Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
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NS는 University Council Diamond Jubilee Scholarship의 지원을 받습니다. JJP는 UKRI Future Leaders Fellowship [Grant number : MR / T02223X / 1]의 지원을 받습니다.

1. aSyn의 단백질 발현 및 정제
<ol><li>이전에 게시된 보고서 다음에 aSyn을 준비합니다 9.</li>
	<li>안전한 저장 완충액(예를 들어, 트리스, pH 7.2)으로 투석한다.</li>
	<li>필요한 경우, 샘플을 농축한다 (예를 들어, 약 10-30분 동안 3 kDa MWCO, 14,000 x g 를 사용하는 스핀 필터 마이크로원심분리 튜브, 재료 표 참조). 참고 : 지나치게 집중하지 않는 것이 좋습...

본 기사에서, 다음의 절차가 기술된다: (1) 가장 높은 서열 커버리지를 얻기 위해 단량체성 aSyn에 대한 펩티드 매핑 실험을 수행하고, (2) 생리학적 조건 하에서 단량체성 aSyn에 대한 밀리초 HDX-MS 데이터를 획득하고, (3) 생성된 HDX-MS 데이터의 데이터 분석 및 해석을 수행한다. 제공된 절차는 일반적으로 실행이 간단하며, 각 라벨링 실험은 일반적으로 세 번의 반복실험과 8개의 시간 지점에 대해 약 8?...

