Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
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एनएस विश्वविद्यालय परिषद डायमंड जुबली छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित है। जेजेपी को यूकेआरआई फ्यूचर लीडर्स फैलोशिप [अनुदान संख्या: एमआर / टी 02223 एक्स / 1] द्वारा समर्थित किया गया है।

1. प्रोटीन अभिव्यक्ति और एसिन की शुद्धि
<ol><li>पहले प्रकाशित रिपोर्ट9 के बाद एएसवाईएन तैयार करें।</li>
	<li>एक सुरक्षित भंडारण बफर (जैसे, ट्रिस, पीएच 7.2) में डायलिज़ करें।</li>
	<li>यदि आवश्यक हो, तो नमूना...

वर्तमान लेख में, निम्नलिखित प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है: (1) उच्चतम अनुक्रम कवरेज प्राप्त करने के लिए मोनोमेरिक एएसवाईएन पर पेप्टाइड मैपिंग प्रयोग करना, (2) शारीरिक स्थितियों के तहत मोनोमेरिक एएसवा...

पार्किंसंस रोग (पीडी) एक न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है जो दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करतीहै 1. यह साइटोप्लाज्मिक समावेशन के गठन की विशेषता है जिसे मस्तिष्क के मूल नाइग्रा पार्स कॉम्पैक्टा क्षेत्र में लेवी निकायों और लेवी न्यूराइट्स के रूप में जाना जाता है। इन साइटोप्लाज्मिक समावेशनों में आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन एसिन2 के समुच्चय पाए गए हैं। पीडी और अन्य सिन्यूक्लिनोपैथी में, एएसवाईएन घुलनशील अव्यवस्थित अवस्था से एक अघुलनशील, अत्यधिक संरचित रोगग्रस्त अवस्था में बदल जाता है। अपने मूल रूप में, मोनोमेरिक एसिन अपने एन- और सी-टर्मिनी के बीच लंबी दूरी के इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन और इसके सी-टर्मिनस और गैर-एमिलॉयड बीटा घटक (एनएसी) क्षेत्र 3,4,5,6 के बीच हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन द्वारा स्थिर रचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को गोद लेता है। उन स्थिर इंटरैक्शन में कोई भी व्यवधान, जैसे उत्परिवर्तन, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, और स्थानीय वातावरण में परिवर्तन, मोनोमर के मिसफोल्डिंग का कारण बन सकता है, इस प्रकार एकत्रीकरण7 की प्रक्रिया को ट्रिगर कर सकता है।
जबकि एएसवाईएन 8,9,10,11 के ओलिगोमेरिक और फाइब्रिलर रूपों पर बड़ी मात्रा में शोध मौजूद है, प्रोटीन के मोनोमेरिक रूप का अध्ययन करने और बेहतर ढंग से समझने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है कि कौन से अनुरूप कार्यात्मक हैं (और कैसे) और जो कुल 8,9,10,11 से ग्रस्त हैं . आंतरिक रूप से अव्यवस्थित होने के नाते, आकार में केवल 14 केडीए, और क्रिस्टलीकृत करना मुश्किल है, एएसवाईएन मोनोमर अधिकांश संरचनात्मक जैविक तकनीकों के लिए उत्तरदायी नहीं है। हालांकि, मोनोमेरिक एसिन की रचनात्मक गतिशीलता को मापने में सक्षम एक तकनीक मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस है, जिसने हाल ही में महत्वपूर्ण संरचनात्मक टिप्पणियां उत्पन्न की हैं जो अन्यथा12,13,14 प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण या असंभव होगा। मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस संवेदनशील रूप से एमाइड हाइड्रोजन पर आइसोटोपिक एक्सचेंज की निगरानी करके प्रोटीन विरूपण पहनावा के औसत को मापता है, जो मिलीसेकंड टाइमस्केल पर एक विशेष प्रोटीन क्षेत्र की विलायक पहुंच और हाइड्रोजन-बॉन्डिंग नेटवर्क भागीदारी का संकेत देता है। एचडीएक्स-एमएस के मिलीसेकंड पहलू पर जोर देना आवश्यक है, क्योंकि इसकी मूल रूप से प्रकट, मेटा-स्थिर प्रकृति के कारण, एएसवाईएन बहुत तेजी से हाइड्रोजन-एक्सचेंज कैनेटीक्स प्रदर्शित करता है जो पारंपरिक एचडीएक्स-एमएस सिस्टम की निचली सीमा से नीचे अच्छी तरह से प्रकट होता है। उदाहरण के लिए, अधिकांश एएसवाईएन अणु ने 1 एस से कम समय में इंट्रासेल्युलर स्थितियों के तहत ड्यूटेरियम के लिए हाइड्रोजन का पूरी तरह से आदान-प्रदान किया है। कई प्रयोगशालाओं ने