Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

NS er finansieret af University Council Diamond Jubilee Scholarship. JJP støttes af et UKRI Future Leaders Fellowship [Tilskudsnummer: MR / T02223X / 1].

1. Proteinekspression og oprensning af aSyn
<ol><li>Forbered aSyn efter en tidligere offentliggjort rapport9.</li>
	<li>Dialysere i en sikker opbevaringsbuffer (f.eks. Tris, pH 7.2 ).</li>
	<li>Koncentrer om nødvendigt prøven (f.eks. centrifugeringsfiltermikrocentrifugerør ved hjælp af 3 kDa MWCO, 14.000 x g i ca. 10-30 min, se Materialetabel). BEMÆRK: Det anbefales ikke at koncentrere sig overdrevent. Integriteten af det monomere ensemble er ik...

I denne artikel beskrives følgende procedurer: (1) udførelse af peptidkortlægningseksperimenter på monomer aSyn for at opnå den højeste sekvensdækning, (2) erhvervelse af millisekunder HDX-MS-data på monomere aSyn under fysiologiske forhold og (3) udførelse af dataanalyse og fortolkning af de resulterende HDX-MS-data. De medfølgende procedurer er generelt enkle at udføre, hvert mærkningseksperiment varer typisk kun omkring 8 timer i tre replikater og otte tidspunkter, og kortlægningseksperimentet varer kun c...

Parkinsons sygdom (PD) er en neurodegenerativ sygdom, der påvirker millioner af mennesker over hele verden1. Det er kendetegnet ved dannelsen af cytoplasmatiske indeslutninger kendt som Lewy-kroppe og Lewy-neuritter i hjernens substantia nigra pars compacta-region. Disse cytoplasmatiske indeslutninger har vist sig at indeholde aggregater af det iboende uordnede protein aSyn2. I PD og andre synukleinopatier omdannes aSyn fra en opløselig uordnet tilstand til en uopløselig, stærkt struktureret syg tilstand. I sin oprindelige form vedtager monomer aSyn en bred vifte af konformationer stabiliseret af langtrækkende elektrostatiske interaktioner mellem dets N- og C-termini og hydrofobe interaktioner mellem dets C-endestation og ikke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuelle forstyrrelser i disse stabiliserende interaktioner, såsom mutationer, posttranslationelle modifikationer og ændringer i det lokale miljø, kan føre til fejlfoldning af monomeren og dermed udløse aggregeringsprocessen7.
Mens der findes en enorm mængde forskning om de oligomere og fibrillarformer af aSyn 8,9,10,11, er der et afgørende behov for at studere den monomere form af proteinet og bedre forstå, hvilke konforme der er funktionelle (og hvordan), og hvilke der er tilbøjelige til at aggregere 8,9,10,11 . At være iboende uordnet, kun 14 kDa i størrelse og vanskelig at krystallisere, er aSyn monomeren ikke modtagelig for de fleste strukturelle biologiske teknikker. En teknik, der er i stand til at måle konformationsdynamikken i monomer aSyn, er imidlertid millisekund HDX-MS, som for nylig har genereret vigtige strukturelle observationer, der ville være udfordrende eller umulige at opnå ellers 12,13,14. Millisekunder HDX-MS måler følsomt gennemsnittet af proteinkonformationsensemblet ved at overvåge isotopudvekslingen ved amidhydrogener, hvilket indikerer opløsningsmiddeltilgængelighed og hydrogenbindingsnetværksdeltagelse for et bestemt proteinområde på millisekundets tidsskala. Det er nødvendigt at understrege millisekundaspektet af HDX-MS, da aSyn på grund af sin naturligt udfoldede, metastabile natur udviser meget hurtig hydrogenudvekslingskinetik, der manifesterer sig langt under den nedre grænse for konventionelle HDX-MS-systemer. For eksempel har det meste af aSyn-molekylet fuldstændigt udvekslet hydrogen til deuterium under intracellulære forhold på mindre end 1 s. Flere laboratorier har nu bygget hurtigblandingsinstrumentering; i dette tilfælde anvendes et prototype hurtigblandende slukningsflowinstrument, der er i stand til at udføre HDX-MS med en dødtid på 50 ms og en tidsmæssig opløsning på 1 ms15. Mens millisekund HDX-MS for nylig har været akut vigtig i studiet af aSyn, står det til at være værdifuldt at studere iboende uordnede proteiner / regioner mere bredt og et stort antal proteiner med sløjfer / regioner, der kun er svagt stabile. For eksempel peptidlægemidler (f.eks. Insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) og peptidfusionsproteiner (f.eks. HIV-hæmmeren FN3-L35-T1144) er vigtige lægemiddelformater, hvor opløsningsfasestruktur- og stabilitetsoplysninger kan være et kritisk input til beslutninger om lægemiddeludvikling, og alligevel er peptiddelen ofte kun svagt stabil og uhåndterlig af HDX-MS på sekundernes tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS-metoder med mærkning i sekunder / minutter domæner har vist sig at udlede strukturelle oplysninger for DNA G-quadruplexes, men det skulle være muligt at udvide dette til mere forskellige oligonukleotidstrukturer ved anvendelse af millisekund HDX-MS21.
HDX-MS-eksperimenter kan udføres på tre forskellige niveauer: (1) bottom-up (hvorved det mærkede protein fordøjes proteolytisk), (2) middle-down (hvorved det mærkede protein fordøjes proteolytisk, og de resulterende peptider fragmenteres yderligere ved hjælp af bløde fragmenteringsteknikker) og (3) top-down (hvorved bløde fragmenteringsteknikker direkte fragmenterer det mærkede protein)22 . Således giver submolekylære HDX-MS-data os mulighed for at lokalisere udvekslingsadfærden til bestemte regioner af et protein, hvilket gør det kritisk at have tilstrækkelig sekvensdækning for sådanne eksperimenter. Den strukturelle opløsning af ethvert HDX-MS-eksperiment afhænger af antallet af proteolytiske peptider eller fragmenter afledt af proteinet ved henholdsvis fordøjelse eller blød fragmentering. I hver af de tre eksperimenttyper, der er skitseret ovenfor, kortlægges ændringen i amidudveksling ved hvert peptid / fragment tilbage på proteinets primære struktur for at indikere opførsel af lokaliserede regioner af proteinet. Mens den højeste strukturelle opløsning opnås gennem blød fragmentering, er beskrivelsen af disse eksperimenter uden for rammerne af den nuværende undersøgelse, der fokuserer på måling af aSyn monomer konformationer. Fremragende resultater kan opnås med den almindeligt anvendte "bottom-up" arbejdsgang beskrevet her.
Her gives procedurer for (1) hvordan man forbereder og håndterer aSyn-prøver og HDX-MS-buffere, (2) hvordan man udfører peptidkortlægning til et bottom-up HDX-MS-eksperiment, (3) hvordan man erhverver HDX-MS-data om monomere aSyn under fysiologiske forhold, specifikt i millisekundets tidsdomæne (ved hjælp af et specialbygget instrument; alternative instrumenter til millisekundmærkning er også beskrevet), og (4) hvordan man behandler og analyserer HDX-MS-dataene. Metoder, der anvender monomer aSyn ved fysiologisk pH (7,40) i to opløsningsbetingelser, er eksemplificeret her. Selvom de er kritisk nyttige i undersøgelsen af aSyn, kan disse procedurer anvendes på ethvert protein og er ikke begrænset til iboende uordnede proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