파킨슨 병 (PD)은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 신경 퇴행성 질환입니다1. 그것은 뇌의 흑질파 콤팩타 영역에서 Lewy 바디 및 Lewy 뉴라이트로 알려진 세포질 내포물의 형성을 특징으로합니다. 이들 세포질 내포물은 본질적으로 무질서한 단백질 aSyn2의 응집체를 함유하는 것으로 밝혀졌다. PD 및 다른 synucleinopathies에서, aSyn은 가용성 무질서 상태에서 불용성, 고도로 구조화 된 병적 상태로 변형된다. 그것의 본래 형태에서, 단량체성 aSyn은 그것의 N- 및 C-테르미니 사이 장거리 정전기 상호 작용 및 그것의 C-말단 및 비-아밀로이드 베타 성분 (NAC) 영역 3,4,5,6 사이의 소수성 상호작용에 의해 안정화된 광범위한 입체 형태를 채택한다. 돌연변이, 번역 후 변형 및 국소 환경의 변화와 같은 이러한 안정화 상호 작용의 중단은 단량체의 오폴딩으로 이어질 수 있으며, 따라서 응집 과정을 촉발시킬 수 있습니다7.
aSyn 8,9,10,11의 올리고머 및 피브릴라 형태에 대한 방대한 양의 연구가 존재하지만, 단백질의 단량체 형태를 연구하고 어떤 순응자가 기능적인지 (그리고 어떻게) 그리고 어떤 것이 응집되기 쉬운지를 더 잘 이해할 필요가 있습니다8,9,10,11 . 본질적으로 무질서하고, 크기가 14 kDa에 불과하고, 결정화하기 어려우며, aSyn 단량체는 대부분의 구조적 생물학적 기술에 복종할 수 없다. 그러나 단량체 aSyn의 형태 역학을 측정 할 수있는 한 가지 기술은 밀리 초 HDX-MS이며, 이는 최근에12,13,14를 얻는 것이 어렵거나 불가능한 중요한 구조적 관찰을 생성했습니다. 밀리초 HDX-MS는 아미드 수소에서 동위원소 교환을 모니터링하여 단백질 입체 앙상블의 평균을 민감하게 측정하여 밀리초 시간 척도에서 특정 단백질 영역의 용매 접근성 및 수소 결합 네트워크 참여를 나타냅니다. HDX-MS의 밀리 초 측면을 강조 할 필요가 있는데, 이는 기본적으로 펼쳐진 메타 안정 특성으로 인해 aSyn은 기존 HDX-MS 시스템의 하한보다 훨씬 낮은 매우 빠른 수소 교환 동역학을 나타내기 때문입니다. 예를 들어, 대부분의 aSyn 분자는 1 s 미만의 세포 내 조건 하에서 중수소와 완전히 수소를 교환했습니다. 몇몇 실험실은 이제 빠른 혼합 계측기를 구축했습니다. 이 경우 50ms의 데드 타임과 1ms의 시간 분해능으로 HDX-MS를 수행 할 수있는 프로토 타입 고속 혼합 담금질 흐름 기기가15 사용됩니다. 밀리 초 HDX-MS는 최근 aSyn의 연구에서 매우 중요하지만, 본질적으로 무질서한 단백질 / 영역을보다 광범위하게 연구하고 약하게 안정적인 루프 / 영역을 가진 많은 수의 단백질을 연구하는 데 가치가 있습니다. 예를 들어, 펩티드 약물 (예를 들어, 인슐린; GLP-1/글루카곤; tirzepatide) 및 펩티드-융합 단백질 (예를 들어, HIV 억제제 FN3-L35-T1144)은 용액-상 구조 및 안정성 정보가 약물 개발 결정에 중요한 입력이 될 수 있는 주요 약물 포맷이지만, 펩티드 모이어티는 종종 초적 시간 척도16,17,18,19,20에서 HDX-MS에 의해 약하게 안정하고 난치성일 뿐이다. . 초/분 도메인에서 표지를 갖는 창발적 HDX-MS 방법은 DNA G-사분면체에 대한 구조적 정보를 도출하는 것으로 나타났지만, 밀리초 HDX-MS21의 적용에 의해 이를 보다 다양한 올리고뉴클레오티드 구조로 확장할 수 있어야 한다.
HDX-MS 실험은 세 가지 상이한 수준에서 수행될 수 있다: (1) 상향식 (이에 의해 표지된 단백질은 단백질분해적으로 소화됨), (2) 중간-다운 (이에 의해 표지된 단백질은 단백질분해적으로 소화되고, 생성된 펩티드는 연질-단편화 기술에 의해 추가로 단편화됨), 및 (3) 하향식 (이에 의해 소프트-단편화 기술이 표지된 단백질을 직접 단편화함)22 . 따라서, 하위분자 HDX-MS 데이터는 우리가 단백질의 특정 영역에 대한 교환 거동을 국부화할 수 있게 해주므로, 그러한 실험에 대해 적절한 서열 커버리지를 갖는 것이 매우 중요하다. 임의의 HDX-MS 실험의 구조적 분해능은 소화 또는 연질 단편화시 단백질로부터 유래된 단백질 분해 펩티드 또는 단편의 수에 각각 의존한다. 위에서 설명한 세 가지 실험 유형 각각에서, 각 펩티드/단편에서의 아미드 교환의 변화는 단백질의 국부적인 영역의 거동을 나타내기 위해 단백질의 일차 구조에 다시 매핑된다. 가장 높은 구조적 분해능은 소프트 단편화를 통해 달성되지만, 이러한 실험에 대한 설명은 aSyn 단량체 입체 형태의 측정에 초점을 맞춘 현재 연구의 범위를 벗어납니다. 여기에 설명된 일반적으로 적용되는 "상향식" 워크플로를 통해 우수한 결과를 얻을 수 있습니다.
여기서, 절차는 (1) aSyn 샘플 및 HDX-MS 버퍼를 준비하고 처리하는 방법, (2) 상향식 HDX-MS 실험을 위한 펩티드 매핑을 수행하는 방법, (3) 생리학적 조건, 특히 밀리초 시간 영역에서 단량체성 aSyn에 대한 HDX-MS 데이터를 획득하는 방법(맞춤형 장비 사용; 밀리초 라벨링을 위한 대체 기기도 설명됨)에 대해 제공된다. (4) HDX-MS 데이터를 처리하고 분석하는 방법. 두 용액 조건에서 생리학적 pH (7.40)에서 단량체성 aSyn을 사용하는 방법이 여기에 예시된다. aSyn의 연구에 매우 유용하지만, 이러한 절차는 모든 단백질에 적용될 수 있으며 본질적으로 무질서한 단백질에만 국한되지 않습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

알파 시누클레인 (aSyn)은 파킨슨 병의 특징 인 Lewy 몸과 신경 고리에 피브릴라 응집체가 풍부한 본질적으로 무질서한 단백질입니다. 그러나, 그의 생물학적 활성의 대부분은, 그것의 응집뿐만 아니라, 중앙적으로는 단백질의 가용성 단량체 형태를 포함한다. aSyn 생물학 및 병태생리학의 분자 메커니즘에 대한 해명은 구조적으로 고도로 분해된 방법을 필요로 하며 생물학적 조건에 민감하다. 그것의 본래 펼쳐진, 메타 안정한 구조는 단량체 aSyn을 많은 구조 생물학 기술에 다루기 어렵게 만든다. 여기에서는 이러한 접근법 중 하나의 적용이 설명됩니다 : aSyn과 같은 열역학적 안정성이 낮고 보호 인자가 약한 단백질을 연구하기 위해 밀리 초 시간 척도의 수소 / 중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS)이 설명됩니다. 밀리초 시간 척도에서 HDX-MS 데이터에는 aSyn의 용매 접근성 및 수소 결합 구조에 대한 정보가 포함되어 있으며, 이는 더 긴 라벨링 시간에 손실되어 궁극적으로 아미노산 수준까지 구조적 분해능을 산출합니다. 따라서 HDX-MS는 형태 역학 및 열역학, 분자 내 및 분자 간 상호 작용, 돌연변이 또는 환경 조건에 대한 변경의 구조적 영향에 대한 높은 구조적 및 시간적 해상도로 정보를 제공 할 수 있습니다. 광범위하게 적용가능하지만, 단량체 aSyn에서 밀리초 HDX-MS 측정을 획득, 분석 및 해석하는 방법이 입증된다.

