرة لفحص المركبات التي تثبت تأكيدات محددة للبروتينات المضطربة جوهريا مثل ألفا سينوكلين. لبدء إعداد العينة لرسم خرائط الببتيد ، خذ أولا قارورة من مخزون بروتين ألفا سينوكلين المخزن من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر.وبمجرد إذابته ، قم بالتصفية باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. ثم قم بقياس امتصاص المحلول عند 218 نانومتر لتحديد تركيز البروتين باستخدام قانون بير لامبرت ، وقم بتخفيف البروتين باستخدام مخزن مؤقت للتوازن إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار. بعد ذلك ، لإعداد روبوت أخذ العينات التلقائي ، أضف 50 ميكرولتر من محلول البروتين المولي الدقيق الخمسة إلى قارورة استرداد كاملة ، وضع القارورة في موضع العينة في الغرفة اليمنى لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم ، أو HDX ، الروبوتات بما يتماشى مع مطياف الكتلة.ثم ضع قارورة واحدة من المخزن المؤقت للتوازن وقريورتين من المخزن المؤقت لغسل البيبسين إلى مواضع الكاشف واحد وأربعة وخمسة من الغرف اليسرى وقارورة واحدة من المخزن المؤقت للتبريد لوضع كاشف واحد في الغرفة اليمنى HDX وضبط درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية باستخدام وحدة التحكم في درجة حرارة بلتييه. ثم أضف عددا متساويا من قوارير الاسترداد الإجمالية وقوارير الاسترداد القصوى في نفس مواضع التفاعل للغرفة اليسرى HDX والغرفة اليمنى HDX على التوالي. بعد ذلك ، قم بإعداد قائمة نموذجية باستخدام طرق LC و MS المناسبة في برنامج الجدولة وابدأ الجدول.للحصول على خريطة تغطية الببتيد النهائية، قم يدويا بتنظيم التعيينات النظيرية في برنامج تحليل بيانات DynamX HDX. بعد تنظيف أداة النموذج الأولي Fast HDX ، افتح واجهة المستخدم الرسومية لبرنامج HDX المتوافق لتهيئة النظام. أدخل 20 درجة مئوية و 0.5 درجة مئوية كدرجة حرارة غرفة العينة وغرفة التبريد على التوالي ، متبوعا بالنقر فوق تعيين لتطبيق درجات الحرارة الجديدة.لتنظيف الجهاز وإعداده، قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي بمياه من الدرجة LC/MS في جميع المداخل، ثم تحقق من كل من المحاقن اليسرى واليمنى في علامة تبويب توصيل السباكة المعايرة واستمر في النقر فوق Prime حتى تختفي جميع فقاعات الهواء الكامنة في الأنابيب. للتحقق من جميع مربعات المحاقن ، انتقل أولا إلى علامة التبويب وحدات الماكرو وانقر فوق معايرة موضع المحاقن في المنزل ، ثم انقر أولا فوق حلقة تحميل المحاقن ، متبوعا بغسل جميع وحدات تخزين حلقة الخلط. إذا كانت هناك أي فقاعة في حقنة عازلة، فافصل المحقنة وقم بتفكيكها عن طريق إخراج الفقاعة عموديا.قبل إعادة المعايرة إلى الموضع الصفري ، استبدل المحقنة. لإعداد أداة النموذج الأولي Fast HDX لتجارب HDX ، قم أولا بإدخال أنبوب مدخل المعايرة بالتحليل الحجمي الأيسر في قارورة الاسترداد الإجمالية. لمنع قلة القلة والتجميع الناجم عن درجة الحرارة، ضع الأنبوب في ثلاجة على الطاولة.بعد ذلك ، أضف 50 ملليلتر من مخازن التوازن ووضع العلامات والتبريد وغسل البيبسين إلى مداخل المخزن المؤقت المعنية في الغرف اليمنى واليسرى من الأداة ، متبوعا بإضافة 50 ملليلتر من المخزن المؤقت لغسل العمود إلى مدخل غسيل البيبسين. لتحضير خطوط غسيل البروتين والأعمدة، تحقق من المحاقن اليمنى واليسرى في علامة التبويب تسليم السباكة المعايرة وانقر فوق Prime مرة واحدة. بعد التحقق من جميع مربعات المحاقن كما هو موضح سابقا ، انتقل إلى علامة التبويب تدفق التبريد اليدوي لإدخال الإعدادات المطلوبة.