Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
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NS è finanziato dalla borsa di studio Diamond Jubilee del Consiglio universitario. JJP è supportato da una UKRI Future Leaders Fellowship [Numero di sovvenzione: MR/T02223X/1].

1. Espressione proteica e purificazione di aSyn
<ol><li>Preparare aSyn seguendo un report pubblicato in precedenza9.</li>
	<li>Dializzare in un tampone di conservazione sicuro (ad esempio, Tris, pH 7,2 ).</li>
	<li>Se necessario, concentrare il campione (ad esempio, tubi microcentrifuga con filtro spin utilizzando 3 kDa MWCO, 14.000 x g per circa 10-30 minuti, vedere Tabella dei materiali). NOTA: Si consiglia di non concentrarsi eccessivamente. L'int...

Nel presente articolo vengono descritte le seguenti procedure: (1) esecuzione di esperimenti di mappatura peptidica su aSyn monomerico per ottenere la massima copertura di sequenza, (2) acquisizione di dati HDX-MS millisecondi su aSyn monomerico in condizioni fisiologiche e (3) esecuzione di analisi dei dati e interpretazione dei dati HDX-MS risultanti. Le procedure fornite sono generalmente semplici da eseguire, ogni esperimento di etichettatura dura in genere solo circa 8 ore per tre repliche e otto punti temporali e l...

Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa che colpisce milioni di persone in tutto il mondo1. È caratterizzato dalla formazione di inclusioni citoplasmatiche note come corpi di Lewy e neuriti di Lewy nella regione della substantia nigra pars compacta del cervello. Queste inclusioni citoplasmatiche sono state trovate per contenere aggregati della proteina intrinsecamente disordinata aSyn2. Nel PD e in altre sinucleinopatie, aSyn si trasforma da uno stato disordinato solubile in uno stato malato insolubile e altamente strutturato. Nella sua forma nativa, l'aSyn monomerico adotta una vasta gamma di conformazioni stabilizzate da interazioni elettrostatiche a lungo raggio tra i suoi N- e C-termini e interazioni idrofobiche tra la sua regione C-terminus e la componente beta non amiloide (NAC) 3,4,5,6. Eventuali interruzioni in queste interazioni stabilizzanti, come mutazioni, modifiche post-traduzionali e cambiamenti nell'ambiente locale, possono portare al misfolding del monomero, innescando così il processo di aggregazione7.
Mentre esiste una grande quantità di ricerche sulle forme oligomeriche e fibrillari di aSyn 8,9,10,11, c'è un bisogno cruciale di studiare la forma monomerica della proteina e capire meglio quali conformisti sono funzionali (e come) e quali sono inclini ad aggregare 8,9,10,11 . Essendo intrinsecamente disordinato, solo 14 kDa di dimensioni e difficile da cristallizzare, il monomero aSyn non è suscettibile alla maggior parte delle tecniche biologiche strutturali. Tuttavia, una tecnica in grado di misurare la dinamica conformazionale di aSyn monomerico è millisecondo HDX-MS, che ha recentemente generato importanti osservazioni strutturali che sarebbero difficili o impossibili da ottenere altrimenti 12,13,14. Millisecond HDX-MS misura sensibilmente la media dell'insieme conformazionale proteico monitorando lo scambio isotopico a idrogeno ammidico, indicando l'accessibilità al solvente e la partecipazione alla rete di legame a idrogeno di una particolare regione proteica sulla scala temporale del millisecondo. È necessario sottolineare l'aspetto millisecondo dell'HDX-MS poiché, a causa della sua natura meta-stabile e dispiegata nativamente, aSyn presenta una cinetica di scambio idrogeno molto veloce che si manifesta ben al di sotto del limite inferiore dei sistemi HDX-MS convenzionali. Ad esempio, la maggior parte della molecola aSyn ha completamente scambiato idrogeno per deuterio in condizioni intracellulari in meno di 1 s. Diversi laboratori hanno ora costruito strumentazione a miscelazione rapida; in questo caso, viene utilizzato un prototipo di strumento a flusso di spegnimento a miscelazione rapida in grado di eseguire HDX-MS con un tempo morto di 50 ms e una risoluzione temporale di 1 ms15. Mentre il millisecondo HDX-MS è stato recentemente molto importante nello studio di aSyn, è importante per studiare proteine / regioni intrinsecamente disordinate più ampiamente e un gran numero di proteine con loop / regioni che sono solo debolmente stabili. Ad esempio, farmaci peptidici (ad esempio, insulina; GLP-1/glucagone; tirzepatide) e le proteine di fusione peptidica (ad esempio, l'inibitore dell'HIV FN3-L35-T1144) sono i principali formati farmacologici in cui le informazioni strutturali e di stabilità in fase di soluzione possono essere un input critico per le decisioni di sviluppo del farmaco e, tuttavia, la porzione peptidica è spesso solo debolmente stabile e intrattabile da HDX-MS alla scala temporale dei secondi 16,17,18,19,20 . I metodi emergenti HDX-MS con etichettatura nei domini secondi/minuti hanno dimostrato di ricavare informazioni strutturali per i G-quadruplex del DNA, ma dovrebbe essere possibile estenderlo a strutture oligonucleotidiche più diverse mediante l'applicazione di HDX-MS21 al millisecondo.
Gli esperimenti HDX-MS possono essere eseguiti a tre diversi livelli: (1) bottom-up (per cui la proteina etichettata viene digerita proteoliticamente), (2) middle-down (in cui la proteina etichettata viene digerita proteoliticamente e i peptidi risultanti vengono ulteriormente frammentati da tecniche di soft-fragmentation) e (3) top-down (per cui le tecniche di soft-fragmentation frammentano direttamente la proteina etichettata)22 . Pertanto, i dati sub-molecolari HDX-MS ci consentono di localizzare il comportamento di scambio in regioni specifiche di una proteina, rendendo fondamentale avere un'adeguata copertura della sequenza per tali esperimenti. La risoluzione strutturale di qualsiasi esperimento HDX-MS si basa sul numero di peptidi proteolitici o frammenti derivati dalla proteina durante la digestione o la frammentazione morbida, rispettivamente. In ciascuno dei tre tipi di esperimento sopra descritti, il cambiamento nello scambio ammidico in ogni peptide / frammento è mappato sulla struttura primaria della proteina per indicare il comportamento delle regioni localizzate della proteina. Mentre la massima risoluzione strutturale è raggiunta attraverso la frammentazione morbida, la descrizione di questi esperimenti è fuori dallo scopo del presente studio, che si concentra sulla misurazione delle conformazioni monomeriche aSyn. Risultati eccellenti possono essere ottenuti con il flusso di lavoro "bottom-up" comunemente applicato descritto qui.
Qui vengono fornite procedure su (1) come preparare e gestire campioni aSyn e buffer HDX-MS, (2) come eseguire la mappatura peptidica per un esperimento HDX-MS bottom-up, (3) come acquisire dati HDX-MS su aSyn monomerico in condizioni fisiologiche, in particolare nel dominio del tempo millisecondo (utilizzando uno strumento personalizzato; sono stati descritti anche strumenti alternativi per l'etichettatura dei millisecondi), e (4) come elaborare e analizzare i dati HDX-MS. I metodi che utilizzano aSyn monomerico a pH fisiologico (7.40) in due condizioni di soluzione sono esemplificati qui. Sebbene siano di fondamentale utilità nello studio di aSyn, queste procedure possono essere applicate a qualsiasi proteina e non sono limitate alle proteine intrinsecamente disordinate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

L'alfa-sinucleina (aSyn) è una proteina intrinsecamente disordinata i cui aggregati fibrillari sono abbondanti nei corpi di Lewy e nei neuriti, che sono i segni distintivi della malattia di Parkinson. Tuttavia, gran parte della sua attività biologica, così come la sua aggregazione, coinvolge centralmente la forma monomerica solubile della proteina. La delucidazione dei meccanismi molecolari di aSyn biologia e fisiopatologia richiede metodi strutturalmente altamente risolti ed è sensibile alle condizioni biologiche. Le sue strutture meta-stabili dispiegate nativamente rendono l'aSyn monomerico intrattabile a molte tecniche di biologia strutturale. Qui, viene descritta l'applicazione di uno di questi approcci: spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio (HDX-MS) sulla scala temporale al millisecondo per lo studio di proteine con bassa stabilità termodinamica e deboli fattori di protezione, come aSyn. Alla scala temporale del millisecondo, i dati HDX-MS contengono informazioni sull'accessibilità al solvente e sulla struttura legata all'idrogeno di aSyn, che vengono perse a tempi di etichettatura più lunghi, producendo in definitiva una risoluzione strutturale fino al livello di amminoacidi. Pertanto, HDX-MS può fornire informazioni ad alte risoluzioni strutturali e temporali sulla dinamica conformazionale e la termodinamica, le interazioni intra e intermolecolari e l'impatto strutturale di mutazioni o alterazioni delle condizioni ambientali. Sebbene ampiamente applicabile, è dimostrato come acquisire, analizzare e interpretare misurazioni HDX-MS al millisecondo in aSyn monomerico.