본질적으로 무질서한 특성으로 인해 생리적 pH에서 aSyn의 복잡한 구조적 변화를 포착하는 것은 어렵습니다. HDX-MS는 백본 아미드 수소에서 동위원소 교환을 모니터링하여 단백질 형태 역학 및 상호 작용을 조사합니다. 높은 구조적 및 시간적 해상도에서이 정보를 얻는 몇 안되는 기술 중 하나입니다. 이 프로토콜은 광범위한 단백질 및 완충액 조건에 광범위하게 적용가능하며, 이는 단계 2.1.-2.2에 ?...

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Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.

생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

모든 유기체는 프로테옴에 장애가 있으며, 최대 33 %까지 추정됩니다.이 영역은 수소 / 중수소 교환 질량 분광법에 의해 관찰 가능하지만 밀리 초 시간 범위에서만 관찰 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은이 작업을 성공적으로 수행하는 방법을 보여줍니다. 이것은 완전히 자동화 된 분석 기술입니다.모든 것을 설정하고, 원하는 시간 측정을 프로그래밍하고, 가서 떠나십시오. 이 기술은 알파 시누클레인과 같은 본질적으로 무질서한 단백질의 특정 확인을 안정화시키는 화합물을 스크리닝하는 흥미로운 기회를 열어줍니다. 펩티드 매핑을 위한 샘플 준비를 시작하려면, 먼저 영하 80도 냉동고에서 저장된 알파-시누클레인 단백질 스톡의 바이알을 취한다.그리고 일단 해동되면, 0.22 마이크로미터 시린지 필터를 사용하여 여과한다. 그런 다음 Beer-Lambert의 법칙을 사용하여 단백질 농도를 결정하기 위해 218 나노 미터에서 용액의 흡광도를 측정하고 평형 버퍼로 단백질을 다섯 마이크로 몰의 최종 농도로 희석하십시오. 다음으로, 자동 시료 주입기 로봇을 설정하려면 5 마이크로 몰 단백질 용액 50 마이크로 리터를 총 회수 바이알에 추가하고 질량 분광계에 따라 수소 / 중수소 교환 또는 HDX 로봇 공학의 오른쪽 챔버의 샘플 위치에 바이알을 놓습니다.그런 다음 평형 버퍼 한 바이알과 펩신 세척 버퍼 두 바이알을 시약 위치에 넣고 좌측 챔버의 하나, 네 개, 다섯 개와 담금질 버퍼의 바이알 하나를 HDX 우측 챔버 내에 시약 위치에 놓고 펠티에 온도 조절기를 사용하여 섭씨 20도로 온도를 설정한다. 그런 다음 동일한 수의 총 회수 바이알 및 최대 회수 바이알을 각각 HDX 좌측 챔버 및 HDX 우측 챔버의 동일한 반응 위치에 첨가한다. 다음으로, 스케줄링 소프트웨어에서 적절한 LC 및 MS 방법을 사용하여 샘플 리스트를 설정하고 스케줄을 시작한다.최종 펩티드 커버리지 맵을 얻으려면 DynamX HDX 데이터 분석 소프트웨어에서 동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하십시오. 고속 HDX 프로토타입 장비를 청소한 후 호환되는 HDX 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스를 열어 시스템을 초기화합니다. 샘플 챔버 및 담금질 챔버 온도로 각각 섭씨 20도, 섭씨 0.5도를 입력한 다음 세트를 클릭하여 새 온도를 적용합니다.장비를 청소하고 준비하려면 모든 입구에 LC/MS 등급의 물로 원심분리 튜브를 설치한 다음 적정기 배관 전달 탭에서 왼쪽 및 오른쪽 주사기를 모두 확인하고 튜브의 모든 잠복 기포가 사라질 때까지 프라임을 계속 클릭합니다. 주사기의 모든 상자를 확인하려면 먼저 매크로 탭으로 이동하여 주사기 홈 위치 보정을 클릭 한 다음 먼저 주사기 로드 루프 세척을 클릭 한 다음 모든 혼합 루프 볼륨을 씻으십시오. 버퍼 주사기에 거품이 있으면 주사기를 분리하고 수직으로 거품을 배출하여 가스를 제거합니다.제로 위치로 재보정하기 전에 주사기를 교체하십시오. HDX 실험을 위한 Fast HDX 프로토타입 장비를 설정하려면 먼저 왼쪽 적정 유입 튜브를 전체 회수 바이알에 삽입하십시오. 온도로 인한 올리고머화 및 응집을 방지하려면 튜브를 탁상 냉장고에 보관하십시오.