Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

NS er finansiert av Universitetsrådets diamantjubileumsstipend. JJP støttes av et UKRI Future Leaders Fellowship [Grant number: MR/T02223X/1].

1. Proteinuttrykk og rensing av aSyn
<ol><li>Forbered aSyn etter en tidligere publisert rapport9.</li>
	<li>Dialysere til en sikker lagringsbuffer (f.eks. Tris, pH 7.2 ).</li>
	<li>Om nødvendig, konsentrer prøven (f.eks. mikrosentrifugerør med spinnfilter ved bruk av 3 kDa MWCO, 14 000 x g i ca. 10-30 minutter, se Materialtabell). MERK: Det anbefales ikke å konsentrere seg for mye. Monomerensemblets integritet er ikke verifisert utover 25 μM.</l...

I denne artikkelen beskrives følgende prosedyrer: (1) utføre peptidkartleggingseksperimenter på monomere aSyn for å oppnå den høyeste sekvensdekningen, (2) anskaffe millisekund HDX-MS-data på monomere aSyn under fysiologiske forhold, og (3) utføre dataanalyse og tolkning av de resulterende HDX-MS-dataene. De angitte prosedyrene er generelt enkle å utføre, hvert merkingseksperiment varer vanligvis bare rundt 8 timer i tre replikasjoner og åtte tidspunkter, og kartleggingseksperimentet varer bare rundt 2 timer. ...

Parkinsons sykdom (PD) er en nevrodegenerativ sykdom som påvirker millioner av mennesker over hele verden1. Det er preget av dannelsen av cytoplasmatiske inneslutninger kjent som Lewy-legemer og Lewy-neuritter i hjernens substantia nigra pars compacta-region. Disse cytoplasmatiske inneslutningene har vist seg å inneholde aggregater av det indre uordnede proteinet aSyn2. I PD og andre synukleinopatier transformerer aSyn fra en løselig uordnet tilstand til en uoppløselig, svært strukturert syk tilstand. I sin opprinnelige form vedtar monomere aSyn et bredt spekter av konformasjoner stabilisert av langdistanse elektrostatiske interaksjoner mellom N- og C-termini og hydrofobe interaksjoner mellom C-terminalen og ikke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuelle forstyrrelser i de stabiliserende interaksjonene, for eksempel mutasjoner, posttranslasjonelle modifikasjoner og endringer i det lokale miljøet, kan føre til feilfolding av monomeren, og dermed utløse prosessen med aggregering7.
Mens det finnes en enorm mengde forskning på oligomere og fibrillære former av aSyn 8,9,10,11, er det et avgjørende behov for å studere proteinets monomere form og bedre forstå hvilke konformatorer som er funksjonelle (og hvordan) og hvilke som er tilbøyelige til å samle 8,9,10,11 . Å være iboende uordnet, bare 14 kDa i størrelse og vanskelig å krystallisere, er aSyn-monomeren ikke mottagelig for de fleste strukturelle biologiske teknikker. Imidlertid er en teknikk som er i stand til å måle konformasjonsdynamikken til monomer aSyn millisekund HDX-MS, som nylig har generert viktige strukturelle observasjoner som ville være utfordrende eller umulig å oppnå ellers 12,13,14. Millisekund HDX-MS måler følsomt gjennomsnittet av proteinkonformasjonsensemblet ved å overvåke isotoputvekslingen ved amidhydrogensere, noe som indikerer løsemiddeltilgjengelighet og hydrogenbindingsnettverksdeltakelse av et bestemt proteinområde på millisekundets tidsskala. Det er nødvendig å understreke millisekundaspektet av HDX-MS, da aSyn på grunn av sin opprinnelig utfoldede, metastabile natur utviser veldig rask hydrogenutvekslingskinetikk som manifesterer seg godt under den nedre grensen for konvensjonelle HDX-MS-systemer. For eksempel har det meste av aSyn-molekylet fullstendig utvekslet hydrogen for deuterium under intracellulære forhold på mindre enn 1 s. Flere laboratorier har nå bygget hurtigblande instrumentering; i dette tilfellet brukes et prototype raskt blandende slukkeflytinstrument som er i stand til å utføre HDX-MS med en dødtid på 50 ms og en tidsmessig oppløsning på 1 ms15. Mens millisekund HDX-MS nylig har vært akutt viktig i studiet av aSyn, står det å være verdifullt for å studere iboende uordnede proteiner / regioner i større grad og et stort antall proteiner med løkker / regioner som bare er svakt stabile. For eksempel, peptidmedikamenter (f.eks. insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) og peptidfusjonsproteiner (f.eks. HIV-hemmeren FN3-L35-T1144) er viktige legemiddelformater der struktur- og stabilitetsinformasjon i løsningsfasen kan være en kritisk inngang for beslutninger om legemiddelutvikling, og likevel er peptiddelen ofte bare svakt stabil og ugjennomtrengelig av HDX-MS på sekundene tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS metoder med merking i sekunder / minutter domener har vist seg å utlede strukturell informasjon for DNA G-quadruplexes, men det bør være mulig å utvide dette til mer variert oligonukleotid strukturer ved anvendelse av millisekund HDX-MS21.
HDX-MS-eksperimenter kan utføres på tre forskjellige nivåer: (1) bottom-up (hvor det merkede proteinet fordøyes proteolytisk), (2) middle-down (hvorved det merkede proteinet fordøyes proteolytisk, og de resulterende peptidene fragmenteres ytterligere ved myke fragmenteringsteknikker), og (3) top-down (hvorved myke fragmenteringsteknikker direkte fragmenterer det merkede proteinet)22 . Dermed tillater submolekylære HDX-MS-data oss å lokalisere utvekslingsadferden til bestemte regioner av et protein, noe som gjør det kritisk å ha tilstrekkelig sekvensdekning for slike eksperimenter. Den strukturelle oppløsningen til ethvert HDX-MS-eksperiment er avhengig av antall proteolytiske peptider eller fragmenter avledet fra proteinet ved fordøyelse eller myk fragmentering, henholdsvis. I hver av de tre eksperimenttypene som er skissert ovenfor, kartlegges endringen i amidutveksling ved hvert peptid / fragment tilbake på proteinets primære struktur for å indikere oppførselen til lokaliserte regioner av proteinet. Mens den høyeste strukturelle oppløsningen oppnås gjennom myk fragmentering, er beskrivelsen av disse eksperimentene utenfor omfanget av den nåværende studien, som fokuserer på måling av aSyn-monomerkonformasjoner. Utmerkede resultater kan oppnås med den ofte brukte "bottom-up" arbeidsflyten som er beskrevet her.
Her er det gitt prosedyrer for (1) hvordan man preparerer og håndterer aSyn-prøver og HDX-MS-buffere, (2) hvordan man utfører peptidkartlegging for et bottom-up HDX-MS-eksperiment, (3) hvordan man skaffer HDX-MS-data om monomere aSyn under fysiologiske forhold, spesielt i millisekund-tidsdomenet (ved hjelp av et spesialbygd instrument; alternative instrumenter for millisekundmerking er også beskrevet), og (4) hvordan du behandler og analyserer HDX-MS-dataene. Metoder som bruker monomer aSyn ved fysiologisk pH (7,40) i to løsningsforhold er eksemplifisert her. Selv om det er kritisk nyttig i studiet av aSyn, kan disse prosedyrene brukes på ethvert protein og er ikke begrenset til egentlig uordnede proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

