Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

NS wordt gefinancierd door de Universiteitsraad Diamond Jubilee Scholarship. JJP wordt ondersteund door een UKRI Future Leaders Fellowship [Subsidienummer: MR/T02223X/1].

1. Eiwitexpressie en zuivering van aSyn
<ol><li>Bereid aSyn voor naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport9.</li>
	<li>Dialyseren in een veilige opslagbuffer (bijv. Tris, pH 7,2 ).</li>
	<li>Concentreer het monster indien nodig (bijv. spinfiltermicrocentrifugebuizen met 3 kDa MWCO, 14.000 x g gedurende ongeveer 10-30 minuten, zie materiaaltabel). OPMERKING: Het wordt geadviseerd om niet overmatig te concentreren. De integriteit van het mono...

In dit artikel worden de volgende procedures beschreven: (1) het uitvoeren van peptide mapping experimenten op monomere aSyn om de hoogste sequentiedekking te verkrijgen, (2) het verkrijgen van milliseconde HDX-MS gegevens op monomere aSyn onder fysiologische omstandigheden, en (3) het uitvoeren van data-analyse en interpretatie van de resulterende HDX-MS data. De verstrekte procedures zijn over het algemeen eenvoudig uit te voeren, elk labelexperiment duurt meestal slechts ongeveer 8 uur voor drie replicaties en acht ti...

