Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

NS ממומן על ידי מלגת יובל היהלומים של מועצת האוניברסיטה. JJP נתמך על ידי מלגת מנהיגי העתיד של UKRI [מספר מענק: MR/T02223X/1].

1. ביטוי חלבונים וטיהור של aSyn
<ol><li>הכן aSyn בעקבות דו"ח9 שפורסם בעבר.</li>
	<li>דיאליזה למאגר אחסון בטוח (למשל, Tris, pH 7.2 ).</li>
	<li>במידת הצורך, רכזו את הדגימה (לדוגמה, צינורות מיקרו-צנטריפוג' של מסנן ספין באמצעות 3 kDa MWCO, 14,000 x g למשך כ-10-30 דקות, ראו טבלת חומרים). הערה: מו?...

במאמר הנוכחי מתוארים ההליכים הבאים: (1) ביצוע ניסויי מיפוי פפטידים על aSyn מונומרי כדי לקבל את כיסוי הרצף הגבוה ביותר, (2) רכישת נתוני HDX-MS של אלפיות השנייה על aSyn מונומרי בתנאים פיזיולוגיים, ו-(3) ביצוע ניתוח נתונים ופרשנות של נתוני HDX-MS המתקבלים. ההליכים המסופקים הם בדרך כלל פשוטים לביצוע, כל ניסו...

מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה נוירודגנרטיבית המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם1. הוא מאופיין על ידי היווצרות של תכלילים ציטופלסמיים הידועים בשם גופי לוי ונויריטים לוי באזור substantia nigra pars compacta של המוח. תכלילים ציטופלסמיים אלה נמצאו כמכילים אגרגטים של החלבון aSyn2 בעל הפרעה פנימית. ב-PD ובסינוקלינופתיות אחרות, aSyn הופך ממצב של הפרעה מסיסה למצב מחלה בלתי מסיס ומובנה מאוד. בצורתו המקורית, aSyn מונומרית מאמצת מגוון רחב של קונפורמציות המיוצבות על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות ארוכות טווח בין N ו-C-termini שלה לבין אינטראקציות הידרופוביות בין C-terminus שלה לבין רכיב בטא שאינו עמילואידי (NAC) באזור 3,4,5,6. כל שיבוש באותן אינטראקציות מייצבות, כגון מוטציות, שינויים לאחר תרגום ושינויים בסביבה המקומית, יכול להוביל לקיפול שגוי של המונומר, ובכך לעורר את תהליך הצבירה7.
בעוד שקיימת כמות עצומה של מחקר על הצורות האוליגומריות והפיברילאריות של aSyn 8,9,10,11, יש צורך מכריע לחקור את הצורה המונומרית של החלבון ולהבין טוב יותר אילו קונפורמרים מתפקדים (וכיצד) ואילו נוטים לצבור 8,9,10,11 . בהיותו בעל הפרעה פנימית, רק בגודל 14 kDa, וקשה להתגבש, המונומר aSyn אינו מקובל על רוב הטכניקות הביולוגיות המבניות. עם זאת, טכניקה אחת המסוגלת למדוד את הדינמיקה הקונפורמיונלית של aSyn מונומרית היא אלפית השנייה HDX-MS, אשר יצרה לאחרונה תצפיות מבניות חשובות שיהיו מאתגרות או בלתי אפשריות להשיג אחרת 12,13,14. אלפית השנייה HDX-MS מודדת ברגישות את הממוצע של ההרכב הקונפורמציה של החלבון על ידי ניטור ההחלפה האיזוטופית באמיד מימן, מה שמעיד על נגישות ממסים והשתתפות ברשת קשרי מימן של אזור חלבון מסוים על ציר הזמן של אלפית השנייה. יש צורך להדגיש את ההיבט של אלפית השנייה של HDX-MS שכן, בשל אופיו המטא-יציב, המתגלגל באופן מקורי, aSyn מציג קינטיקה מהירה מאוד של חילופי מימן המתבטאת הרבה מתחת לגבול התחתון של מערכות HDX-MS קונבנציונליות. לדוגמה, רוב מולקולת aSyn החליפה לחלוטין מימן עבור דאוטריום בתנאים תוך תאיים בפחות משנייה אחת. מספר מעבדות בנו כעת מכשור ערבוב מהיר; במקרה זה, אב טיפוס של מכשיר זרימת מרווה מהיר בערבוב מהיר המסוגל לבצע HDX-MS עם זמן מת של 50 אלפיות השנייה ורזולוציה זמנית של 1 אלפיות השנייה משמש15. בעוד אלפית השנייה HDX-MS היה לאחרונה חשוב מאוד במחקר של aSyn, זה עומד להיות בעל ערך בחקר חלבונים / אזורים מופרעים במהותם באופן נרחב יותר ומספר רב של חלבונים עם לולאות / אזורים שהם רק יציבים חלשה. לדוגמה, תרופות פפטידיות (למשל, אינסולין; GLP-1/גלוקגון; tirzepatide) וחלבוני היתוך פפטידים (למשל, מעכב ה- HIV FN3-L35-T1144) הם פורמטים עיקריים של תרופות שבהן מידע מבני ויציבות בשלב התמיסה יכול להיות קלט קריטי להחלטות פיתוח תרופות, ובכל זאת, הפפטיד מואטי הוא לעתים קרובות רק יציב חלש ובלתי ניתן לתיקון על ידי HDX-MS בלוח הזמנים של השניות 16,17,18,19,20 . שיטות HDX-MS מתפתחות עם תיוג בתחומים של שניות/דקות הוכחו כמפיקות מידע מבני עבור דנ"א G-quadxes, אך יש לאפשר להרחיב זאת למבנים אוליגונוקלאוטידים מגוונים יותר על ידי יישום של אלפית השנייה HDX-MS21.
ניסויי HDX-MS יכולים להתבצע בשלוש רמות שונות: (1) מלמטה למעלה (לפיה החלבון המסומן מתעכל באופן פרוטאוליטי), (2) אמצע-מטה (לפיו החלבון המסומן מתעכל באופן פרוטאוליטי, והפפטידים המתקבלים מקוטעים עוד יותר על ידי טכניקות פיצול רך), ו-(3) מלמעלה למטה (לפיהם טכניקות פיצול רך מפרקות ישירות את החלבון המסומן)22 . לפיכך, נתוני HDX-MS תת-מולקולריים מאפשרים לנו להתאים את התנהגות החליפין לאזורים ספציפיים של חלבון, מה שהופך את זה לחיוני שיהיה כיסוי רצפים הולם לניסויים כאלה. הרזולוציה המבנית של כל ניסוי HDX-MS מסתמכת על מספר הפפטידים או השברים הפרוטאוליטיים שמקורם בחלבון בעת העיכול או בפיצול רך, בהתאמה. בכל אחד משלושת סוגי הניסויים שתוארו לעיל, השינוי בחילופי האמיד בכל פפטיד/מקטע ממופה בחזרה למבנה הראשוני של החלבון כדי להצביע על התנהגותם של אזורים מקומיים של החלבון. בעוד שהרזולוציה המבנית הגבוהה ביותר מושגת באמצעות פיצול רך, התיאור של ניסויים אלה הוא מחוץ לתחום המחקר הנוכחי, המתמקד במדידת קונפורמציות מונומר aSyn. תוצאות מצוינות ניתן להשיג עם זרימת העבודה הנפוצה "מלמטה למעלה" המתוארת כאן.
כאן, ניתנים נהלים על (1) כיצד להכין ולטפל בדגימות aSyn ובמאגרי HDX-MS, (2) כיצד לבצע מיפוי פפטידים עבור ניסוי HDX-MS מלמטה למעלה, (3) כיצד לרכוש נתוני HDX-MS על aSyn מונומרי בתנאים פיזיולוגיים, במיוחד בתחום הזמן של אלפית השנייה (באמצעות מכשיר שנבנה בהתאמה אישית; תוארו גם מכשירים חלופיים לתיוג אלפיות השנייה), וכן (4) כיצד לעבד ולנתח את נתוני HDX-MS. שיטות המשתמשות ב- aSyn מונומרי ב- pH פיזיולוגי (7.40) בשני מצבי תמיסה מודגמות כאן. למרות שהם שימושיים באופן קריטי במחקר של aSyn, הליכים אלה יכולים להיות מיושמים על כל חלבון ואינם מוגבלים לחלבונים עם הפרעה פנימית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

