Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
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NS wird durch das Diamond Jubilee Scholarship des Universitätsrats finanziert. JJP wird durch ein UKRI Future Leaders Fellowship [Fördernummer: MR/T02223X/1] unterstützt.

1. Proteinexpression und Reinigung von aSyn
<ol><li>Bereiten Sie aSyn nach einem zuvor veröffentlichten Berichtvor 9.</li>
	<li>Dialysieren Sie in einen sicheren Speicherpuffer (z. B. Tris, pH 7,2 ).</li>
	<li>Konzentrieren Sie bei Bedarf die Probe (z. B. Spinfilter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 3 kDa MWCO, 14.000 x g für ca. 10-30 min, siehe Materialtabelle). HINWEIS: Es wird empfohlen, sich nicht übermäßig zu konzentrieren. Die Integrität des...

Im vorliegenden Artikel werden die folgenden Verfahren beschrieben: (1) Durchführung von Peptid-Mapping-Experimenten an monomerem aSyn, um die höchste Sequenzabdeckung zu erhalten, (2) Erfassung von Millisekunden-HDX-MS-Daten auf monomerem aSyn unter physiologischen Bedingungen und (3) Durchführung von Datenanalysen und -interpretationen der resultierenden HDX-MS-Daten. Die bereitgestellten Verfahren sind im Allgemeinen einfach auszuführen, jedes Kennzeichnungsexperiment dauert in der Regel nur etwa 8 Stunden für dr...