De ziekte van Parkinson (PD) is een neurodegeneratieve ziekte die wereldwijd miljoenen mensen treft1. Het wordt gekenmerkt door de vorming van cytoplasmatische insluitsels bekend als Lewy bodies en Lewy neurites in de substantia nigra pars compacta regio van de hersenen. Deze cytoplasmatische insluitsels blijken aggregaten van het intrinsiek ongeordende eiwit aSyn2 te bevatten. Bij PD en andere synucleinopathieën transformeert aSyn van een oplosbare ongeordende toestand in een onoplosbare, sterk gestructureerde zieke toestand. In zijn oorspronkelijke vorm neemt monomere aSyn een breed scala aan conformaties aan, gestabiliseerd door elektrostatische interacties op lange afstand tussen zijn N- en C-termini en hydrofobe interacties tussen zijn C-terminus en niet-amyloïde bètacomponent (NAC) regio 3,4,5,6. Eventuele verstoringen in die stabiliserende interacties, zoals mutaties, posttranslationele modificaties en veranderingen in de lokale omgeving, kunnen leiden tot het verkeerd vouwen van het monomeer, waardoor het proces van aggregatiewordt geactiveerd 7.
Hoewel er een enorme hoeveelheid onderzoek bestaat naar de oligomere en fibrillaire vormen van aSyn 8,9,10,11, is er een cruciale behoefte om de monomere vorm van het eiwit te bestuderen en beter te begrijpen welke conformers functioneel zijn (en hoe) en welke vatbaar zijn voor aggregaat 8,9,10,11 . Omdat het intrinsiek ongeordend is, slechts 14 kDa groot is en moeilijk te kristalliseren, is het aSyn-monomeer niet vatbaar voor de meeste structurele biologische technieken. Een techniek die in staat is om de conformatiedynamiek van monomere aSyn te meten, is milliseconde HDX-MS, die onlangs belangrijke structurele waarnemingen heeft gegenereerd die uitdagend of onmogelijk te verkrijgen zouden zijn anders 12,13,14. Milliseconde HDX-MS meet gevoelig het gemiddelde van het eiwitconformatie-ensemble door de isotopische uitwisseling bij amidewaterstoffen te monitoren, wat wijst op de toegankelijkheid van oplosmiddelen en de deelname van het waterstofbindingsnetwerk van een bepaald eiwitgebied op de millisecondetijdschaal. Het is noodzakelijk om het milliseconde-aspect van de HDX-MS te benadrukken, omdat aSyn, vanwege zijn native uitgevouwen, meta-stabiele aard, een zeer snelle waterstofuitwisselingskinetiek vertoont die zich ver onder de ondergrens van conventionele HDX-MS-systemen manifesteert. Het grootste deel van het aSyn-molecuul heeft bijvoorbeeld waterstof volledig uitgewisseld voor deuterium onder intracellulaire omstandigheden in minder dan 1 s. Verschillende laboratoria hebben inmiddels snelmenginstrumenten gebouwd; in dit geval wordt een prototype snel mengend quench-flow instrument gebruikt dat HDX-MS kan uitvoeren met een dead-time van 50 ms en een temporele resolutie van 1 ms15. Hoewel milliseconde HDX-MS onlangs acuut belangrijk is geweest in de studie van aSyn, is het waardevol bij het bestuderen van intrinsiek ongeordende eiwitten / regio's op grotere schaal en een groot aantal eiwitten met lussen / regio's die slechts zwak stabiel zijn. Bijvoorbeeld peptidegeneesmiddelen (bijv. Insuline; GLP-1/glucagon; tirzepatide) en peptidefusie-eiwitten (bijv. de HIV-remmer FN3-L35-T1144) zijn belangrijke medicijnformaten waarbij structurele en stabiliteitsinformatie in de oplossingsfase een kritische input kan zijn voor beslissingen over de ontwikkeling van geneesmiddelen, en toch is het peptidegedeelte vaak slechts zwak stabiel en onhandelbaar door HDX-MS op de secondentijdschaal 16,17,18,19,20 . Van opkomende HDX-MS-methoden met labeling in de seconden/minuten-domeinen is aangetoond dat ze structurele informatie afleiden voor DNA G-quadruplexen, maar het zou mogelijk moeten zijn om dit uit te breiden naar meer diverse oligonucleotidestructuren door de toepassing van milliseconde HDX-MS21.
HDX-MS-experimenten kunnen op drie verschillende niveaus worden uitgevoerd: (1) bottom-up (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd), (2) middle-down (waarbij het gelabelde eiwit proteolytisch wordt verteerd en de resulterende peptiden verder worden gefragmenteerd door soft-fragmentation technieken), en (3) top-down (waarbij soft-fragmentation technieken het gelabelde eiwit direct fragmenteren)22 . Submoleculaire HDX-MS-gegevens stellen ons dus in staat om het uitwisselingsgedrag te lokaliseren naar specifieke regio's van een eiwit, waardoor het van cruciaal belang is om voldoende sequentiedekking voor dergelijke experimenten te hebben. De structurele resolutie van elk HDX-MS-experiment is afhankelijk van het aantal proteolytische peptiden of fragmenten afgeleid van het eiwit bij vertering of zachte fragmentatie, respectievelijk. In elk van de drie hierboven beschreven experimenttypen wordt de verandering in amide-uitwisseling bij elk peptide / fragment teruggekoppeld naar de primaire structuur van het eiwit om het gedrag van gelokaliseerde gebieden van het eiwit aan te geven. Hoewel de hoogste structurele resolutie wordt bereikt door zachte fragmentatie, valt de beschrijving van deze experimenten buiten het bereik van de huidige studie, die zich richt op het meten van aSyn monomeer conformaties. Uitstekende resultaten kunnen worden verkregen met de vaak toegepaste "bottom-up" workflow die hier wordt beschreven.
Hier worden procedures gegeven over (1) hoe aSyn-monsters en HDX-MS-buffers te bereiden en te verwerken, (2) hoe peptidemapping uit te voeren voor een bottom-up HDX-MS-experiment, (3) hoe HDX-MS-gegevens over monomere aSyn te verkrijgen onder fysiologische omstandigheden, met name in het millisecondetijddomein (met behulp van een op maat gemaakt instrument; alternatieve instrumenten voor milliseconde-etikettering zijn ook beschreven), en (4) hoe de HDX-MS-gegevens te verwerken en te analyseren. Methoden met behulp van monomere aSyn bij fysiologische pH (7,40) in twee oplossingsomstandigheden worden hier geïllustreerd. Hoewel kritisch nuttig in de studie van aSyn, kunnen deze procedures worden toegepast op elk eiwit en zijn ze niet beperkt tot intrinsiek ongeordende eiwitten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