Alfa-synuclein (aSyn) er et indre uordnet protein hvis fibrillære aggregater er rikelig i Lewy-legemer og nevritter, som er kjennetegnene til Parkinsons sykdom. Likevel involverer mye av sin biologiske aktivitet, så vel som aggregering, sentralt den løselige monomerformen av proteinet. Belysning av de molekylære mekanismene i aSyn biologi og patofysiologi krever strukturelt svært oppløste metoder og er følsom for biologiske forhold. Dens naturlig utfoldede, metastabile strukturer gjør monomer aSyn ugjennomtrengelig for mange strukturbiologiske teknikker. Her beskrives anvendelsen av en slik tilnærming: hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri (HDX-MS) på millisekund tidsskalaen for studier av proteiner med lav termodynamisk stabilitet og svake beskyttelsesfaktorer, for eksempel aSyn. På millisekundets tidsskala inneholder HDX-MS-data informasjon om løsningsmiddeltilgjengeligheten og hydrogenbundet struktur av aSyn, som går tapt ved lengre merkingstider, noe som til slutt gir strukturell oppløsning opp til aminosyrenivået. Derfor kan HDX-MS gi informasjon ved høye strukturelle og tidsmessige oppløsninger om konformasjonsdynamikk og termodynamikk, intra- og intermolekylære interaksjoner, og den strukturelle virkningen av mutasjoner eller endringer i miljøforhold. Selv om det er bredt anvendelig, demonstreres det hvordan man anskaffer, analyserer og tolker millisekund HDX-MS-målinger i monomere aSyn.