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, von der weltweit Millionen von Menschen betroffensind 1. Es ist gekennzeichnet durch die Bildung von zytoplasmatischen Einschlüssen, die als Lewy-Körper und Lewy-Neuriten in der Substantia nigra pars compacta-Region des Gehirns bekannt sind. Es wurde festgestellt, dass diese zytoplasmatischen Einschlüsse Aggregate des intrinsisch ungeordneten Proteins aSyn2 enthalten. Bei PD und anderen Synucleinopathien wandelt sich aSyn von einem löslichen ungeordneten Zustand in einen unlöslichen, hochstrukturierten Krankheitszustand um. In seiner nativen Form nimmt das monomere aSyn eine breite Palette von Konformationen an, die durch langreichweitige elektrostatische Wechselwirkungen zwischen seinen N- und C-Termini und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen seinem C-Terminus und der Nicht-Amyloid-Beta-Komponente (NAC) Region 3,4,5,6 stabilisiert werden. Alle Störungen in diesen stabilisierenden Interaktionen, wie Mutationen, posttranslationale Modifikationen und Veränderungen in der lokalen Umgebung, können zur Fehlfaltung des Monomers führen und so den Prozess der Aggregation auslösen7.
Während eine große Menge an Forschung über die oligomeren und fibrillären Formen von aSyn 8,9,10,11 existiert, besteht ein entscheidender Bedarf, die monomere Form des Proteins zu untersuchen und besser zu verstehen, welche Konformer funktionell sind (und wie) und welche anfällig für Aggregatesind 8,9,10,11 . Da das aSyn-Monomer intrinsisch ungeordnet ist, nur 14 kDa groß ist und schwer zu kristallisieren ist, ist es für die meisten strukturbiologischen Techniken nicht zugänglich. Eine Technik, die in der Lage ist, die Konformationsdynamik des monomeren aSyn zu messen, ist jedoch die Millisekunde HDX-MS, die in letzter Zeit wichtige strukturelle Beobachtungen hervorgebracht hat, die sonst schwierig oder unmöglich zu erhaltenwären 12,13,14. Die Millisekunde HDX-MS misst sensitiv den Durchschnitt des Proteinkonformationsensembles, indem sie den Isotopenaustausch an Amidwasserstoffen überwacht und die Zugänglichkeit von Lösungsmitteln und die Beteiligung des Wasserstoffbrückennetzwerks einer bestimmten Proteinregion auf der Millisekunden-Zeitskala anzeigt. Es ist notwendig, den Millisekundenaspekt des HDX-MS hervorzuheben, da aSyn aufgrund seiner nativ entfalteten, metastabilen Natur eine sehr schnelle Wasserstoffaustauschkinetik aufweist, die sich deutlich unter der unteren Grenze herkömmlicher HDX-MS-Systeme manifestiert. Zum Beispiel hat der größte Teil des aSyn-Moleküls Wasserstoff unter intrazellulären Bedingungen in weniger als 1 s vollständig gegen Deuterium ausgetauscht. Mehrere Labore haben inzwischen Schnellmischgeräte gebaut; In diesem Fall wird ein Prototyp eines schnell mischenden Quench-Flow-Instruments verwendet, das HDX-MS mit einer Totzeit von 50 ms und einer zeitlichen Auflösung von 1 ms ausführen kann15. Während Millisekunden-HDX-MS in letzter Zeit bei der Untersuchung von aSyn akut wichtig war, ist es wertvoll für die Untersuchung von intrinsisch ungeordneten Proteinen / Regionen im weiteren Sinne und einer großen Anzahl von Proteinen mit Schleifen / Regionen, die nur schwach stabil sind. Zum Beispiel Peptidarzneimittel (z. B. Insulin; GLP-1/Glucagon; Tirzepatid) und Peptidfusionsproteine (z. B. der HIV-Inhibitor FN3-L35-T1144) sind wichtige Arzneimittelformate, in denen Struktur- und Stabilitätsinformationen der Lösungsphase ein kritischer Input für Entscheidungen zur Arzneimittelentwicklung sein können, und dennoch ist die Peptideinheit durch HDX-MS auf der Sekundenskala 16,17,18,19,20 oft nur schwach stabil und hartnäckig. . Es hat sich gezeigt, dass emergente HDX-MS-Methoden mit Markierung in den Sekunden/Minuten-Domänen strukturelle Informationen für DNA-G-Quadruplexe ableiten, aber es sollte möglich sein, diese durch die Anwendung von Millisekunden-HDX-MS21 auf vielfältigere Oligonukleotidstrukturen auszudehnen.
HDX-MS-Experimente können auf drei verschiedenen Ebenen durchgeführt werden: (1) bottom-up (wobei das markierte Protein proteolytisch verdaut wird), (2) Middle-Down (wobei das markierte Protein proteolytisch verdaut wird und die resultierenden Peptide durch Soft-Fragmentierungstechniken weiter fragmentiert werden) und (3) Top-Down (wobei Soft-Fragmentierungstechniken das markierte Protein direkt fragmentieren)22 . Submolekulare HDX-MS-Daten ermöglichen es uns daher, das Austauschverhalten auf bestimmte Regionen eines Proteins zu lokalisieren, was es für solche Experimente entscheidend macht, eine ausreichende Sequenzabdeckung zu haben. Die strukturelle Auflösung eines HDX-MS-Experiments hängt von der Anzahl der proteolytischen Peptide oder Fragmente ab, die bei der Verdauung bzw. Weichfragmentierung aus dem Protein stammen. In jedem der drei oben beschriebenen Experimenttypen wird die Änderung des Amidaustauschs an jedem Peptid / Fragment auf die Primärstruktur des Proteins zurückgebildet, um das Verhalten lokalisierter Regionen des Proteins anzuzeigen. Während die höchste strukturelle Auflösung durch Soft-Fragmentierung erreicht wird, liegt die Beschreibung dieser Experimente außerhalb des Rahmens der aktuellen Studie, die sich auf die Messung von aSyn-Monomer-Konformationen konzentriert. Hervorragende Ergebnisse können mit dem hier beschriebenen häufig angewendeten "Bottom-up"-Workflow erzielt werden.
Hier werden Verfahren zur Verfügung gestellt, (1) wie man aSyn-Proben und HDX-MS-Puffer vorbereitet und handhabt, (2) wie man ein Peptid-Mapping für ein Bottom-up-HDX-MS-Experiment durchführt, (3) wie man HDX-MS-Daten auf monomerem aSyn unter physiologischen Bedingungen, insbesondere im Millisekunden-Zeitbereich, erfasst (mit einem speziell angefertigten Instrument; alternative Instrumente zur Millisekundenmarkierung wurden ebenfalls beschrieben), und (4) wie die HDX-MS-Daten verarbeitet und analysiert werden. Methoden zur Verwendung von monomerem aSyn bei physiologischem pH-Wert (7,40) in zwei Lösungsbedingungen werden hier veranschaulicht. Obwohl diese Verfahren für die Untersuchung von aSyn von entscheidender Bedeutung sind, können sie auf jedes Protein angewendet werden und sind nicht auf intrinsisch ungeordnete Proteine beschränkt.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

