Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
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A NS é financiada pela Bolsa de Estudos do Jubileu de Diamante do Conselho Universitário. A JJP é apoiada por uma Ukri Future Leaders Fellowship [Número de subvenção: MR/T02223X/1].

1. Expressão proteica e purificação de aSyn
<ol><li>Prepare aSyn após um relatório publicado anteriormente9.</li>
	<li>Dialisar em um buffer de armazenamento seguro (por exemplo, Tris, pH 7.2 ).</li>
	<li>Se necessário, concentre a amostra (por exemplo, tubos de microcentrifuuge do filtro de spin usando 3 kDa MWCO, 14.000 x g por aproximadamente 10-30 min, ver Tabela de Materiais). NOTA: É aconselhável não se concentrar excessivamente. A int...

No presente artigo, são descritos os seguintes procedimentos: (1) a realização de experimentos de mapeamento de peptídeos em aSyn monomérica para obter a maior cobertura de sequência, (2) aquisição de dados milissegundos HDX-MS sobre a aSyn monomérica em condições fisiológicas e (3) a realização da análise e interpretação dos dados de HDX-MS resultantes. Os procedimentos fornecidos são geralmente simples de executar, cada experimento de rotulagem normalmente dura apenas cerca de 8h para três réplicas ...

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa que afeta milhões de pessoas em todo o mundo1. Caracteriza-se pela formação de inclusões citoplasmáticas conhecidas como corpos de Lewy e neurites de Lewy na região substantia nigra pars compacta do cérebro. Essas inclusões citoplasmáticas têm sido encontradas para conter agregados da proteína intrinsecamente desordenada aSyn2. Em DP e outras sinucleinopatias, aSyn se transforma de um estado solúvel desordenado em um estado doente insolúvel e altamente estruturado. Em sua forma nativa, o monoméico aSyn adota uma ampla gama de conformações estabilizadas por interações eletrostáticas de longo alcance entre suas interações N e C-termini e hidrofóbicas entre sua região de componente beta C-terminus e não amiloide (NAC) 3,4,5,6. Quaisquer interrupções nessas interações estabilizadoras, como mutações, modificações pós-translacionais e mudanças no ambiente local, podem levar ao descompos do monômero, desencadeando assim o processo de agregação7.
Embora exista uma vasta quantidade de pesquisa sobre as formas oligomeméricas e fibrilares de aSyn 8,9,10,11, há uma necessidade crucial de estudar a forma monomérica da proteína e entender melhor quais conformadores são funcionais (e como) e que são propensos a agregar 8,9,10,11 . Sendo intrinsecamente desordenado, apenas 14 kDa de tamanho, e difícil de cristalizar, o monômero aSyn não é favorável à maioria das técnicas biológicas estruturais. No entanto, uma técnica capaz de medir a dinâmica conformacional do aSyn monomérico é o milissegundo HDX-MS, que recentemente gerou observações estruturais importantes que seriam desafiadoras ou impossíveis de obter de outra forma 12,13,14. Milissegundos HDX-MS mede sensivelmente a média do conjunto conformacional da proteína monitorando a troca isotópica em hidrogênios amidos, indicando acessibilidade solvente e participação de rede de ligação de hidrogênio de uma determinada região proteica na escala de tempo de milissegundos. É necessário enfatizar o aspecto milissegundo do HDX-MS, pois, devido à sua natureza nativamente desdobrada e meta-estável, aSyn exibe cinética de troca de hidrogênio muito rápida que se manifestam bem abaixo do limite inferior dos sistemas HDX-MS convencionais. Por exemplo, a maioria da molécula de ASyn tem completamente trocado