Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
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NS est financé par la bourse du jubilé de diamant du Conseil de l’Université. JJP est soutenu par une bourse UKRI Future Leaders [Numéro de subvention : MR/T02223X/1].

1. Expression des protéines et purification d’aSyn
<ol><li>Préparez aSyn à la suite d’un rapport9 publié précédemment.</li>
	<li>Dialyze dans un tampon de stockage sûr (par exemple, Tris, pH 7,2 ).</li>
	<li>Au besoin, concentrer l’échantillon (p. ex., tubes de microcentrifugation à filtre rotatif utilisant 3 kDa MWCO, 14 000 x g pendant environ 10 à 30 min, voir tableau des matériaux). REMARQUE: Il est conseillé de ne pas se concen...

Dans le présent article, les procédures suivantes sont décrites: (1) effectuer des expériences de cartographie peptidique sur aSyn monomère pour obtenir la couverture de séquence la plus élevée, (2) acquérir des données HDX-MS millisecondes sur aSyn monomère dans des conditions physiologiques, et (3) effectuer l’analyse des données et l’interprétation des données HDX-MS résultantes. Les procédures fournies sont généralement simples à exécuter, chaque expérience d’étiquetage ne dure généralem...

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative qui touche des millions de personnes dans le monde1. Elle se caractérise par la formation d’inclusions cytoplasmiques connues sous le nom de corps de Lewy et de neurites de Lewy dans la région de la substantia nigra pars compacta du cerveau. Ces inclusions cytoplasmiques contiennent des agrégats de la protéine intrinsèquement désordonnée aSyn2. Dans la MP et d’autres synucléinopathies, aSyn se transforme d’un état désordonné soluble en un état malade insoluble et hautement structuré. Dans sa forme native, l’aSyn monomère adopte une large gamme de conformations stabilisées par des interactions électrostatiques à longue portée entre ses N- et C-termini et des interactions hydrophobes entre son terminus C et sa région NAC (NAC) 3,4,5,6. Toute perturbation de ces interactions stabilisatrices, telles que les mutations, les modifications post-traductionnelles et les changements dans l’environnement local, peut conduire à un mauvais repliement du monomère, déclenchant ainsi le processus d’agrégation7.
Bien qu’il existe une grande quantité de recherches sur les formes oligomères et fibrillaires d’aSyn 8,9,10,11, il est crucial d’étudier la forme monomère de la protéine et de mieux comprendre quels conformateurs sont fonctionnels (et comment) et lesquels sont sujets à l’agrégation 8,9,10,11 . Étant intrinsèquement désordonné, de seulement 14 kDa et difficile à cristalliser, le monomère aSyn ne se prête pas à la plupart des techniques biologiques structurelles. Cependant, une technique capable de mesurer la dynamique conformationnelle de l’aSyn monomère est la milliseconde HDX-MS, qui a récemment généré d’importantes observations structurelles qui seraient difficiles ou impossibles à obtenir autrement 12,13,14. Milliseconde HDX-MS mesure avec sensibilité la moyenne de l’ensemble conformationnel protéique en surveillant l’échange isotopique au niveau des hydrogènes amides, indiquant l’accessibilité au solvant et la participation au réseau de liaison hydrogène d’une région protéique particulière sur l’échelle de temps de la milliseconde. Il est nécessaire de souligner l’aspect milliseconde du HDX-MS car, en raison de sa nature méta-stable et dépliée nativement, aSyn présente une cinétique d’échange d’hydrogène très rapide qui se manifeste bien en dessous de la limite inférieure des systèmes HDX-MS conventionnels. Par exemple, la majeure partie de la molécule aSyn a complètement échangé de l’hydrogène contre du deutérium dans des conditions intracellulaires en moins de 1 s. Plusieurs laboratoires ont maintenant construit des instruments à mélange rapide; dans ce cas, un prototype d’instrument à flux de trempe à mélange rapide capable d’effectuer HDX-MS avec un temps mort de 50 ms et une résolution temporelle de 1 ms est utilisé15. Bien que la milliseconde HDX-MS ait récemment été extrêmement importante dans l’étude d’aSyn, elle est précieuse pour étudier plus largement les protéines /régions intrinsèquement désordonnées et un grand nombre de protéines dont les boucles / régions ne sont que faiblement stables. Par exemple, les médicaments peptidiques (p. ex., l’insuline; GLP-1/glucagon; tirzépatide) et les protéines de fusion peptidique (par exemple, l’inhibiteur du VIH FN3-L35-T1144) sont des formats de médicaments majeurs où les informations structurelles et de stabilité en phase de solution peuvent être un intrant critique pour les décisions de développement de médicaments, et, pourtant, la fraction peptidique n’est souvent que faiblement stable et intraitable par HDX-MS à l’échelle de tempsde seconde 16,17,18,19,20 . Il a été démontré que les méthodes émergentes HDX-MS avec marquage dans les domaines secondes/minutes dérivent des informations structurelles pour les quadruplex G de l’ADN, mais il devrait être possible de les étendre à des structures oligonucléotidiques plus diverses par l’application de HDX-MS21 millisecondes.
Les expériences HDX-MS peuvent être réalisées à trois niveaux différents : (1) ascendant (où la protéine marquée est digérée protéolytiquement), (2) intermédiaire (où la protéine marquée est digérée protéolytiquement, et les peptides résultants sont fragmentés davantage par des techniques de fragmentation douce), et (3) descendant (où les techniques de fragmentation douce fragmentent directement la protéine marquée)22 . Ainsi, les données hdX-MS sous-moléculaires nous permettent de localiser le comportement d’échange dans des régions spécifiques d’une protéine, ce qui rend essentiel d’avoir une couverture de séquence adéquate pour de telles expériences. La résolution structurelle de toute expérience HDX-MS repose sur le nombre de peptides protéolytiques ou de fragments dérivés de la protéine lors de la digestion ou de la fragmentation douce, respectivement. Dans chacun des trois types d’expériences décrits ci-dessus, le changement d’échange d’amide à chaque peptide / fragment est mappé sur la structure primaire de la protéine pour indiquer le comportement des régions localisées de la protéine. Bien que la résolution structurelle la plus élevée soit obtenue par fragmentation douce, la description de ces expériences est hors du cadre de la présente étude, qui se concentre sur la mesure des conformations de monomères aSyn. D’excellents résultats peuvent être obtenus avec le flux de travail « ascendant » couramment appliqué décrit ici.
Ici, des procédures sont fournies sur (1) comment préparer et manipuler des échantillons aSyn et des tampons HDX-MS, (2) comment effectuer une cartographie peptidique pour une expérience HDX-MS ascendante, (3) comment acquérir des données HDX-MS sur aSyn monomère dans des conditions physiologiques, en particulier dans le domaine temporel milliseconde (en utilisant un instrument personnalisé; des instruments alternatifs pour le marquage milliseconde ont également été décrits), et (4) comment traiter et analyser les données HDX-MS. Les méthodes utilisant l’aSyn monomère à pH physiologique (7,40) dans deux conditions de solution sont illustrées ici. Bien qu’elles soient d’une utilité critique dans l’étude d’aSyn, ces procédures peuvent être appliquées à n’importe quelle protéine et ne se limitent pas aux protéines intrinsèquement désordonnées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