अब तेजी से मिश्रण इंस्ट्रूमेंटेशन का निर्माण किया है; इस मामले में, 50 एमएस के मृत समय के साथ एचडीएक्स-एमएस करने में सक्षम एक प्रोटोटाइप फास्ट-मिक्सिंग क्वेंच-फ्लो इंस्ट्रूमेंट और 1 एमएस के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन का उपयोग15 किया जाता है। जबकि मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस हाल ही में एएसवाईएन के अध्ययन में तीव्रता से महत्वपूर्ण रहा है, यह आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन / क्षेत्रों का अधिक व्यापक रूप से अध्ययन करने में मूल्यवान है और छोरों / क्षेत्रों के साथ बड़ी संख्या में प्रोटीन जो केवल कमजोर रूप से स्थिर हैं। उदाहरण के लिए, पेप्टाइड दवाएं (जैसे, इंसुलिन; जीएलपी -1 / ग्लूकागन; टिर्जेपेटाइड) और पेप्टाइड-फ्यूजन प्रोटीन (जैसे, एचआईवी अवरोधक एफएन 3-एल 35-टी 1144) प्रमुख दवा प्रारूप हैं जहां समाधान-चरण संरचनात्मक और स्थिरता की जानकारी दवा विकास निर्णयों के लिए एक महत्वपूर्ण इनपुट हो सकती है, और फिर भी, पेप्टाइड मॉइटी अक्सर एचडीएक्स-एमएस द्वारा सेकंड टाइमस्केल16,17,18,19,20 पर केवल कमजोर रूप से स्थिर और असभ्य होता है . मिनट डोमेन में लेबलिंग के साथ आकस्मिक एचडीएक्स-एमएस विधियों को डीएनए जी-क्वाड्रप्लेक्स के लिए संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस21 के आवेदन द्वारा इसे अधिक विविध ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संरचनाओं तक विस्तारित करना संभव होना चाहिए।
एचडीएक्स-एमएस प्रयोगों को तीन अलग-अलग स्तरों पर किया जा सकता है: (1) बॉटम-अप (जिससे लेबल प्रोटीन प्रोटियोलिटिक रूप से पच जाता है), (2) मिडिल-डाउन (जिससे लेबल प्रोटीन प्रोटियोलिटिक रूप से पच जाता है, और परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स को नरम-विखंडन तकनीकों द्वारा आगे खंडित किया जाता है), और (3) टॉप-डाउन (जिससे नरम-विखंडन तकनीक सीधे लेबल प्रोटीन को खंडित करती है)22 . इस प्रकार, उप-आणविक एचडीएक्स-एमएस डेटा हमें प्रोटीन के विशिष्ट क्षेत्रों में विनिमय व्यवहार को स्थानीयकृत करने की अनुमति देता है, जिससे ऐसे प्रयोगों के लिए पर्याप्त अनुक्रम कवरेज होना महत्वपूर्ण हो जाता है। किसी भी एचडीएक्स-एमएस प्रयोग का संरचनात्मक संकल्प क्रमशः पाचन या नरम-विखंडन पर प्रोटीन से प्राप्त प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड्स या टुकड़ों की संख्या पर निर्भर करता है। ऊपर उल्लिखित तीन प्रयोग प्रकारों में से प्रत्येक में, प्रत्येक पेप्टाइड /टुकड़े पर एमाइड एक्सचेंज में परिवर्तन प्रोटीन के स्थानीयकृत क्षेत्रों के व्यवहार को इंगित करने के लिए प्रोटीन की प्राथमिक संरचना पर वापस मैप किया जाता है। जबकि उच्चतम संरचनात्मक संकल्प नरम-विखंडन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, इन प्रयोगों का विवरण वर्तमान अध्ययन के दायरे से बाहर है, जो एएसवाईएन मोनोमर रचनाओं के माप पर केंद्रित है। यहां वर्णित आमतौर पर लागू "बॉटम-अप" वर्कफ़्लो के साथ उत्कृष्ट परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।
यहां, प्रक्रियाएं (1) एएसआईएन नमूनों और एचडीएक्स-एमएस बफर को कैसे तैयार और संभालें, (2) बॉटम-अप एचडीएक्स-एमएस प्रयोग के लिए पेप्टाइड मैपिंग कैसे करें, (3) शारीरिक स्थितियों के तहत मोनोमेरिक एएसवाईएन पर एचडीएक्स-एमएस डेटा कैसे प्राप्त करें, विशेष रूप से मिलीसेकंड टाइम डोमेन में (कस्टम-निर्मित उपकरण का उपयोग करके; मिलीसेकंड लेबलिंग के लिए वैकल्पिक उपकरण भी वर्णित किए गए हैं), और (4) एचडीएक्स-एमएस डेटा को कैसे संसाधित और विश्लेषण करें। दो समाधान स्थितियों में शारीरिक पीएच (7.40) पर मोनोमेरिक एसिन का उपयोग करने के तरीके यहां उदाहरण दिए गए हैं। जबकि एएसवाईएन के अध्ययन में गंभीर रूप से उपयोगी है, इन प्रक्रियाओं को किसी भी प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन तक सीमित नहीं है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