Alfa-synucleïne (aSyn) is een intrinsiek ongeordend eiwit waarvan de fibrillaire aggregaten overvloedig aanwezig zijn in Lewy-lichamen en neurieten, die de kenmerken zijn van de ziekte van Parkinson. Toch is veel van zijn biologische activiteit, evenals de aggregatie ervan, centraal betrokken bij de oplosbare monomeervorm van het eiwit. Opheldering van de moleculaire mechanismen van aSyn biologie en pathofysiologie vereist structureel sterk opgeloste methoden en is gevoelig voor biologische omstandigheden. De oorspronkelijk uitgevouwen, meta-stabiele structuren maken monomere aSyn onhandelbaar voor veel structurele biologietechnieken. Hier wordt de toepassing van een dergelijke benadering beschreven: waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) op de milliseconde tijdschaal voor de studie van eiwitten met lage thermodynamische stabiliteit en zwakke beschermingsfactoren, zoals aSyn. Op de milliseconde tijdschaal bevatten HDX-MS-gegevens informatie over de toegankelijkheid van oplosmiddelen en waterstofgebonden structuur van aSyn, die verloren gaan bij langere etiketteringstijden, wat uiteindelijk een structurele resolutie tot het aminozuurniveau oplevert. Daarom kan HDX-MS informatie verstrekken met hoge structurele en temporele resoluties over conformatiedynamica en thermodynamica, intra- en intermoleculaire interacties en de structurele impact van mutaties of veranderingen in omgevingsomstandigheden. Hoewel breed toepasbaar, wordt aangetoond hoe milliseconde HDX-MS-metingen in monomere aSyn kunnen worden verkregen, geanalyseerd en geïnterpreteerd.

Vanwege de intrinsiek ongeordende aard is het moeilijk om de ingewikkelde structurele veranderingen in aSyn bij fysiologische pH vast te leggen. HDX-MS bewaakt de isotopische uitwisseling bij backboneamidehydrogenen en onderzoekt de eiwitconformatiedynamiek en interacties. Het is een van de weinige technieken om deze informatie te verkrijgen met hoge structurele en temporele resoluties. Dit protocol is breed toepasbaar op een breed scala aan eiwitten en buffercondities, en dit wordt geïllustreerd door de meting van de u...

Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Het structurele ensemble van monomeer alfa-synucleïne beïnvloedt de fysiologische functie en fysisch-chemische eigenschappen. Het huidige protocol beschrijft hoe milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie en daaropvolgende data-analyses kunnen worden uitgevoerd om conformatie-informatie over het monomeer van dit intrinsiek ongeordende eiwit onder fysiologische omstandigheden te bepalen.

Milliseconde waterstof/deuterium-uitwisseling massaspectrometrie voor de studie van alfa-synucleïne structurele dynamica onder fysiologische omstandigheden