A causa della sua natura intrinsecamente disordinata, è difficile catturare gli intricati cambiamenti strutturali in aSyn a pH fisiologico. HDX-MS monitora lo scambio isotopico a idrogeno ammidico della spina dorsale, sondando le dinamiche e le interazioni conformazionali delle proteine. È una delle poche tecniche per acquisire queste informazioni ad alte risoluzioni strutturali e temporali. Questo protocollo è ampiamente applicabile a una vasta gamma di proteine e condizioni tampone, e questo è esemplificato dalla m...

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Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

L'insieme strutturale dell'alfa-sinucleina monomerica influenza la sua funzione fisiologica e le proprietà fisico-chimiche. Il presente protocollo descrive come eseguire la spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo e le successive analisi dei dati per determinare le informazioni conformazionali sul monomero di questa proteina intrinsecamente disordinata in condizioni fisiologiche.

Spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo per lo studio della dinamica strutturale dell'alfa-sinucleina in condizioni fisiologiche

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Tutti gli organismi hanno disordine nel loro proteoma, stimato fino al 33% Queste regioni sono osservabili mediante spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio, ma solo nell'intervallo di tempo millisecondo. Il nostro protocollo ti mostrerà come farlo con successo. Questa è una tecnica analitica completamente automatizzata.Basta impostare tutto, programmare le misurazioni del tempo desiderato, premere vai e vai via. Questa tecnica apre l'entusiasmante opportunità di screening per composti che stabilizzano conferme specifiche di proteine intrinsecamente disordinate come l'alfa-sinucleina. Per iniziare la preparazione del campione per la mappatura dei peptidi, prima prendere una fiala di proteina alfa-sinucleina immagazzinata dal congelatore a meno 80 gradi Celsius.E una volta scongelato, filtrare usando un filtro a siringa da 0,22 micrometri. Quindi misurare l'assorbanza della soluzione a 218 nanometri per determinare la concentrazione proteica usando la legge di Beer-Lambert e diluire la proteina con tampone di equilibrio a una concentrazione finale di cinque micromolari. Successivamente, per configurare il robot autocampionatore, aggiungere 50 microlitri della soluzione proteica a cinque micromolari a una fiala di recupero totale e posizionare la fiala nella posizione del campione nella camera destra dello scambio idrogeno/deuterio, o HDX, robotica in linea con lo spettrometro di massa.Quindi mettere un flaconcino di tampone di equilibrio e due flaconcini di tampone di lavaggio di pepsina nelle posizioni del reagente una, quattro e cinque delle camere di sinistra e una fiala del tampone di tempra per posizionare il reagente uno nella camera destra HDX e impostare la temperatura a 20 gradi Celsius utilizzando il regolatore di temperatura Peltier. Quindi aggiungere un numero uguale di flaconcini di recupero totale e di fiale di recupero massimo nelle stesse posizioni di reazione della camera sinistra HDX e della camera destra HDX rispettivamente. Quindi, impostare un elenco di esempio con i metodi LC e MS appropriati nel software di pianificazione e avviare la pianificazione.Per ottenere la mappa di copertura peptidica finale, curare manualmente le assegnazioni isotopiche nel software di analisi dei dati DynamX HDX. Dopo aver pulito lo strumento prototipo Fast HDX, aprire l'interfaccia utente grafica del software HDX compatibile per inizializzare il sistema. Immettere 20 gradi Celsius e 0,5 gradi Celsius rispettivamente come temperatura della camera del campione e della camera di tempra, quindi fare clic su Imposta per applicare le nuove temperature.Per pulire e preparare lo strumento, impostare i tubi della centrifuga con acqua di grado LC / MS in tutte le prese, quindi controllare le siringhe sinistra e destra nella scheda di mandata idraulica del titolatore e continuare a fare clic su primo fino a quando tutte le bolle d'aria latenti nei tubi sono scomparse. Per selezionare tutte le caselle per le siringhe, vai prima alla scheda macro e fai clic sulla