På grunn av sin iboende uordnede natur er det vanskelig å fange opp de intrikate strukturelle endringene i aSyn ved fysiologisk pH. HDX-MS overvåker isotopisk utveksling ved ryggradsamidhydrogener, og undersøker proteinkonformasjonsdynamikken og interaksjonene. Det er en av de få teknikkene for å skaffe seg denne informasjonen ved høye strukturelle og tidsmessige oppløsninger. Denne protokollen er bredt anvendelig på et bredt spekter av proteiner og bufferbetingelser, og dette eksemplifiseres ved måling av utve...

Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Det strukturelle ensemblet av monomer alfa-synuclein påvirker dets fysiologiske funksjon og fysisk-kjemiske egenskaper. Denne protokollen beskriver hvordan man utfører millisekund hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri og påfølgende dataanalyser for å bestemme konformasjonsinformasjon om monomeren til dette iboende uordnede proteinet under fysiologiske forhold.

Millisekund hydrogen / deuterium-utveksling massespektrometri for studiet av alfa-synuclein strukturell dynamikk under fysiologiske forhold

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Alle organismer har uorden i deres proteom, estimert opptil 33%Disse regionene kan observeres ved hydrogen / deuteriumutveksling massespektrometri, men bare i millisekundets tidsintervall. Vår protokoll vil vise deg hvordan du gjør dette vellykket. Dette er en helautomatisk analytisk teknikk.Du bare setter opp alt, programmerer de ønskede tidsmålingene, trykker på gå og gå bort. Denne teknikken åpner for den spennende muligheten til screening for forbindelser som stabiliserer spesifikke bekreftelser av intrinsically disordered proteiner som alfa-synuclein. For å begynne prøvepreparering for peptidkartlegging, ta først et hetteglass med lagret alfa-synucleinproteinlager fra fryseren på minus 80 grader Celsius.Og når den er tint, filtrer med et 0,22 mikrometer sprøytefilter. Mål deretter absorbansen av løsningen ved 218 nanometer for å bestemme proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Beer-Lamberts lov, og fortynn proteinet med likevektsbuffer til en endelig konsentrasjon på fem mikromolar. Deretter, for å sette opp autosamplerroboten, legg til 50 mikroliter av de fem mikromolar proteinoppløsningene til et hetteglass med total utvinning, og plasser hetteglasset i prøveposisjonen i høyre kammer av hydrogen / deuteriumutvekslingen, eller HDX, robotikk i tråd med massespektrometeret.Sett deretter ett hetteglass med likevektsbuffer og to hetteglass med pepsinvaskbuffer for å reagensere posisjonene ett, fire og fem av de venstre kamrene og ett hetteglass med slukkebuffer for å reagensposisjonere ett i HDX høyre kammer og stille temperaturen til 20 grader Celsius ved hjelp av Peltier temperaturregulator. Deretter tilsettes et likt antall hetteglass med total restitusjon og hetteglass med maksimal restitusjon i de samme reaksjonsposisjonene til henholdsvis HDX venstre kammer og HDX høyre kammer. Deretter setter du opp en eksempelliste med passende LC- og MS-metoder i planleggingsprogramvaren og starter tidsplanen.For å få det endelige peptiddekningskartet, kurater manuelt isotopoppgavene i DynamX HDX dataanalyseprogramvare. Etter rengjøring av Fast HDX-prototypeinstrumentet, åpner du det grafiske brukergrensesnittet til den kompatible HDX-programvaren for å initialisere systemet. Skriv inn 20 grader Celsius og 0,5 grader Celsius som henholdsvis prøvekammeret og slukkekammertemperaturene, etterfulgt av å klikke på sett for å bruke de nye temperaturene.For å rengjøre og klargjøre instrumentet, sett opp sentrifugerørene med vann av LC/MS-grad ved alle innløp, kontroller deretter både venstre og høyre sprøyte i titratorens rørleggerfunksjonsfane og fortsett å klikke prime til alle latente luftbobler i rørene er borte. For å sjekke alle boksene for sprøyter, gå først til makrofanen og klikk på kalibrer sprøyter hjemmeposisjon, klikk deretter først vaske sprøytebelastningssløyfe, etterfulgt av vask alle blandesløyfevolumer. Hvis det er en boble i en buffersprøyte, kobler du fra sprøyten og avfetter den ved å kaste ut boblen vertikalt.Før sprøyten kalibreres på nytt til nullstilling, må du bytte ut sprøyten. For å sette opp Fast HDX-prototypeinstrumentet for HDX-eksperimenter, må du først sette inn det venstre titreringsinnløpsrøret i hetteglasset med total restitusjon. For å forhindre temperaturindusert oligomerisering