Alfa-synuclein (aSyn) er et iboende uordnet protein, hvis fibrillære aggregater er rigelige i Lewy-kroppe og neuritter, som er kendetegnende for Parkinsons sygdom. Alligevel involverer meget af dets biologiske aktivitet såvel som dets aggregering centralt den opløselige monomerform af proteinet. Belysning af de molekylære mekanismer i aSyn biologi og patofysiologi kræver strukturelt stærkt opløste metoder og er følsom over for biologiske forhold. Dens naturligt udfoldede, metastabile strukturer gør monomer aSyn uhåndterlig for mange strukturelle biologiske teknikker. Her beskrives anvendelsen af en sådan tilgang: hydrogen/deuterium-udvekslingsmassespektrometri (HDX-MS) på millisekundets tidsskala for undersøgelse af proteiner med lav termodynamisk stabilitet og svage beskyttelsesfaktorer, såsom aSyn. På millisekundets tidsskala indeholder HDX-MS-data oplysninger om opløsningsmiddeltilgængelighed og hydrogenbundet struktur af aSyn, som går tabt på længere mærkningstider, hvilket i sidste ende giver strukturel opløsning op til aminosyreniveauet. Derfor kan HDX-MS give information ved høje strukturelle og tidsmæssige opløsninger om konformationsdynamik og termodynamik, intra- og intermolekylære interaktioner og den strukturelle virkning af mutationer eller ændringer i miljøforhold. Selvom det er bredt anvendeligt, demonstreres det, hvordan man erhverver, analyserer og fortolker millisekund HDX-MS-målinger i monomerisk aSyn.