אלפא-סינוקלאין (aSyn) הוא חלבון בעל הפרעה פנימית, שאגרגטי הפיברילאר שלו מצויים בשפע בגופי לוי ובנוייריטים, שהם סימני ההיכר של מחלת הפרקינסון. עם זאת, חלק גדול מהפעילות הביולוגית שלו, כמו גם הצבירה שלו, כוללים באופן מרכזי את צורת המונומר המסיסה של החלבון. הבהרת המנגנונים המולקולריים של הביולוגיה והפתופיזיולוגיה של aSyn דורשת שיטות פתורות מאוד מבחינה מבנית והיא רגישה לתנאים ביולוגיים. המבנים המטא-יציבים שלה, המתגלגלים באופן מקורי, הופכים את ה-aSyn המונומרי לבלתי ניתן לתיקון לטכניקות רבות של ביולוגיה מבנית. כאן מתואר היישום של גישה אחת כזו: ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן/דאוטריום (HDX-MS) על ציר הזמן של אלפית השנייה לחקר חלבונים עם יציבות תרמודינמית נמוכה וגורמי הגנה חלשים, כגון aSyn. בקנה מידה של אלפית השנייה, נתוני HDX-MS מכילים מידע על נגישות הממס ועל המבנה הקשור למימן של aSyn, אשר הולכים לאיבוד בזמני תיוג ארוכים יותר, ובסופו של דבר מניבים רזולוציה מבנית עד לרמת חומצות האמינו. לכן, HDX-MS יכול לספק מידע ברזולוציות מבניות וטמפורליות גבוהות על דינמיקה קונפורמציה ותרמודינמיקה, אינטראקציות תוך-מולקולריות ובין-מולקולריות, וההשפעה המבנית של מוטציות או שינויים בתנאים הסביבתיים. למרות שהוא ישים באופן נרחב, הוא מודגם כיצד לרכוש, לנתח ולפרש מדידות HDX-MS של אלפיות השנייה ב- aSyn מונומרי.

בשל אופיו המופרע במהותו, קשה ללכוד את השינויים המבניים המורכבים ב- aSyn ב- pH פיזיולוגי. HDX-MS מנטרת חילופי איזוטופים במימן אמיד בעמוד השדרה, וחוקרת את הדינמיקה הקונפורמציה של החלבון ואת האינטראקציות. זוהי אחת הטכניקות הבודדות לרכוש מידע זה ברזולוציות מבניות וזמניות גבוהות. פרוטוקול זה ישים בא...

Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

ההרכב המבני של אלפא-סינוקלאין מונומרי משפיע על תפקודו הפיזיולוגי ועל תכונותיו הפיזיקוכימיות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבצע ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה וניתוחי נתונים מאוחרים יותר כדי לקבוע מידע קונפורמי על המונומר של חלבון זה בעל הפרעה פנימית בתנאים פיזיולוגיים.

ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה לחקר הדינמיקה המבנית של אלפא-סינוקלאין בתנאים פיזיולוגיים