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Alle organismen hebben een wanorde in hun proteoom, geschat tot 33% Deze regio's zijn waarneembaar door waterstof / deuterium uitwisseling massaspectrometrie, maar alleen in het milliseconde tijdsbereik. Ons protocol laat u zien hoe u dit met succes kunt doen. Dit is een volledig geautomatiseerde analysetechniek.Je stelt gewoon alles in, programmeert de gewenste tijdmetingen, drukt op go en loopt weg. Deze techniek opent de opwindende mogelijkheid om te screenen op verbindingen die specifieke bevestigingen van intrinsiek ongeordende eiwitten zoals alfa-synucleïne stabiliseren. Om te beginnen met de monstervoorbereiding voor het in kaart brengen van peptiden, neemt u eerst een injectieflacon met opgeslagen alfa-synucleïne-eiwitvoorraad uit de vriezer van min 80 graden Celsius.En zodra het is ontdooid, filtert u met een spuitfilter van 0,22 micrometer. Meet vervolgens de absorptie van de oplossing op 218 nanometer om de eiwitconcentratie te bepalen met behulp van de wet van Beer-Lambert en verdun het eiwit met evenwichtsbuffer tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolair. Voeg vervolgens, om de autosampler-robot in te stellen, 50 microliter van de vijf micromolaire eiwitoplossing toe aan een injectieflacon met totaal herstel en plaats de injectieflacon in de monsterpositie in de rechterkamer van de waterstof / deuteriumuitwisseling, of HDX, robotica in overeenstemming met de massaspectrometer.Plaats vervolgens een injectieflacon met evenwichtsbuffer en twee injectieflacons pepsinewasbuffer op reagensposities één, vier en vijf van de linkerkamers en één injectieflacon met blusbuffer om reagenspositie één in de hdx-rechterkamer te plaatsen en de temperatuur in te stellen op 20 graden Celsius met behulp van de Peltier-temperatuurregelaar. Voeg vervolgens een gelijk aantal totale herstelflacons en maximale herstelflacons toe in dezelfde reactieposities van respectievelijk de linker hdx-kamer en de hdx-rechterkamer. Stel vervolgens een voorbeeldlijst op met de juiste LC- en MS-methoden in de planningssoftware en start de planning.Om de uiteindelijke peptidedekkingskaart te verkrijgen, beheert u handmatig de isotopische toewijzingen in de DynamX HDX-data-analysesoftware. Nadat u het Fast HDX-prototype-instrument hebt gereinigd, opent u de grafische gebruikersinterface van de compatibele HDX-software om het systeem te initialiseren. Voer respectievelijk 20 graden Celsius en 0,5 graden Celsius in als respectievelijk de temperatuur van de monsterkamer en de bluskamer, gevolgd door op Set te klikken om de nieuwe temperaturen toe te passen.Om het instrument schoon te maken en voor te bereiden, stelt u de centrifugebuizen in met water van LC/MS-kwaliteit bij alle inlaten, controleert u vervolgens zowel de linker- als rechterspuiten op het tabblad voor het afleveren van het titratorleidingen en blijft u op prime klikken totdat alle latente luchtbellen in de buizen verdwenen zijn. Om alle vakjes voor spuiten te controleren, gaat u eerst naar het tabblad macro's en klikt u op de thuispositie van kalibreren van spuiten, klikt u vervolgens eerst op de laadlus van de wasspuit en vervolgens op het wassen van alle menglusvolumes. Als er een bel in een bufferspuit zit, koppelt u de spuit los en ontgast u deze door de bel verticaal uit te werpen.Voordat u opnieuw kalibreert naar de nulpositie, vervangt u de spuit. Voor het instellen van het Fast HDX-prototype-instrument voor HDX-experimenten, plaatst u eerst de linker titratie-inlaatbuis in de totale herstelflacon. Om temperatuurgeïnduceerde oligomerisatie en aggregatie te voorkomen, plaatst u de buis in een tafelkoelkast.Voeg vervolgens 50 milliliter evenwichts-, etiketterings-, blus- en pepsinewasbuffers toe aan de respectieve bufferinlaten in de rechter- en linkerkamers van het instrument, gevolgd door 50 milliliter kolomwasbuffer toe te voegen aan de pepsinewasinlaat. Voor het primen van de eiwit- en kolomwaslijnen, controleert u de rechter- en linkerspuiten in het tabblad voor het afleveren van het sanitair van de titrator en klikt u eenmaal op prime. Nadat u