hidrogênio por deutério sob condições intracelulares em menos de 1 s. Vários laboratórios já construíram uma instrumentação de mistura rápida; neste caso, um protótipo de instrumento de fluxo de sada rápida capaz de executar HDX-MS com um tempo morto de 50 ms e uma resolução temporal de 1 ms é usado15. Embora o MILISSEGUD HDX-MS tenha sido recentemente extremamente importante no estudo da ASyn, é valioso estudar proteínas/regiões intrinsecamente desordenadas de forma mais ampla e um grande número de proteínas com laços/regiões que são apenas fracamente estáveis. Por exemplo, drogas de peptídeos (por exemplo, insulina; GLP-1/glucagon; proteínas de fusão de tirzepatidas) e peptídeos (por exemplo, o inibidor do HIV FN3-L35-T1144) são os principais formatos de drogas onde informações estruturais e de estabilidade em fase de solução podem ser uma entrada crítica para decisões de desenvolvimento de medicamentos, e, ainda assim, a moiety peptídeo é muitas vezes apenas fracamente estável e intratável pelo HDX-MS na escala de tempo de segundos 16,17,18,19,20 . Métodos emergentes de HDX-MS com rotulagem nos domínios de segundos/minutos têm sido mostrados para obter informações estruturais para G-quadruplexes de DNA, mas deve ser possível estender isso a estruturas oligonucleotídeos mais diversas pela aplicação de milissegundos HDX-MS21.
Os experimentos HDX-MS podem ser realizados em três níveis diferentes: (1) de baixo para cima (pelo qual a proteína rotulada é digerida proteolítico), (2) de baixo para baixo (pelo qual a proteína rotulada é digerida proteolyticamente, e os peptídeos resultantes são fragmentados ainda mais por técnicas de fragmentação suave) e (3) de cima para baixo (pelo qual as técnicas de fragmentação macia são diretamente fragmentadas a proteína rotulada) 22 . Assim, os dados sub-moleculares do HDX-MS permitem-nos localizar o comportamento de troca para regiões específicas de uma proteína, tornando-se fundamental ter cobertura de sequência adequada para tais experimentos. A resolução estrutural de qualquer experimento HDX-MS baseia-se no número de peptídeos ou fragmentos protelíticos derivados da proteína após a digestão ou fragmentação suave, respectivamente. Em cada um dos três tipos de experimentos descritos acima, a mudança na troca de amide em cada peptídeo/fragmento é mapeada de volta à estrutura primária da proteína para indicar o comportamento das regiões localizadas da proteína. Embora a maior resolução estrutural seja alcançada através da fragmentação suave, a descrição desses experimentos está fora do escopo do presente estudo, que se concentra na medição de conformações monômeros de aSyn. Excelentes resultados podem ser obtidos com o fluxo de trabalho "de baixo para cima" comumente aplicado descrito aqui.
Aqui, são fornecidos procedimentos sobre (1) como preparar e lidar com amostras de ASyn e buffers HDX-MS, (2) como realizar mapeamento de peptídeos para um experimento HDX-MS de baixo para cima, (3) como adquirir dados HDX-MS sobre ayn monomérica em condições fisiológicas, especificamente no domínio de tempo milissegundo (usando um instrumento personalizado; instrumentos alternativos para rotulagem de milisse e (4) como processar e analisar os dados do HDX-MS. Métodos que utilizam aSyn monomérica em pH fisiológico (7.40) em duas condições de solução são exemplificados aqui. Embora criticamente úteis no estudo de aSyn, esses procedimentos podem ser aplicados a qualquer proteína e não se limitam a proteínas intrinsecamente desordenadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