På grund af sin iboende uordnede natur er det vanskeligt at fange de indviklede strukturelle ændringer i aSyn ved fysiologisk pH. HDX-MS overvåger isotopudveksling ved rygradsamidhydrogener og undersøger proteinkonformationsdynamikken og interaktionerne. Det er en af de få teknikker til at erhverve disse oplysninger ved høje strukturelle og tidsmæssige opløsninger. Denne protokol er bredt anvendelig på en lang række proteiner og bufferbetingelser, og dette eksemplificeres ved måling af aSyns udvekslingskinetik...

Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Det strukturelle ensemble af monomer alfa-synuclein påvirker dets fysiologiske funktion og fysisk-kemiske egenskaber. Denne protokol beskriver, hvordan man udfører millisekund hydrogen/ deuteriumudvekslingsmassespektrometri og efterfølgende dataanalyser for at bestemme konformationsoplysninger om monomeren af dette iboende uordnede protein under fysiologiske forhold.

Millisekund hydrogen / deuterium-udveksling massespektrometri til undersøgelse af alfa-synuclein strukturel dynamik under fysiologiske forhold

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Alle organismer har lidelse i deres proteom, anslået op til 33%Disse regioner kan observeres ved hydrogen / deuteriumudvekslingsmassespektrometri, men kun i millisekundets tidsinterval. Vores protokol viser dig, hvordan du gør dette med succes. Dette er en fuldautomatisk analytisk teknik.Du sætter bare alt op, programmerer de ønskede tidsmålinger, trykker på go og walk away. Denne teknik åbner den spændende mulighed for screening for forbindelser, der stabiliserer specifikke bekræftelser af iboende uordnede proteiner, såsom alfa-synuclein. For at begynde prøveforberedelsen til peptidkortlægning skal du først tage et hætteglas med lagret alfa-synucleinproteinlager fra minus 80 grader Celsius fryseren.Og når det er optøet, filtreres ved hjælp af et 0,22 mikrometer sprøjtefilter. Derefter måles opløsningens absorbans ved 218 nanometer for at bestemme proteinkoncentrationen ved hjælp af Beer-Lamberts lov, og fortynd proteinet med ligevægtsbuffer til en slutkoncentration på fem mikromolarer. For at opsætte autosamplerrobotten skal du derefter tilføje 50 mikroliter af den fem mikromolære proteinopløsning til et hætteglas med total genvinding og placere hætteglasset i prøvepositionen i det højre kammer i hydrogen / deuteriumudvekslingen eller HDX, robotik i overensstemmelse med massespektrometeret.Sæt derefter et hætteglas med ligevægtsbuffer og to hætteglas pepsinvaskebuffer til reagensposition et, fire og fem af de venstre kamre og et hætteglas med slukningsbuffer til reagensposition et i HDX højre kammer og indstil temperaturen til 20 grader Celsius ved hjælp af Peltier temperaturregulatoren. Tilføj derefter et lige antal hætteglas med total gendannelse og hætteglas med maksimal genvinding i de samme reaktionspositioner som henholdsvis HDX venstre kammer og HDX højre kammer. Opret derefter en eksempelliste med passende LC- og MS-metoder i planlægningssoftwaren og start tidsplanen.For at få det endelige peptiddækningskort skal du manuelt kuratere isotopopgaverne i DynamX HDX-dataanalysesoftwaren. Når du har renset Fast HDX-prototypeinstrumentet, skal du åbne den grafiske brugergrænseflade til den kompatible HDX-software for at initialisere systemet. Indtast 20 grader Celsius og 0,5 grader Celsius som henholdsvis prøvekammeret og slukningskammertemperaturerne, efterfulgt af at klikke på indstillet for at anvende de nye temperaturer.For at rengøre og klargøre instrumentet skal du sætte centrifugerørene op med vand af LC/MS-kvalitet ved alle indgange, derefter kontrollere både venstre og højre sprøjter i titratorens VVS-leveringsfane og fortsætte med at klikke på prime, indtil alle latente luftbobler i rørene er væk. For at kontrollere alle æskerne til sprøjter skal du først gå til fanen makroer og klikke på kalibrer sprøjter hjemmeposition, derefter først klikke på vask sprøjtebelastningssløjfe efterfulgt af vask alle blandesløjfevolumener. Hvis der er en boble i en buffersprøjte, skal du frakoble sprøjten og afgasse den ved lodret at skubbe boblen ud.Før du kalibrerer til nulpositionen, skal du udskifte sprøjten. For at opsætte Fast HDX-prototypeinstrumentet til HDX-eksperimenter skal du først indsætte venstre titreringsindløbsrør i hætteglasset med total gendannelse. For at forhindre temperaturinduceret oligomerisering og aggregering skal du placere røret i et bordkøleskab.Derefter tilsættes 50 ml ligevægts-, mærknings-, sluknings- og pepsinvaskebuffere