alle vakjes voor spuiten hebt gecontroleerd, zoals eerder gedemonstreerd, gaat u naar het tabblad handmatige doofstroom om de vereiste instellingen in te voeren.Voor een tijdcursusexperiment gebruikt u de symbolische puntknop om de tijden in milliseconden in te voeren. Stel vervolgens de valtijd in op drie en het wachten op HPLC om de valtijd plus looptijd plus 1,5 minuut te vangen. Als lege experimenten worden uitgevoerd tussen de uitvoeringen van een voorbeeld, klikt u op het lege vak Uitvoeren nadat u ervoor hebt gezorgd dat er na elke uitgevoerde steekproef een vermelding in de acquisitiesoftware voor de lege uitvoering is uitgevoerd.Zodra de voorbeeldlijst klaar is en de juiste vermeldingen zijn gemarkeerd, start u de run door op play en Fast HDX in de software te klikken. Voor gegevensverwerking opent u het bestandsmenu van het bestand met spectraal toegewezen peptiden uit de peptidetoewijzingsexperimenten en klikt u op openen in de DynamX-software en importeert u vervolgens de ONBEWERKTE bestanden in de DynamX-software. Nadat u het gegevensmenu hebt geopend, klikt u op MS Files.Om toestanden te maken voor elke eiwitconditie die wordt bestudeerd, klikt u op nieuwe toestand. Om elk HDX-tijdspunt toe te voegen, klikt u op nieuwe belichting en vervolgens op nieuwe raw. Als u RAW-bestanden wilt importeren, sleept u elk bestand naar de juiste positie en klikt u op OK wanneer u klaar bent.Nadat u automatisch isotopen hebt toegewezen, beheert u de isotopische toewijzing handmatig om een hoge gegevenskwaliteit te garanderen. Exporteer de clustergegevens in csv-bestand met de kolomvolgorde zoals beschreven in het manuscript. Open het gegevensmenu in de massameetsoftware en klik op clustergegevens exporteren.Voor gegevensanalyse laadt u eerst de geëxporteerde geclusterde gegevens in de HDX-analysesoftware HDfleX. Om de experimentele gegevens voor alle experimenten en toestanden aan te passen, selecteert u de juiste teruguitwisselingscorrectiemethoden om de waargenomen snelheidsconstanten voor de HDX-reactie te krijgen. Bereken vervolgens een globale significantiedrempel met behulp van een voorkeursmethode in HDfleX en voer hybride significantietests uit om de significante verschillen tussen de vergeleken staten te bepalen.Het mapping experiment op alfa-synucleïne genereerde een peptide dekkingskaart die 100% van de eiwitsequentie bedekte met een gemiddelde redundantie van 3,79. Bovendien maakte dit protocol het genereren van deuteriumopnamecurven mogelijk voor verschillende peptiden van alfa-synucleïne, die vervolgens werden uitgedrukt als aangepaste en teruguitwisseling gecorrigeerde grafieken. Het was duidelijk dat de meeste waterstof/deuterium uitwisseling in alfa-synucleïne met één seconde werd gedaan.Het conformatieverschil tussen toestanden A en B van alfa-synucleïne was ook duidelijk uit de hogere deuteriumopname door toestand B, zowel op het peptide- als het aminozuurniveau. Voor een dergelijke gevoelige techniek is het belangrijk om robuuste statistische significantietests te gebruiken bij het vergelijken van gegevens. Hier gebruikten we onze software HDfleX.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Orale toediening van Rotenon met behulp van een Gavage en beeldanalyse van de Alpha-synucleïne inclusies in het enterisch zenuwstelsel

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Implantatie van mini-osmotische pompen en Levering van Tract Tracers naar Brain Reorganisatie in pathofysiologische omstandigheden Studie

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Toezicht Astrocyt reactiviteit en proliferatie in Vitro ischemische-achtige omstandigheden

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimatie van DAN Matrix voor de detectie en Visualisatie van gangliosiden in Rat Brain Tissue voor MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen Na Perifere Enten van alfa-synucleine fibrillen

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Musculus levator Auris Longus Voorbereiding onderzoek van zoogdieren neuromusculaire transmissie Voltage Clamp voorwaarden

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...