L’alpha-synucléine (aSyn) est une protéine intrinsèquement désordonnée dont les agrégats fibrillaires sont abondants dans les corps de Lewy et les neurites, qui sont les caractéristiques de la maladie de Parkinson. Pourtant, une grande partie de son activité biologique, ainsi que son agrégation, implique de manière centrale la forme monomère soluble de la protéine. L’élucidation des mécanismes moléculaires de la biologie et de la physiopathologie d’aSyn nécessite des méthodes structurellement très résolues et est sensible aux conditions biologiques. Ses structures méta-stables dépliées nativement rendent l’aSyn monomère intraitable à de nombreuses techniques de biologie structurale. Ici, l’application d’une telle approche est décrite: spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium (HDX-MS) sur l’échelle de temps de la milliseconde pour l’étude de protéines à faible stabilité thermodynamique et à faibles facteurs de protection, tels que aSyn. À l’échelle de temps de la milliseconde, les données HDX-MS contiennent des informations sur l’accessibilité des solvants et la structure liée à l’hydrogène d’aSyn, qui sont perdues à des temps d’étiquetage plus longs, ce qui donne finalement une résolution structurelle jusqu’au niveau d’acide aminé. Par conséquent, HDX-MS peut fournir des informations à des résolutions structurelles et temporelles élevées sur la dynamique conformationnelle et la thermodynamique, les interactions intra- et intermoléculaires et l’impact structurel des mutations ou des altérations des conditions environnementales. Bien que largement applicable, il est démontré comment acquérir, analyser et interpréter des mesures HDX-MS millisecondes dans aSyn monomère.