다음으로, 50 밀리리터의 평형, 라벨링, 담금질 및 펩신 세척 버퍼를 기기의 오른쪽 및 왼쪽 챔버의 각 버퍼 입구에 첨가 한 다음 50 밀리리터의 컬럼 세척 버퍼를 펩신 세척 입구에 첨가하십시오. 단백질 및 컬럼 세척 라인을 프라이밍하려면 적정기 배관 전달 탭에서 오른쪽 및 왼쪽 주사기를 확인하고 프라임을 한 번 클릭합니다. 앞에서 설명한 대로 주사기의 모든 상자를 확인한 후 수동 담금질 흐름 탭으로 이동하여 필요한 설정을 입력합니다.시간 코스 실험의 경우 기호 점 단추를 사용하여 시간을 밀리초 단위로 입력합니다. 그런 다음 트랩 시간을 3으로 설정하고 HPLC가 트랩 시간과 실행 시간을 더한 1.5 분을 기다립니다. 샘플 실행 사이에 빈 실험이 실행되는 경우 각 샘플 실행 후 빈 실행에 대한 획득 소프트웨어에 항목을 확인한 후 빈 실행 상자를 클릭합니다.샘플 목록이 준비되고 적절한 항목이 강조 표시되면 소프트웨어에서 재생 및 빠른 HDX를 클릭하여 실행을 시작합니다. 데이터 처리를 위해 펩티드 매핑 실험에서 스펙트럼으로 할당된 펩티드 파일의 파일 메뉴를 열고 DynamX 소프트웨어에서 열기를 클릭한 다음 원시 파일을 DynamX 소프트웨어로 가져옵니다. 데이터 메뉴를 연 후 MS 파일을 클릭하십시오.연구되는 각 단백질 조건에 대한 상태를 만들려면 새 상태를 클릭하십시오. 각 HDX 시점을 추가하려면 새 노출을 클릭한 다음 새 원시를 클릭합니다. 원시 파일을 가져오려면 각 파일을 올바른 위치로 드래그하고 완료되면 확인을 클릭합니다.동위원소를 자동으로 할당한 후 동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하여 높은 데이터 품질을 보장합니다. 원고에 설명된 대로 열 순서를 사용하여 csv 파일에서 클러스터 데이터를 내보냅니다. 질량 측정 소프트웨어에서 데이터 메뉴를 열고 클러스터 데이터 내보내기를 클릭하십시오.데이터 분석을 위해 먼저 내보낸 클러스터된 데이터를 HDX 분석 소프트웨어 HDfleX에 로드합니다. 모든 실험 및 상태에 대한 실험 데이터를 적합하게하려면 적절한 역 교환 보정 방법을 선택하여 HDX 반응에 대해 관찰 된 속도 상수를 얻으십시오. 그런 다음 HDfleX에서 선호되는 방법을 사용하여 전역 유의 임계값을 계산하고 하이브리드 유의 테스트를 수행하여 비교된 상태 간의 유의한 차이를 확인합니다.알파-시누클레인에 대한 매핑 실험은 3.79의 평균 중복성으로 단백질 서열의 100%를 커버하는 펩티드 커버리지 맵을 생성하였다. 더욱이, 이 프로토콜은 알파-시누클레인의 상이한 펩티드에 대한 중수소 흡수 곡선의 생성을 가능하게 하였고, 이는 그 후 적합 및 역교환 보정된 그래프로 표현되었다. 알파 시누클레인의 대부분의 수소 / 중수소 교환이 일초에 의해 이루어졌다는 것이 분명했습니다.알파-시누클레인의 상태 A와 B 사이의 형태적 차이는 또한 펩티드 및 아미노산 수준 둘 다에서 상태 B에 의한 더 높은 중수소 흡수로부터 명백하였다. 이러한 민감한 기술의 경우 데이터를 비교할 때 강력한 통계적 유의성 검정을 사용하는 것이 중요합니다. 여기에서는 소프트웨어 HDfleX를 사용했습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 Gavage 및 이미지 분석을 사용하여 Rotenone의 구강 관리

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

연구

신경과학

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Miniosmotic의 주입 펌프 및 요로의 트레이서의 배달 병태 생리 학적 조건에서 뇌 조직 개편을 연구에

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

MALDI 이미징 질량 분석에 대한 쥐 뇌 조직에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 DAN 매트릭스의 승화

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus 포유류 신경 근육 학 전송 전압 클램프 조건에서의 시험을 위한 준비

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...