Alpha-Synuclein (aSyn) ist ein intrinsisch ungeordnetes Protein, dessen fibrilläre Aggregate in Lewy-Körpern und Neuriten, den Kennzeichen der Parkinson-Krankheit, reichlich vorhanden sind. Ein Großteil seiner biologischen Aktivität sowie seine Aggregation betreffen jedoch zentral die lösliche Monomerform des Proteins. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen der aSyn-Biologie und Pathophysiologie erfordert strukturell hochaufgelöste Methoden und ist empfindlich gegenüber biologischen Bedingungen. Seine nativ entfalteten, metastabilen Strukturen machen monomere aSyn für viele strukturbiologische Techniken unlösbar. Hier wird die Anwendung eines solchen Ansatzes beschrieben: Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) auf der Millisekunden-Zeitskala zur Untersuchung von Proteinen mit geringer thermodynamischer Stabilität und schwachen Schutzfaktoren, wie z.B. aSyn. Auf der Millisekunden-Zeitskala enthalten HDX-MS-Daten Informationen über die Zugänglichkeit von Lösungsmitteln und die wasserstoffgebundene Struktur von aSyn, die bei längeren Markierungszeiten verloren gehen, was letztendlich zu einer strukturellen Auflösung bis zum Aminosäureniveau führt. Daher kann HDX-MS bei hohen strukturellen und zeitlichen Auflösungen Informationen über Konformationsdynamik und Thermodynamik, intra- und intermolekulare Wechselwirkungen und die strukturellen Auswirkungen von Mutationen oder Veränderungen der Umweltbedingungen liefern. Obwohl breit anwendbar, wird gezeigt, wie Millisekunden-HDX-MS-Messungen in monomeren aSyn erfasst, analysiert und interpretiert werden können.

Aufgrund seiner intrinsisch ungeordneten Natur ist es schwierig, die komplizierten strukturellen Veränderungen in aSyn bei physiologischem pH-Wert zu erfassen. HDX-MS überwacht den Isotopenaustausch an Backbone-Amid-Wasserstoffen und untersucht die Proteinkonformationsdynamik und -wechselwirkungen. Es ist eine der wenigen Techniken, diese Informationen mit hohen strukturellen und zeitlichen Auflösungen zu erfassen. Dieses Protokoll ist allgemein auf eine breite Palette von Proteinen und Pufferbedingungen anwendbar, un...

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Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Das strukturelle Ensemble des monomeren Alpha-Synucleins beeinflusst seine physiologische Funktion und seine physikalisch-chemischen Eigenschaften. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie und anschließende Datenanalysen durchgeführt werden können, um Konformationsinformationen über das Monomer dieses intrinsisch ungeordneten Proteins unter physiologischen Bedingungen zu bestimmen.

Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Untersuchung der Alpha-Synuclein-Strukturdynamik unter physiologischen Bedingungen