posizione iniziale delle siringhe calibrate, quindi fai prima clic sul ciclo di carico della siringa di lavaggio, quindi lava tutti i volumi del ciclo di miscelazione. Se c'è una bolla in una siringa tampone, scollegare la siringa e degassandola espellendo verticalmente la bolla.Prima di ricalibrare in posizione zero, sostituire la siringa. Per configurare lo strumento prototipo Fast HDX per esperimenti HDX, inserire prima il tubo di ingresso di titolazione sinistro nel flaconcino di recupero totale. Per evitare l'oligomerizzazione e l'aggregazione indotte dalla temperatura, posizionare il tubo in un frigorifero da tavolo.Quindi, aggiungere 50 millilitri di tamponi di equilibrio, etichettatura, tempra e lavaggio della pepsina alle rispettive prese tampone nelle camere destra e sinistra dello strumento, quindi aggiungere 50 millilitri di tampone di lavaggio a colonna all'ingresso di lavaggio della pepsina. Per innescare le linee di lavaggio delle proteine e delle colonne, controllare le siringhe destra e sinistra nella scheda di consegna idraulica del titolatore e fare clic su prime una volta. Dopo aver selezionato tutte le caselle per le siringhe come dimostrato in precedenza, vai alla scheda del flusso di spegnimento manuale per inserire le impostazioni richieste.Per un esperimento di corso temporale, usa il pulsante punto simbolico per inserire i tempi in millisecondi. Quindi impostare il tempo di trappola su tre e l'attesa per HPLC per intrappolare il tempo più il tempo di esecuzione più 1,5 minuti. Se vengono eseguiti esperimenti vuoti tra le esecuzioni di esempio, fare clic sulla casella Esegui vuoto dopo aver verificato una voce nel software di acquisizione per l'esecuzione vuota dopo ogni esecuzione dell'esempio.Una volta che l'elenco di esempio è pronto e le voci appropriate sono state evidenziate, avviare l'esecuzione facendo clic su play e Fast HDX nel software. Per l'elaborazione dei dati, aprire il menu file del file di peptidi assegnati spettralmente dagli esperimenti di mappatura dei peptidi e fare clic su Apri nel software DynamX, quindi importare i file raw nel software DynamX. Dopo aver aperto il menu dei dati, fare clic su File MS.Per creare stati per ogni condizione proteica studiata, fare clic su Nuovo stato. Per aggiungere ogni punto temporale HDX, fare clic su Nuova esposizione, quindi fare clic su Nuovo raw. Per importare i file raw, trascinare ogni file nella posizione corretta e fare clic su OK al termine.Dopo aver assegnato automaticamente gli isotopi, curare manualmente l'assegnazione isotopica per garantire un'elevata qualità dei dati. Esportare i dati del cluster in file csv con l'ordine delle colonne come descritto nel manoscritto. Aprire il menu dei dati nel software di misurazione della massa e fare clic su Esporta dati cluster.Per l'analisi dei dati, caricare prima i dati del cluster esportati nel software di analisi HDX HDfleX. Per adattare i dati sperimentali a tutti gli esperimenti e gli stati, selezionare i metodi di correzione dello scambio posteriore appropriati per ottenere le costanti di velocità osservate per la reazione HDX. Quindi calcolare una soglia di significatività globale utilizzando un metodo preferito in HDfleX ed eseguire test di significatività ibridi per determinare le differenze significative tra gli stati confrontati.L'esperimento di mappatura sull'alfa-sinucleina ha generato una mappa di copertura peptidica che copriva il 100% della sequenza proteica con una ridondanza media di 3,79. Inoltre, questo protocollo ha permesso la generazione di curve di assorbimento del deuterio per diversi peptidi di alfa-sinucleina, che sono stati poi espressi come grafici corretti di scambio adattato e posteriore. Era evidente che la maggior parte dello scambio idrogeno/deuterio nell'alfa-sinucleina è stato fatto di un secondo.La differenza conformazionale tra gli stati A e B dell'alfa-sinucleina era evidente anche dal più alto assorbimento di deuterio da parte dello stato B sia a livello di peptidi che di amminoacidi. Per una tecnica così sensibile, è importante utilizzare solidi test di significatività statistica quando si confrontano i dati. Qui, abbiamo usato il nostro software HDfleX.

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