Alfa-sinucleína (aSyn) é uma proteína intrinsecamente desordenada cujos agregados fibrilares são abundantes em corpos e neuridos de Lewy, que são as marcas da doença de Parkinson. No entanto, grande parte de sua atividade biológica, bem como sua agregação, envolve centralmente a forma de monômero solúvel da proteína. A elucidação dos mecanismos moleculares da biologia e da fisiopatologia requer métodos estruturalmente altamente resolvidos e é sensível às condições biológicas. Suas estruturas nativamente desdobradas e meta-estáveis tornam o aSyn monoméico intratável a muitas técnicas de biologia estrutural. Aqui, a aplicação de uma dessas abordagens é descrita: espectrometria de massa de hidrombútrio/deutério(HDX-MS) na escala de tempo de milissegundos para o estudo de proteínas com baixa estabilidade termodinâmica e fatores fracos de proteção, como aSyn. Na escala de tempo de milissegundos, os dados HDX-MS contêm informações sobre a acessibilidade solvente e a estrutura ligada a hidrogênio de aSyn, que são perdidas em tempos de rotulagem mais longos, resultando em resolução estrutural até o nível de aminoácido. Portanto, o HDX-MS pode fornecer informações em altas resoluções estruturais e temporais sobre dinâmica conformacional e termodinâmica, interações intra e intermárgidas, e o impacto estrutural de mutações ou alterações às condições ambientais. Embora amplamente aplicável, é demonstrado como adquirir, analisar e interpretar medidas milissegundos de HDX-MS em aSyn monomérica.

Devido à sua natureza intrinsecamente desordenada, é difícil capturar as intrincadas mudanças estruturais em aSyn no pH fisiológico. HDX-MS monitora a troca isotópica em hidrogênios de amido backbone, sondando a dinâmica e interações conformais da proteína. É uma das poucas técnicas para adquirir essas informações em altas resoluções estruturais e temporais. Este protocolo é amplamente aplicável a uma ampla gama de proteínas e condições de tampão, e isso é exemplificado pela medição da cinética...

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Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

O conjunto estrutural da alfa-sinucleína monomérica afeta sua função fisiológica e propriedades fisiológicas. O presente protocolo descreve como realizar espectrometria de massa de milissegundos de hidrogênio/deutério e análises subsequentes de dados para determinar informações conformais sobre o monômero dessa proteína intrinsecamente desordenada em condições fisiológicas.

Espectrometria de massa de hidrogênio/deutério-deutério para o estudo da dinâmica estrutural alfa-sinucleína sob condições fisiológicas