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

לכל האורגניזמים יש הפרעה בפרוטאום שלהם, המוערך עד 33% אזורים אלה ניתנים לצפייה על ידי ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום, אך רק בטווח הזמן של אלפיות השנייה. הפרוטוקול שלנו יראה לך כיצד לעשות זאת בהצלחה. זוהי טכניקה אנליטית אוטומטית לחלוטין.אתה פשוט מגדיר הכל, מתכנת את מדידות הזמן הרצויות, מכה ללכת וללכת משם. טכניקה זו פותחת את ההזדמנות המרגשת של סינון לתרכובות המייצבות אישורים ספציפיים של חלבונים בעלי הפרעה פנימית כגון אלפא-סינוקלאין. כדי להתחיל בהכנת דגימה למיפוי פפטידים, קחו תחילה בקבוקון של מלאי חלבון אלפא-סינוקלאין מאוחסן מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס.וברגע שהוא מופשר, סנן באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן מדוד את ספיגת התמיסה ב-218 ננומטר כדי לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות חוק באר-למברט, ולדלל את החלבון עם חיץ שיווי משקל לריכוז סופי של חמישה מיקרומולרים. לאחר מכן, כדי להגדיר את הרובוט autosampler, להוסיף 50 microliters של תמיסת החלבון micromolar חמשת המיקרומולריים לבקבוקון התאוששות כולל, ולמקם את הבקבוקון במצב הדגימה בתא הימני של חילופי מימן /דאוטריום, או HDX, רובוטיקה בקנה אחד עם ספקטרומטר המסה.לאחר מכן שים בקבוקון אחד של חיץ שיווי משקל ושני בקבוקונים של חיץ שטיפת פפסין למיקומי ריאגנטים אחד, ארבעה וחמישה מהתאים השמאליים ובקבוקון אחד של חיץ מרווה למיקום מגיב אחד בתא הימני HDX וקבע את הטמפרטורה על 20 מעלות צלזיוס באמצעות בקר הטמפרטורה Peltier. לאחר מכן הוסף מספר שווה של בקבוקוני התאוששות כוללים ובקבוקוני התאוששות מרביים באותן עמדות תגובה של התא השמאלי HDX והתא הימני HDX בהתאמה. לאחר מכן, הגדר רשימה לדוגמה עם שיטות LC ו- MS מתאימות בתוכנת התזמון והתחל את לוח הזמנים.כדי לקבל את מפת הכיסוי הפפטידית הסופית, אצור באופן ידני את המשימות האיזוטופיות בתוכנת ניתוח הנתונים DynamX HDX. לאחר ניקוי מכשיר אב הטיפוס Fast HDX, פתח את ממשק המשתמש הגרפי של תוכנת HDX התואמת כדי לאתחל את המערכת. הזן 20 מעלות צלזיוס ו-0.5 מעלות צלזיוס כתא המדגם וטמפרטורות תא המרווה בהתאמה, ולאחר מכן לחץ על סט כדי להחיל את הטמפרטורות החדשות.כדי לנקות ולהכין את המכשיר, הגדירו את צינורות הצנטריפוגה עם מים ברמת LC/MS בכל הכניסות, ולאחר מכן בדקו את המזרקים השמאליים והימניים בלשונית אספקת הצנרת של הטיטרטור והמשיכו ללחוץ על פריים עד שכל בועות האוויר החבויות בצינורות נעלמו. כדי לסמן את כל התיבות עבור מזרקים, תחילה עבור אל הכרטיסייה macros ולחץ על מיקום הבית של מזרקי כיול, ולאחר מכן לחץ תחילה על לולאת טעינת מזרקי שטיפה, ולאחר מכן שטפו את כל אמצעי האחסון של לולאת הערבוב. אם יש בועה כלשהי במזרק חיץ, נתקו את המזרק ונטרלו אותו על ידי פליטה אנכית של הבועה.לפני שתחזור למצב האפס, החלף את המזרק. להגדרת אב הטיפוס של מכשיר אב הטיפוס Fast HDX לניסויים ב-HDX, הכנס תחילה את צינור כניסת הטיטרציה השמאלי לתוך בקבוקון ההתאוששות הכולל. כדי למנוע אוליגומריזציה וצבירה הנגרמות על ידי טמפרטורה, הניחו את הצינור במקרר שולחני.