بالنسبة لتجربة دورة زمنية، استخدم زر النقطة الرمزية لإدخال الأوقات بالمللي ثانية. ثم اضبط وقت الملائمة على ثلاثة وانتظر HPLC لملائمة الوقت بالإضافة إلى وقت التشغيل بالإضافة إلى 1.5 دقيقة. إذا تم تشغيل تجارب فارغة بين عمليات تشغيل العينة، فانقر فوق مربع التشغيل الفارغ بعد التأكد من إدخال في برنامج الاكتساب للتشغيل الفارغ بعد كل تشغيل عينة.بمجرد أن تصبح قائمة العينة جاهزة وتم تمييز الإدخالات المناسبة ، ابدأ التشغيل بالنقر فوق تشغيل و Fast HDX في البرنامج. لمعالجة البيانات، افتح قائمة الملفات الخاصة بملف الببتيدات المعينة الطيفية من تجارب رسم خرائط الببتيد وانقر فوق فتح في برنامج DynamX، ثم قم باستيراد الملفات الخام إلى برنامج DynamX. بعد فتح قائمة البيانات ، انقر فوق MS Files.لإنشاء حالات لكل حالة بروتين قيد الدراسة ، انقر فوق حالة جديدة. لإضافة كل نقطة زمنية HDX، انقر على التعرض الجديد، ثم انقر على خام جديد. لاستيراد الملفات الخام، اسحب كل ملف إلى الموضع الصحيح وانقر فوق موافق عند الانتهاء.بعد تعيين النظائر تلقائيا، قم بتنظيم تعيين النظائر يدويا لضمان جودة بيانات عالية. تصدير بيانات الكتلة في ملف csv بترتيب الأعمدة كما هو موضح في المخطوطة. افتح قائمة البيانات في برنامج قياس الكتلة وانقر على تصدير بيانات المجموعة.لتحليل البيانات، قم أولا بتحميل البيانات المجمعة المصدرة إلى برنامج تحليل HDX HDfleX. لتناسب البيانات التجريبية لجميع التجارب والحالات، حدد طرق تصحيح التبادل الخلفي المناسبة للحصول على ثوابت المعدل المرصودة لتفاعل HDX. ثم احسب عتبة الأهمية العالمية باستخدام طريقة مفضلة في HDfleX وقم بإجراء اختبار الدلالة الهجينة لتحديد الاختلافات الكبيرة عبر الحالات المقارنة.ولدت تجربة رسم الخرائط على ألفا سينوكلين خريطة تغطية الببتيد التي غطت 100٪ من تسلسل البروتين بمتوسط تكرار قدره 3.79. علاوة على ذلك ، مكن هذا البروتوكول من توليد منحنيات امتصاص الديوتيريوم لببتيدات مختلفة من ألفا سينوكلين ، والتي تم التعبير عنها بعد ذلك كرسوم بيانية مثبتة وخلفية للتبادل التصحيحي. كان من الواضح أن معظم تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم في ألفا سينوكلين تم في ثانية واحدة.كان الفرق التوافقي بين الحالتين A و B من ألفا سينوكلين واضحا أيضا من امتصاص الديوتيريوم الأعلى من قبل الحالة B على مستوى الببتيد والأحماض الأمينية. بالنسبة لمثل هذه التقنية الحساسة ، من المهم استخدام اختبارات دلالة إحصائية قوية عند مقارنة البيانات. هنا ، استخدمنا برنامجنا HDfleX.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

زرع Miniosmotic مضخات والتسليم استشفاف المسالك لدراسة إعادة تنظيم الدماغ في حالة المرضية

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

في التحليل المتعمق الفسيولوجية لبالسكان خلية المعرفة في الحادة الأنسجة شرائح من الميكعي الجهاز ماوس

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

رصد مفاعليه Astrocyte والانتشار في المختبر تحت ظروف أشبه بالسكتة

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

التسامي DAN مصفوفة للكشف والتخيل من Gangliosides في الجرذ أنسجة المخ لMALDI التصوير قياس الطيف الكتلي

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

التصوير تلألؤ بيولوجي من Neuroinflammation في الفئران المعدلة وراثيا بعد الطرفية تلقيح ألفا Synuclein الألياف

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

عضلة رافعة أوريس التحضير لدراسة انتقال الأعصاب الثدييات المشبك في ظروف الجهد

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...