og aggregering, plasser røret i et kjøleskap på bordplaten.Deretter legger du til 50 ml likevekt, merking, slukking og pepsinvaskbuffere til de respektive bufferinntakene i instrumentets høyre og venstre kamre, etterfulgt av å legge til 50 milliliter kolonnevaskbuffer til pepsinvaskeinnløpet. For klargjøring av protein- og kolonnevaskelinjene, sjekk høyre og venstre sprøyte i titratorens rørleggerfunksjonsfane og klikk prime en gang. Etter å ha sjekket alle boksene for sprøyter som vist tidligere, gå til den manuelle slukkeflytfanen for å angi de nødvendige innstillingene.For et tidskurseksperiment, bruk den symbolske prikkknappen for å angi tidene i millisekunder. Sett deretter felletiden til tre og vent på at HPLC skal felle tid pluss kjøretid pluss 1.5 minutter. Hvis det kjøres tomme eksperimenter mellom eksempelkjøringer, klikker du på den tomme Kjør-boksen etter at du har sikret en oppføring i anskaffelsesprogramvaren for den tomme kjøringen etter hver prøvekjøring.Når eksempellisten er klar og de riktige oppføringene er uthevet, starter du kjøringen ved å klikke på spill og Rask HDX i programvaren. For databehandling åpner du filmenyen til filen med spektralt tildelte peptider fra peptidkartleggingseksperimentene og klikker på åpne i DynamX-programvaren, og deretter importerer du råfilene til DynamX-programvaren. Etter å ha åpnet datamenyen, klikk på MS-filer.For å lage tilstander for hver proteintilstand som studeres, klikk på ny tilstand. For å legge til hvert HDX-tidspunkt, klikk på ny eksponering, og klikk deretter på ny rå. Hvis du vil importere RAW-filer, drar du hver fil til riktig posisjon og klikker OK når du er ferdig.Etter automatisk tildeling av isotoper, kuraterer du isotopoppgaven manuelt for å sikre høy datakvalitet. Eksporter klyngedataene i csv-filen med kolonnerekkefølgen som beskrevet i manuskriptet. Åpne datamenyen i programvaren for massemåling og klikk på eksporter klyngedata.For dataanalyse må du først laste inn de eksporterte klyngedataene i HDX-analyseprogramvaren HDfleX. For å passe til eksperimentelle data for alle eksperimenter og tilstander, velg passende ryggutvekslingskorreksjonsmetoder for å få de observerte hastighetskonstantene for HDX-reaksjonen. Beregn deretter en global signifikansterskel ved hjelp av en foretrukket metode i HDfleX og utfør hybrid signifikanstesting for å bestemme de signifikante forskjellene mellom statene sammenlignet.Kartleggingseksperimentet på alfa-synuclein genererte et peptiddekningskart som dekket 100% av proteinsekvensen med en gjennomsnittlig redundans på 3,79. Videre muliggjorde denne protokollen generering av deuteriumopptakskurver for forskjellige peptider av alfa-synuclein, som deretter ble uttrykt som monterte og tilbake utvekslingskorrigerte grafer. Det var tydelig at det meste av hydrogen / deuteriumutveksling i alfa-synuclein ble gjort med ett sekund.Konformasjonsforskjellen mellom tilstand A og B av alfa-synuclein var også tydelig fra det høyere deuteriumopptaket ved tilstand B både ved peptid- og aminosyrenivå. For en slik sensitiv teknikk er det viktig å bruke robuste statistiske signifikanstester når man sammenligner data. Her brukte vi programvaren vår HDfleX.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Implantasjon av Miniosmotic Pumper og Levering av Tract Tracers å studere Brain Omorganisering i Patofysiologiske betingelser

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sekvensiell Utvinning av løselig og uløselig Alpha-synuclein fra Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Dyptgående Fysiologisk Analyse av Definerte cellepopulasjoner i Akutt vevssnitt av musen Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Overvåking astrocytter reaktivitet og spredning in Vitro Under iskemiske-lignende forhold

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimering av DAN Matrix for søking og visualisering av gangliosider i Rat hjernevev for MALDI Imaging massespektrometri

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminesens Imaging av nevroinflammasjon i transgene mus etter Peripheral Inokulering av Alfa synukleinfibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsavhengig økning i nettverksresponsen til stimulering av neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Forberedelse for undersøkelse av pattedyr nevromuskulær overføring Under spenning klemme forhold

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...