अल्फा-सिन्यूक्लिन (एएसवाईएन) एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन है जिसका फाइब्रिलर समुच्चय लेवी निकायों और न्यूराइट्स में प्रचुर मात्रा में होता है, जो पार्किंसंस रोग की पहचान हैं। फिर भी, इसकी अधिकांश जैविक गतिविधि, साथ ही इसके एकत्रीकरण में प्रोटीन का घुलनशील मोनोमर रूप शामिल है। एएसवाईएन जीव विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी के आणविक तंत्र की व्याख्या के लिए संरचनात्मक रूप से अत्यधिक हल किए गए तरीकों की आवश्यकता होती है और जैविक स्थितियों के प्रति संवेदनशील होता है। इसकी मूल रूप से प्रकट, मेटा-स्थिर संरचनाएं मोनोमेरिक एसिन को कई संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीकों के लिए असभ्य बनाती हैं। यहां, इस तरह के एक दृष्टिकोण के आवेदन का वर्णन किया गया है: कम थर्मोडायनामिक स्थिरता और कमजोर सुरक्षा कारकों, जैसे कि एसिन के साथ प्रोटीन के अध्ययन के लिए मिलीसेकंड टाइमस्केल पर हाइड्रोजन / मिलीसेकंड टाइमस्केल पर, एचडीएक्स-एमएस डेटा में एसिन की विलायक पहुंच और हाइड्रोजन-बंधुआ संरचना के बारे में जानकारी होती है, जो लंबे समय तक लेबलिंग समय पर खो जाती है, अंततः अमीनो एसिड स्तर तक संरचनात्मक संकल्प उत्पन्न करती है। इसलिए, एचडीएक्स-एमएस विरूपण गतिशीलता और थर्मोडायनामिक्स, इंट्रा- और इंटर-आणविक इंटरैक्शन, और पर्यावरणीय परिस्थितियों में उत्परिवर्तन या परिवर्तन के संरचनात्मक प्रभाव पर उच्च संरचनात्मक और लौकिक संकल्पों पर जानकारी प्रदान कर सकता है। मोटे तौर पर लागू होने पर, यह प्रदर्शित किया जाता है कि मोनोमेरिक एसिन में मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस माप कैसे प्राप्त, विश्लेषण और व्याख्या करें।

इसकी आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रकृति के कारण, शारीरिक पीएच पर एएसवाईएन में जटिल संरचनात्मक परिवर्तनों को पकड़ना मुश्किल है। एचडीएक्स-एमएस रीढ़ की हड्डी एमाइड हाइड्रोजन पर आइसोटोपिक एक्सचेंज पर नज?...