En raison de sa nature intrinsèquement désordonnée, il est difficile de capturer les changements structurels complexes dans aSyn à pH physiologique. HDX-MS surveille l’échange isotopique au niveau des hydrogènes amides dorsaux, sondant la dynamique et les interactions conformationnelles des protéines. C’est l’une des rares techniques pour acquérir ces informations à des résolutions structurelles et temporelles élevées. Ce protocole est largement applicable à un large éventail de protéines et de condi...

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Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

L’ensemble structurel de l’alpha-synucléine monomérique affecte sa fonction physiologique et ses propriétés physico-chimiques. Le présent protocole décrit comment effectuer une spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde et des analyses de données ultérieures pour déterminer des informations conformationnelles sur le monomère de cette protéine intrinsèquement désordonnée dans des conditions physiologiques.

Spectrométrie de masse à échange hydrogène/deutérium milliseconde pour l’étude de la dynamique structurelle de l’alpha-synucléine dans des conditions physiologiques

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Tous les organismes ont un trouble dans leur protéome, estimé jusqu’à 33%Ces régions sont observables par spectrométrie de masse d’échange hydrogène/deutérium, mais seulement dans la plage de temps de la milliseconde. Notre protocole vous montrera comment le faire avec succès. Il s’agit d’une technique d’analyse entièrement automatisée.Il vous suffit de tout configurer, de programmer les mesures de temps souhaitées, de cliquer sur aller et de vous éloigner. Cette technique ouvre la possibilité passionnante de cribler des composés qui stabilisent les confirmations spécifiques de protéines intrinsèquement désordonnées telles que l’alpha-synucléine. Pour commencer la préparation de l’échantillon pour la cartographie peptidique, prélevez d’abord un flacon de stock de protéines alpha-synucléine stockées dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.Et une fois qu’il est décongelé, filtrez à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre. Ensuite, mesurez l’absorbance de la solution à 218 nanomètres pour déterminer la concentration en protéines en utilisant la loi de Beer-Lambert, et diluez la protéine avec un tampon d’équilibre à une concentration finale de cinq micromolaires. Ensuite, pour configurer le robot échantillonneur automatique, ajoutez 50 microlitres de la solution de protéines micromolaires à un flacon de récupération totale et placez le flacon en position d’échantillon dans la chambre droite de l’échange hydrogène/deutérium, ou HDX, robotique en ligne avec le spectromètre de masse.Ensuite, placez un flacon de tampon d’équilibre et deux flacons de tampon de lavage de pepsine aux positions de réactif un, quatre et cinq des chambres gauches et un flacon de tampon de trempe à la position de réactif un dans la chambre droite HDX et réglez la température à 20 degrés Celsius à l’aide du régulateur de température Peltier. Ajoutez ensuite un nombre égal de flacons de récupération totale et de flacons de récupération maximale dans les mêmes positions de réaction de la chambre gauche HDX et de la chambre droite HDX respectivement. Ensuite, configurez un exemple de liste avec les méthodes LC et MS appropriées dans le logiciel de planification et démarrez la planification.Pour obtenir la carte finale de couverture peptidique, organisez manuellement les affectations isotopiques dans le logiciel d’analyse de données DynamX HDX. Après avoir nettoyé l’instrument prototype Fast HDX, ouvrez l’interface utilisateur graphique du logiciel HDX compatible pour initialiser le système. Entrez 20 degrés Celsius et 0,5 degré Celsius comme températures de la chambre d’échantillonnage et de la chambre de trempe respectivement, puis cliquez sur définir pour appliquer les nouvelles températures.Pour nettoyer et préparer l’instrument, installez les tubes de centrifugeuse avec de l’eau de qualité LC / MS à toutes les entrées, puis vérifiez les seringues gauche et droite dans l’onglet de livraison de la plomberie du titreur et continuez à cliquer sur prime jusqu’à ce que toutes les bulles d’air latentes dans les tubes aient disparu. Pour cocher toutes les cases pour les seringues, allez d’abord dans l’onglet macros et cliquez sur calibrer la position d’accueil des seringues, puis