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Alle Organismen haben eine Störung in ihrem Proteom, geschätzt bis zu 33%Diese Regionen sind durch Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie beobachtbar, jedoch nur im Millisekunden-Zeitbereich. Unser Protokoll zeigt Ihnen, wie Sie dies erfolgreich tun können. Dies ist eine vollautomatische Analysetechnik.Du stellst einfach alles ein, programmierst die gewünschten Zeitmessungen, klickst auf Go und gehst weg. Diese Technik eröffnet die aufregende Möglichkeit, nach Verbindungen zu suchen, die spezifische Bestätigungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen wie Alpha-Synuclein stabilisieren. Um mit der Probenvorbereitung für die Peptidkartierung zu beginnen, nehmen Sie zunächst eine Durchstechflasche mit gespeichertem Alpha-Synuclein-Proteinbestand aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius.Und sobald es aufgetaut ist, filtern Sie mit einem 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter. Messen Sie dann die Absorption der Lösung bei 218 Nanometern, um die Proteinkonzentration mit dem Beer-Lambertschen Gesetz zu bestimmen, und verdünnen Sie das Protein mit Gleichgewichtspuffer auf eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren. Als nächstes, um den Autosampler-Roboter einzurichten, fügen Sie 50 Mikroliter der fünf mikromolaren Proteinlösung zu einer Gesamtrückgewinnungsdurchstechflasche hinzu und platzieren Sie die Durchstechflasche in der Probenposition in der rechten Kammer des Wasserstoff / Deuterium-Austauschs oder HDX, Robotik in Übereinstimmung mit dem Massenspektrometer.Legen Sie dann eine Durchstechflasche mit Gleichgewichtspuffer und zwei Durchstechflaschen mit Pepsinkünschepuffer in die Reagenzpositionen eins, vier und fünf der linken Kammern und eine Durchstechflasche mit Abschreckpuffer, um eine in der rechten HDX-Kammer zu positionieren, und stellen Sie die Temperatur mit dem Peltier-Temperaturregler auf 20 Grad Celsius ein. Fügen Sie dann eine gleiche Anzahl von Gesamtrückgewinnungsfläschchen und Durchstechflaschen mit maximaler Rückgewinnung in den gleichen Reaktionspositionen der linken HDX-Kammer bzw. der rechten HDX-Kammer hinzu. Richten Sie anschließend eine Beispielliste mit entsprechenden LC- und MS-Methoden in der Planungssoftware ein und starten Sie den Zeitplan.Um die endgültige Peptidabdeckungskarte zu erhalten, kuratieren Sie die Isotopenzuweisungen manuell in der DynamX HDX-Datenanalysesoftware. Öffnen Sie nach der Reinigung des Fast HDX-Prototyp-Instruments die grafische Benutzeroberfläche der kompatiblen HDX-Software, um das System zu initialisieren. Geben Sie 20 Grad Celsius bzw. 0,5 Grad Celsius als Probenkammer- bzw. Abschreckkammertemperatur ein, gefolgt von einem Klick auf Einstellen, um die neuen Temperaturen anzuwenden.Um das Instrument zu reinigen und vorzubereiten, richten Sie die Zentrifugenröhrchen an allen Einlässen mit LC / MS-Wasser ein, überprüfen Sie dann sowohl die linke als auch die rechte Spritze in der Titrator-Sanitärzufuhrregisterkarte und klicken Sie weiter, bis alle latenten Luftblasen in den Röhrchen verschwunden sind. Um alle Kontrollkästchen für Spritzen zu aktivieren, gehen Sie zuerst zur Registerkarte Makros und klicken Sie auf die Ausgangsposition der Spritzen kalibrieren, dann zuerst auf Spritzenladeschleife waschen, gefolgt von allen Mischschleifenvolumina waschen. Wenn sich eine Blase in einer Pufferspritze befindet, trennen Sie die Spritze und entgasen Sie sie, indem Sie die Blase vertikal ausstoßen.Ersetzen Sie die Spritze vor der Neukalibrierung auf die Nullposition. Um das Fast HDX-Prototypinstrument für HDX-Experimente einzurichten, führen Sie zunächst das linke Titrationseinlassrohr in die Durchstechflasche mit Gesamtrückgewinnung ein. Um eine temperaturbedingte Oligomerisierung und Aggregation zu verhindern, legen Sie das Rohr in einen Tischkühlschrank.Als nächstes fügen Sie 50 Milliliter Gleichgewichts-, Beschriftungs-, Quench- und Pepsin-Waschpuffer zu den jeweiligen Puffereinlässen in der rechten und linken Kammer des Instruments