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Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

मोनोमेरिक अल्फा-सिन्यूक्लिन का संरचनात्मक पहनावा इसके शारीरिक कार्य और भौतिक रासायनिक गुणों को प्रभावित करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि शारीरिक परिस्थितियों में इस आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के मोनोमर पर रचनात्मक जानकारी निर्धारित करने के लिए मिलीसेकंड हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम-एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री और बाद के डेटा विश्लेषण कैसे करें।

ड्यूटेरियम-एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री शारीरिक स्थितियों के तहत अल्फा-सिन्यूक्लिन संरचनात्मक गतिशीलता के अध्ययन के लिए

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

सभी जीवों के प्रोटिओम में विकार होता है, 33% तक अनुमानित ये क्षेत्र हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अवलोकन योग्य होते हैं, लेकिन केवल मिलीसेकंड टाइम रेंज में। हमारा प्रोटोकॉल आपको दिखाएगा कि इसे सफलतापूर्वक कैसे किया जाए। यह एक पूरी तरह से स्वचालित विश्लेषणात्मक तकनीक है।आप बस सब कुछ सेट करते हैं, वांछित समय माप प्रोग्राम करते हैं, हिट करते हैं और दूर चलते हैं। यह तकनीक यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग के रोमांचक अवसर को खोलती है जो आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन जैसे अल्फा-सिन्यूक्लिन की विशिष्ट पुष्टियों को स्थिर करती है। पेप्टाइड मैपिंग के लिए नमूना तैयारी शुरू करने के लिए, पहले शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से संग्रहीत अल्फा-सिन्यूक्लिन प्रोटीन स्टॉक की एक शीशी लें।और एक बार जब यह पिघल जाता है, तो 0.22 माइक्रोमीटर सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें। फिर बीयर-लैम्बर्ट के नियम का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 218 नैनोमीटर पर समाधान के अवशोषण को मापें, और पांच माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए संतुलन बफर के साथ प्रोटीन को पतला करें। इसके बाद, ऑटोसैंपलर रोबोट स्थापित करने के लिए, कुल वसूली शीशी में पांच माइक्रोमोलर प्रोटीन समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के अनुरूप हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज, या एचडीएक्स, रोबोटिक्स के दाहिने कक्ष में नमूना स्थिति में शीशी रखें।फिर संतुलन बफर की एक शीशी और पेप्सिन वॉश बफर की दो शीशियों को अभिकर्मक पदों एक, चार और पांच बाएं कक्षों में रखें और एचडीएक्स दाएं कक्ष में अभिकर्मक स्थिति के लिए बुझाने के बफर की एक शीशी डालें और पेल्टियर तापमान नियंत्रक का उपयोग करके तापमान को 20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। फिर क्रमशः एचडीएक्स बाएं कक्ष और एचडीएक्स दाएं कक्ष की समान प्रतिक्रिया स्थितियों में कुल वसूली शीशियों और अधिकतम वसूली शीशियों की एक समान संख्या जोड़ें। अगला, शेड्यूलिंग सॉफ़्टवेयर में उपयुक्त एलसी और एमएस विधियों के साथ एक नमूना सूची सेट करें और शेड्यूल शुरू करें।