cliquez d’abord sur la boucle de chargement de la seringue de lavage, puis sur laver tous les volumes de la boucle de mélange. S’il y a une bulle dans une seringue tampon, débranchez la seringue et dégazez-la en éjectant verticalement la bulle.Avant de recalibrer à la position zéro, remplacez la seringue. Pour configurer l’instrument prototype Fast HDX pour les expériences HDX, insérez d’abord le tube d’entrée de titrage gauche dans le flacon de récupération totale. Pour éviter l’oligomérisation et l’agrégation induites par la température, placez le tube dans un réfrigérateur de table.Ensuite, ajoutez 50 millilitres de tampons d’équilibre, d’étiquetage, de trempe et de lavage à la pepsine aux entrées tampons respectives dans les chambres droite et gauche de l’instrument, puis ajoutez 50 millilitres de tampon de lavage de colonne à l’entrée de lavage de pepsine. Pour amorcer les lignes de lavage des protéines et des colonnes, vérifiez les seringues droite et gauche dans l’onglet de livraison de la plomberie du titreur et cliquez une fois sur prime. Après avoir coché toutes les cases pour les seringues comme illustré précédemment, allez à l’onglet de débit de trempe manuelle pour entrer les paramètres requis.Pour une expérience de cours temporel, utilisez le bouton de point symbolique pour entrer les heures en millisecondes. Réglez ensuite le temps d’interruption sur trois et l’attente pour que la CLHP piège le temps plus le temps d’exécution plus 1,5 minutes. Si des expériences vides sont exécutées entre des exécutions d’échantillons, cliquez sur la case Exécuter vide après avoir vérifié une entrée dans le logiciel d’acquisition pour l’exécution vide après chaque exécution d’échantillon.Une fois que la liste d’exemples est prête et que les entrées appropriées ont été mises en surbrillance, démarrez l’exécution en cliquant sur lecture et Fast HDX dans le logiciel. Pour le traitement des données, ouvrez le menu fichier du fichier des peptides attribués spectralement à partir des expériences de cartographie des peptides et cliquez sur Ouvrir dans le logiciel DynamX, puis importez les fichiers bruts dans le logiciel DynamX. Après avoir ouvert le menu de données, cliquez sur MS Files.Pour créer des états pour chaque condition protéique étudiée, cliquez sur nouvel état. Pour ajouter chaque point temporel HDX, cliquez sur nouvelle exposition, puis sur nouveau brut. Pour importer des fichiers bruts, faites glisser chaque fichier à la bonne position et cliquez sur OK lorsque vous avez terminé.Après avoir attribué automatiquement des isotopes, organisez manuellement l’affectation isotopique pour garantir une qualité de données élevée. Exportez les données du cluster dans un fichier csv avec l’ordre des colonnes décrit dans le manuscrit. Ouvrez le menu de données dans le logiciel de mesure de masse et cliquez sur exporter les données du cluster.Pour l’analyse des données, chargez d’abord les données en cluster exportées dans le logiciel d’analyse HDX HDfleX. Pour adapter les données expérimentales à toutes les expériences et à tous les états, sélectionnez les méthodes de correction de back-exchange appropriées pour obtenir les constantes de vitesse observées pour la réaction HDX. Calculez ensuite un seuil de signification global à l’aide d’une méthode préférée dans HDfleX et effectuez des tests de signification hybride pour déterminer les différences significatives entre les états comparés.L’expérience de cartographie sur l’alpha-synucléine a généré une carte de couverture peptidique qui couvrait 100% de la séquence protéique avec une redondance moyenne de 3,79. De plus, ce protocole a permis la génération de courbes d’absorption du deutérium pour différents peptides de l’alpha-synucléine, qui ont ensuite été exprimées sous forme de graphiques ajustés et corrigés de l’échange arrière. Il était évident que la plupart des échanges hydrogène/deutérium dans l’alpha-synucléine se faisaient en une seconde.La différence conformationnelle entre les états A et B de l’alpha-synucléine était également évidente à partir de l’absorption plus élevée du deutérium par l’état B à la fois aux niveaux de peptide et d’acide aminé. Pour une technique aussi sensible, il est important d’utiliser des tests de signification statistique robustes lors de la comparaison des données. Ici, nous avons utilisé notre logiciel HDfleX.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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