til de respektive bufferindtag i instrumentets højre og venstre kammer, efterfulgt af tilsætning af 50 ml søjlevaskebuffer til pepsinvaskindløbet. For at grundlægge protein- og søjlevaskelinjerne skal du kontrollere højre og venstre sprøjter i titratorens VVS-leveringsfane og klikke på prime en gang. Når du har markeret alle afkrydsningsfelterne til sprøjter som vist tidligere, skal du gå til fanen Manuel slukningsflow for at indtaste de nødvendige indstillinger.For et tidskursuseksperiment skal du bruge den symbolske prikknap til at indtaste tiderne i millisekunder. Indstil derefter fældetiden til tre, og vent på, at HPLC fanger tid plus køretid plus 1,5 minutter. Hvis der køres tomme eksperimenter mellem prøvekørsler, skal du klikke på feltet Kør tomt, når du har sikret en post i anskaffelsessoftwaren for den tomme kørsel efter hver prøvekørsel.Når eksempellisten er klar, og de relevante poster er blevet fremhævet, skal du starte kørslen ved at klikke på play og Fast HDX i softwaren. Til databehandling skal du åbne filmenuen i filen med spektralt tildelte peptider fra peptidkortlægningseksperimenterne og klikke på åben i DynamX-softwaren og derefter importere de rå filer til DynamX-softwaren. Når du har åbnet datamenuen, skal du klikke på MS-filer.For at skabe tilstande for hver proteintilstand, der undersøges, skal du klikke på ny tilstand. Hvis du vil tilføje hvert HDX-tidspunkt, skal du klikke på ny eksponering og derefter klikke på ny raw. Hvis du vil importere raw-filer, skal du trække hver fil til den korrekte placering og klikke på OK, når du er færdig.Når du automatisk har tildelt isotoper, skal du manuelt kuratere isotoptildelingen for at sikre høj datakvalitet. Eksportér klyngedataene i csv-fil med kolonnerækkefølgen som beskrevet i manuskriptet. Åbn datamenuen i massemålingssoftwaren, og klik på eksporter klyngedata.Til dataanalyse skal du først indlæse de eksporterede klyngedata i HDX-analysesoftwaren HDfleX. For at passe til de eksperimentelle data for alle eksperimenter og tilstande skal du vælge de relevante tilbageudvekslingskorrektionsmetoder for at få de observerede hastighedskonstanter for HDX-reaktionen. Beregn derefter en global signifikanstærskel ved hjælp af en foretrukken metode i HDfleX, og udfør hybrid signifikanstest for at bestemme de signifikante forskelle på tværs af de sammenlignede stater.Kortlægningseksperimentet på alfa-synuclein genererede et peptiddækningskort, der dækkede 100% af proteinsekvensen med en gennemsnitlig redundans på 3,79. Desuden muliggjorde denne protokol dannelsen af deuteriumoptagelseskurver for forskellige peptider af alfa-synuclein, som derefter blev udtrykt som monterede og tilbageudvekslingskorrigerede grafer. Det var tydeligt, at det meste hydrogen/ deuteriumudveksling i alfa-synuclein blev udført med et sekund.Konformationsforskellen mellem tilstande A og B af alfa-synuclein var også tydelig fra den højere deuteriumoptagelse ved tilstand B både ved peptid- og aminosyreniveauerne. For en så følsom teknik er det vigtigt at bruge robuste statistiske signifikanstest, når man sammenligner data. Her brugte vi vores software HDfleX.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering af pericyt-afledte Celler af Voksen Menneskelige hjerne til Inducerede Neuroner

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Implantation af Miniosmotic Pumper og levering af Tract Lysspor at studere Brain Reorganisering i patofysiologiske tilstande

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sekventiel Udvinding af opløselige og uopløselige Alpha-Synuclein fra Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Dybdegående Fysiologisk Analyse af Definerede Cell populationer i Akut Tissue Skiver af Mouse vomeronasale organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Overvågning Astrocyte reaktivitet og spredning in Vitro iskæmisk-lignende betingelser

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimation af DAN Matrix til påvisning og Visualisering af Gangliosider i Rat Brain Tissue for MALDI Imaging massespektrometri

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescens Billeddannelse af Neuroinflammation i transgene mus efter perifer Inokulering af alfa-synuclein Fibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsafhængig stigning i netværksresponset til stimulering af neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Forberedelse til eksamen mammale neuromuskulære transmission spænding klemme betingelser

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...