अंतिम पेप्टाइड कवरेज मानचित्र प्राप्त करने के लिए, मैन्युअल रूप से डायनेमएक्स एचडीएक्स डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में आइसोटोपिक असाइनमेंट को क्यूरेट करें। फास्ट एचडीएक्स प्रोटोटाइप इंस्ट्रूमेंट की सफाई के बाद, सिस्टम को प्रारंभ करने के लिए संगत एचडीएक्स सॉफ़्टवेयर के ग्राफिकल यूजर इंटरफेस को खोलें। नमूना कक्ष और बुझाने कक्ष तापमान के रूप में क्रमशः 20 डिग्री सेल्सियस और 0.5 डिग्री सेल्सियस दर्ज करें, इसके बाद नए तापमान को लागू करने के लिए सेट पर क्लिक करें।एमएस ग्रेड पानी के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूबों को सभी इनलेट्स पर सेट करें, फिर टिट्रेटर नलसाजी वितरण टैब में बाएं और दाएं दोनों सिरिंज की जांच करें और ट्यूबों में सभी अव्यक्त हवा के बुलबुले चले जाने तक प्राइम पर क्लिक करना जारी रखें। सिरिंज के लिए सभी बक्से की जांच करने के लिए, पहले मैक्रोज़ टैब पर जाएं और कैलिब्रेट सिरिंज होम पोजिशन पर क्लिक करें, फिर पहले वॉश सिरिंज लोड लूप पर क्लिक करें, उसके बाद सभी मिक्सिंग लूप वॉल्यूम को धो लें। यदि बफर सिरिंज में कोई बुलबुला है, तो सिरिंज को डिस्कनेक्ट करें और बुलबुले को लंबवत रूप से बाहर निकालकर इसे डीगैस करें।शून्य स्थिति में पुन: कैलिब्रेट करने से पहले, सिरिंज को बदलें। एचडीएक्स प्रयोगों के लिए फास्ट एचडीएक्स प्रोटोटाइप उपकरण स्थापित करने के लिए, पहले कुल वसूली शीशी में बाएं अनुमापन इनलेट ट्यूब डालें। तापमान-प्रेरित ऑलिगोमेराइजेशन और एकत्रीकरण को रोकने के लिए, ट्यूब को टेबलटॉप फ्रिज में रखें।अगला, साधन के दाएं और बाएं कक्षों में संबंधित बफर इनलेट्स में संतुलन, लेबलिंग, बुझाने और पेप्सिन वॉश बफर के 50 मिलीलीटर जोड़ें, इसके बाद पेप्सिन वॉश इनलेट में कॉलम वॉश बफर के 50 मिलीलीटर जोड़ें। प्रोटीन और कॉलम वॉश लाइनों को भड़काने के लिए, टिट्रेटर नलसाजी वितरण टैब में दाएं और बाएं सिरिंज की जांच करें और एक बार प्राइम पर क्लिक करें। पहले दिखाए गए सिरिंज के लिए सभी बक्से की जांच करने के बाद, आवश्यक सेटिंग्स दर्ज करने के लिए मैनुअल क्वेंच फ्लो टैब पर जाएं।एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग के लिए, मिलीसेकंड में समय दर्ज करने के लिए प्रतीकात्मक डॉट बटन का उपयोग करें। फिर ट्रैप समय को तीन पर सेट करें और एचपीएलसी के लिए समय प्लस रन टाइम प्लस 1.5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। यदि नमूना रन के बीच रिक्त प्रयोग चलाए जाते हैं, तो प्रत्येक नमूना चलाने के बाद रिक्त रन के लिए अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में प्रविष्टि सुनिश्चित करने के बाद रन रिक्त बॉक्स पर क्लिक करें।एक बार नमूना सूची तैयार हो जाने और उपयुक्त प्रविष्टियों को हाइलाइट करने के बाद, सॉफ़्टवेयर में प्ले और फास्ट एचडीएक्स पर क्लिक करके रन शुरू करें। डेटा प्रोसेसिंग के लिए, पेप्टाइड मैपिंग प्रयोगों से स्पेक्ट्रली असाइन किए गए पेप्टाइड्स की फ़ाइल का फ़ाइल मेनू खोलें और डायनामएक्स सॉफ़्टवेयर में ओपन पर क्लिक करें, फिर कच्ची फ़ाइलों को डायनामएक्स सॉफ़्टवेयर में आयात करें। डेटा मेनू खोलने के बाद, एमएस फ़ाइलों पर क्लिक करें।अध्ययन की जा रही प्रत्येक प्रोटीन स्थिति के लिए राज्य बनाने के लिए, नए राज्य पर क्लिक करें। प्रत्येक एचडीएक्स समय बिंदु जोड़ने के लिए, नए एक्सपोज़र पर क्लिक करें, फिर नए कच्चे पर क्लिक करें। कच्ची फ़ाइलें आयात करने के लिए, प्रत्येक फ़ाइल को सही स्थिति में खींचें और समाप्त होने पर ठीक क्लिक करें.