hinzu, gefolgt von der Zugabe von 50 Millilitern Säulenwaschpuffer zum Pepsinkischeinlass. Um die Protein- und Säulenwaschlinien zu grundieren, überprüfen Sie die rechten und linken Spritzen auf der Registerkarte Titrator Plumbing Delivery und klicken Sie einmal auf Prime. Nachdem Sie alle Kontrollkästchen für Spritzen aktiviert haben, wie zuvor gezeigt, gehen Sie zur Registerkarte Manueller Abschreckfluss, um die erforderlichen Einstellungen einzugeben.Verwenden Sie für ein Zeitkursexperiment die symbolische Punktschaltfläche, um die Zeiten in Millisekunden einzugeben. Stellen Sie dann die Trap-Zeit auf drei und warten Sie, bis die HPLC die Trap-Zeit plus Laufzeit plus 1,5 Minuten erreicht hat. Wenn leere Experimente zwischen Stichprobenläufen ausgeführt werden, klicken Sie auf das Feld leer ausführen, nachdem Sie nach jedem Beispiellauf einen Eintrag in der Erfassungssoftware für den leeren Lauf sichergestellt haben.Sobald die Beispielliste fertig ist und die entsprechenden Einträge markiert wurden, starten Sie den Lauf, indem Sie in der Software auf Play und Fast HDX klicken. Öffnen Sie für die Datenverarbeitung das Dateimenü der Datei der spektral zugewiesenen Peptide aus den Peptidkartierungsexperimenten und klicken Sie in der DynamX-Software auf Öffnen, und importieren Sie dann die Rohdateien in die DynamX-Software. Nachdem Sie das Datenmenü geöffnet haben, klicken Sie auf MS Files.Um Zustände für jeden untersuchten Proteinzustand zu erstellen, klicken Sie auf Neuer Zustand. Um jeden HDX-Zeitpunkt hinzuzufügen, klicken Sie auf Neue Belichtung und dann auf Neue Rohdaten. Um Rohdateien zu importieren, ziehen Sie jede Datei an die richtige Position und klicken Sie auf OK, wenn Sie fertig sind.Nachdem Sie Isotopen automatisch zugewiesen haben, kuratieren Sie die Isotopenzuweisung manuell, um eine hohe Datenqualität zu gewährleisten. Exportieren Sie die Clusterdaten in der CSV-Datei mit der im Manuskript beschriebenen Spaltenreihenfolge. Öffnen Sie das Datenmenü in der Massenmesssoftware und klicken Sie auf Clusterdaten exportieren.Für die Datenanalyse laden Sie zunächst die exportierten Clusterdaten in die HDX-Analysesoftware HDfleX. Um die experimentellen Daten für alle Experimente und Zustände anzupassen, wählen Sie die entsprechenden Back-Exchange-Korrekturmethoden aus, um die beobachteten Ratenkonstanten für die HDX-Reaktion zu erhalten. Berechnen Sie dann einen globalen Signifikanzschwellenwert mit einer bevorzugten Methode in HDfleX und führen Sie hybride Signifikanztests durch, um die signifikanten Unterschiede zwischen den verglichenen Staaten zu bestimmen.Das Mapping-Experiment auf Alpha-Synuclein erzeugte eine Peptiddeckungskarte, die 100% der Proteinsequenz mit einer durchschnittlichen Redundanz von 3,79 abdeckte. Darüber hinaus ermöglichte dieses Protokoll die Generierung von Deuterium-Aufnahmekurven für verschiedene Peptide von Alpha-Synuclein, die dann als angepasste und rückaustauschkorrigierte Graphen exprimiert wurden. Es war offensichtlich, dass der größte Teil des Wasserstoff/Deuterium-Austauschs in Alpha-Synuclein um eine Sekunde abgeschlossen war.Der Konformationsunterschied zwischen den Zuständen A und B von Alpha-Synuclein zeigte sich auch in der höheren Deuteriumaufnahme durch den Zustand B sowohl auf Peptid- als auch auf Aminosäureebene. Für eine so empfindliche Technik ist es wichtig, beim Vergleich von Daten robuste statistische Signifikanztests zu verwenden. Hier haben wir unsere Software HDfleX eingesetzt.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Die orale Verabreichung von Rotenon mit einem Gavage und Bildanalyse von Alpha-Synuclein Einschlüsse in den enterischen Nervensystem

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Die Implantation von miniosmotische Pumpen und Lieferung von Tract Tracer Brain Reorganisation in pathophysiologischen Bedingungen Studieren

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

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In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

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