לאחר מכן, הוסיפו 50 מיליליטרים של שיווי משקל, תיוג, מרווה ומחיצני שטיפה של פפסין לכניסות החיץ המתאימות בתאים הימניים והשמאליים של המכשיר, ולאחר מכן הוסיפו 50 מיליליטרים של חיץ שטיפת עמודים לכניסת הכביסה של פפסין. להחדרת קווי שטיפת החלבון והעמודה, בדקו את המזרקים הימניים והשמאליים בכרטיסיית ההספקה של האינסטלציה של טיטרטור ולחצו על פריים פעם אחת. לאחר סימון כל התיבות לאיתור מזרקים כפי שהודגם קודם לכן, עבור לכרטיסיית זרימת המרווה הידנית כדי להזין את ההגדרות הנדרשות.לניסוי במסלול זמן, השתמש בלחצן הנקודה הסמלית כדי להזין את הזמנים באלפיות השנייה. לאחר מכן הגדר את זמן ההשמנה לשלושה ואת ההמתנה ל- HPLC כדי ללכוד את הזמן בתוספת זמן ריצה בתוספת 1.5 דקות. אם ניסויים ריקים מופעלים בין ריצות לדוגמה, לחץ על התיבה הרצה הריקה לאחר שתוודא ערך בתוכנת הרכישה עבור הריצה הריקה לאחר כל הרצת דגימה.לאחר שהרשימה לדוגמה מוכנה והערכים המתאימים הודגשו, התחל את הריצה על ידי לחיצה על הפעל ו- Fast HDX בתוכנה. לעיבוד נתונים, פתח את תפריט הקבצים של קובץ הפפטידים שהוקצו באופן ספקטרלי מניסויי מיפוי הפפטידים ולחץ על פתח בתוכנת DynamX, ולאחר מכן יבא את הקבצים הגולמיים לתוכנת DynamX. לאחר פתיחת תפריט הנתונים, לחץ על קבצי MS.כדי ליצור מצבים עבור כל מצב חלבון הנחקר, לחץ על מצב חדש. כדי להוסיף כל נקודת זמן של HDX, לחץ על חשיפה חדשה ולאחר מכן לחץ על raw חדש. כדי לייבא קבצים גולמיים, גרור כל קובץ למיקום הנכון ולחץ על אישור בסיום.לאחר הקצאה אוטומטית של איזוטופים, אצור באופן ידני את ההקצאה האיזוטופית כדי להבטיח איכות נתונים גבוהה. ייצא את נתוני האשכול בקובץ csv עם סדר העמודות כמתואר בכתב היד. פתח את תפריט הנתונים בתוכנת מדידת ההמונים ולחץ על נתוני אשכול ייצוא.לניתוח נתונים, תחילה טען את הנתונים המקובצים המקובצים המואשלים המיוצאים לתוכנת ניתוח HDX HDfleX. כדי להתאים את נתוני הניסוי עבור כל הניסויים והמצבים, בחר את שיטות תיקון חילופי הגב המתאימות כדי לקבל את קבועי הקצב הנצפים עבור תגובת HDX. לאחר מכן חשבו סף מובהקות גלובלי באמצעות שיטה מועדפת ב-HDfleX ובצעו בדיקות מובהקות היברידית כדי לקבוע את ההבדלים המשמעותיים בין המדינות בהשוואה.ניסוי המיפוי על אלפא-סינוקלאין יצר מפת כיסוי פפטידית שכיסתה 100% מרצף החלבונים עם יתירות ממוצעת של 3.79. יתר על כן, פרוטוקול זה איפשר יצירת עקומות ספיגת דאוטריום עבור פפטידים שונים של אלפא-סינוקלאין, אשר לאחר מכן באו לידי ביטוי כגרפים מותאמים והחלפה אחורית מתוקנת. ניכר היה שרוב חילופי המימן/דאוטריום באלפא-סינוקלאין נעשו בשנייה אחת.ההבדל הקונפורמי בין מצבים A ו-B של אלפא-סינוקלאין ניכר גם מספיגת הדאוטריום הגבוהה יותר על ידי מצב B הן ברמת הפפטיד והן ברמת חומצות האמינו. עבור טכניקה כה רגישה, חשוב להשתמש במבחני מובהקות סטטיסטית חזקים בעת השוואת נתונים. כאן, השתמשנו בתוכנה שלנו HDfleX.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

השרשה של Miniosmotic משאבות ומשלוח של קליעים נותבים בדרכי לחקר מוח בארגון מחדש תנאי pathophysiological

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...