स्वचालित रूप से आइसोटोप असाइन करने के बाद, उच्च डेटा गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए आइसोटोपिक असाइनमेंट को मैन्युअल रूप से क्यूरेट करें। पांडुलिपि में वर्णित कॉलम क्रम के साथ सीएसवी फ़ाइल में क्लस्टर डेटा निर्यात करें। बड़े पैमाने पर माप सॉफ्टवेयर में डेटा मेनू खोलें और निर्यात क्लस्टर डेटा पर क्लिक करें।डेटा विश्लेषण के लिए, पहले निर्यात किए गए संकुल डेटा को एचडीएक्स विश्लेषण सॉफ़्टवेयर एचडीफ्लेक्स में लोड करें। सभी प्रयोगों और राज्यों के लिए प्रयोगात्मक डेटा फिट करने के लिए, HDX प्रतिक्रिया के लिए मनाया दर स्थिरांक प्राप्त करने के लिए उपयुक्त वापस विनिमय सुधार विधियों का चयन करें। फिर एचडीफ्लेक्स में एक पसंदीदा विधि का उपयोग करके एक वैश्विक महत्व सीमा की गणना करें और तुलना में राज्यों में महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए हाइब्रिड महत्व परीक्षण करें।अल्फा-सिन्यूक्लिन पर मानचित्रण प्रयोग ने एक पेप्टाइड कवरेज मानचित्र उत्पन्न किया जो 3.79 की औसत अतिरेक के साथ प्रोटीन अनुक्रम के 100% को कवर करता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल ने अल्फा-सिन्यूक्लिन के विभिन्न पेप्टाइड्स के लिए ड्यूटेरियम अपटेक घटता की पीढ़ी को सक्षम किया, जिसे तब फिट और बैक एक्सचेंज सही रेखांकन के रूप में व्यक्त किया गया था। यह स्पष्ट था कि अल्फा-सिन्यूक्लिन में अधिकांश हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम विनिमय एक सेकंड द्वारा किया गया था।अल्फा-सिन्यूक्लिन के राज्यों ए और बी के बीच विरूपण अंतर पेप्टाइड और अमीनो एसिड दोनों स्तरों पर राज्य बी द्वारा उच्च ड्यूटेरियम अपटेक से भी स्पष्ट था। इस तरह की संवेदनशील तकनीक के लिए, डेटा की तुलना करते समय मजबूत सांख्यिकीय महत्व परीक्षणों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। यहां, हमने अपने सॉफ़्टवेयर एचडीफ्लेक्स का उपयोग किया।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Rotenone के मौखिक प्रशासन आंत्र तंत्रिका तंत्र में एक Gavage और अल्फा synuclein Inclusions की छवि विश्लेषण का उपयोग

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Parkinsonian दिमाग से घुलनशील और अघुलनशील अल्फा-synuclein की अनुक्रमिक निष्कर्षण

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

में गहराई शारीरिक माउस vomeronasal अंग की तीव्र ऊतक स्लाइस में परिभाषित सेल आबादी के विश्लेषण

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

कोरोनरी की तरह शर्तों के तहत इन विट्रो में Astrocyte जेट और प्रसार की निगरानी

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

MALDI इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए चूहा मस्तिष्क के ऊतकों में जांच और gangliosides के दृश्य के लिए दान मैट्रिक्स की उच्च बनाने की क्रिया

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

ट्रांसजेनिक चूहों में neuroinflammation की bioluminescence इमेजिंग अल्फा-synuclein तंतुओं के परिधीय इनोकुलेशन के बाद

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

माइक्रो-इलेक्ट्रोड एरेज़ पर न्यूरोनल सेल संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए नेटवर्क रिस्पांस में समय पर निर्भर वृद्धि

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

उंनमनी Auris लंग्स वोल्टेज क्लैंप शर्तों के तहत स्तनधारी Neuromuscular ट्रांसमिशन की परीक्षा के लिए तैयारी

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...