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Todos os organismos têm desordem em seu proteome, estimado em até 33% Essas regiões são observáveis pela espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério, mas apenas na faixa de tempo de milissegundos. Nosso protocolo mostrará como fazer isso com sucesso. Esta é uma técnica analítica totalmente automatizada.Você apenas configura tudo, programa as medidas de tempo desejadas, bate ir e ir embora. Esta técnica abre a oportunidade emocionante de triagem de compostos que estabilizam confirmações específicas de proteínas intrinsecamente desordenadas, tais alfa-sinucleína. Para iniciar a preparação da amostra para o mapeamento do peptídeo, primeiro pegue um frasco de estoque de proteína alfa-sinucleína armazenado do congelador de menos 80 graus Celsius.E uma vez descongelado, filtrar usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Em seguida, meça a absorvância da solução em 218 nanômetros para determinar a concentração de proteínas usando a lei de Beer-Lambert, e dilua a proteína com tampão de equilíbrio para uma concentração final de cinco micromolares. Em seguida, para configurar o robô autosampler, adicione 50 microlitres da solução de proteína de cinco micromolares a um frasco de recuperação total, e coloque o frasco na posição amostral na câmara direita da troca de hidrogênio/deutério, ou HDX, robótico em linha com o espectrômetro de massa.Em seguida, coloque um frasco de tampão de equilíbrio e dois frascos de tampão de lavagem de pepsina para as posições de reagente um, quatro e cinco das câmaras esquerdas e um frasco de tampão de saciamento para a posição do reagente um na câmara direita HDX e definir a temperatura em 20 graus Celsius usando o controlador de temperatura Peltier. Em seguida, adicione um número igual de frascos de recuperação total e frascos máximos de recuperação nas mesmas posições de reação da câmara esquerda HDX e da câmara direita HDX, respectivamente. Em seguida, configure uma lista de amostras com métodos LC e MS apropriados no software de agendamento e inicie o cronograma.Para obter o mapa final de cobertura de peptídeos, faça a curadoria manual das atribuições isotópicas no software de análise de dados DynamX HDX. Depois de limpar o instrumento protótipo Fast HDX, abra a interface gráfica do usuário do software HDX compatível para inicializar o sistema. Digite 20 graus Celsius e 0,5 graus Celsius como a câmara amostral e saciar as temperaturas da câmara, respectivamente, seguido de clique definido para aplicar as novas temperaturas.Para limpar e preparar o instrumento, configure os tubos de centrífugas com água de grau LC/MS em todas as entradas, verifique as seringas esquerda e direita na guia de entrega de encanamento do titulante e continue clicando no prime até que todas as bolhas de ar latentes nos tubos se foram. Para verificar todas as caixas em busca de seringas, primeiro vá para a guia macros e clique na posição inicial das seringas calibradas, em seguida, primeiro clique em lavar o laço de carga da seringa, seguido por lavar todos os volumes de loop de mistura. Se houver alguma bolha em uma seringa tampão, desconecte a seringa e desgas-la ejetando verticalmente a bolha.Antes de recalibrar para a posição zero, substitua a seringa. Para configurar o instrumento protótipo Fast HDX para experimentos HDX, insira primeiro o tubo de entrada de titulação esquerda no frasco de recuperação total. Para evitar a oligomerização e agregação induzidas pela temperatura, coloque o tubo em uma geladeira de mesa.Em seguida, adicione 50 mililitros de equilíbrio, rotulagem, saciamento e tampões de lavagem de pepsina às respectivas entradas tampão nas câmaras direita e esquerda do instrumento, seguido pela adição de 50 mililitros de tampão de lavagem de coluna à entrada de lavagem de pepsina. Para escorraçar as linhas de lavagem de proteínas e colunas, verifique as seringas direita e esquerda na guia de entrega de encanamento do titulante e clique no prime uma vez. Depois de verificar todas as caixas em busca de seringas como demonstrado anteriormente, vá para a guia de fluxo de saciamento manual para inserir as configurações necessárias.Para um experimento de curso de tempo, use o botão de ponto simbólico para inserir os tempos em milissegundos. Em seguida, configure o tempo de armadilha para três e a espera para hplc para prender tempo mais tempo de execução mais 1,5 minutos. Se os experimentos em branco forem executados entre os executes de amostra, clique na caixa em branco de execução depois de garantir uma entrada no software de aquisição para a execução em branco após cada amostra executada.Uma vez que a lista de amostras esteja pronta e as entradas apropriadas tenham sido destacadas, inicie a execução clicando em reprodução e Fast HDX no software. Para processamento de dados, abra o menu de arquivos do arquivo de peptídeos atribuídos espectralmente dos experimentos de mapeamento de peptídeos e clique em abrir no software DynamX e, em seguida, importe os arquivos brutos para o software DynamX. Depois de abrir o menu de dados, clique em Arquivos MS.Para criar estados para cada condição proteica que está sendo estudada, clique em novo estado. Para adicionar cada ponto de tempo HDX, clique em nova exposição e clique em novo raw. Para importar arquivos brutos, arraste cada arquivo para a posição correta e clique em OK quando terminar.Depois de atribuir automaticamente isótopos, faça a curadoria manual da atribuição isotópica para garantir a alta qualidade dos dados. Exporte os dados do cluster no arquivo csv com a ordem da coluna, conforme descrito no manuscrito. Abra o menu de dados no software de medição de massa e clique em dados de cluster de exportação.Para análise de dados, primeiro carregue os dados agrupados exportados no software de análise HDX HDfleX. Para se adequar aos dados experimentais para todos os experimentos e estados, selecione os métodos apropriados de correção de back exchange para obter as constantes de taxa observadas para a reação HDX. Em seguida, calcule um limiar de significância global usando um método preferencial no HDfleX e realize testes de significância híbrida para determinar as diferenças significativas entre os estados em comparação.O experimento de mapeamento da alfa-sinucleína gerou um mapa de cobertura de peptídeos que cobria 100% da sequência proteica com uma redundância média de 3,79. Além disso, este protocolo permitiu a geração de curvas de absorção de deutério para diferentes peptídeos de alfa-sinucleína, que foram então expressos como gráficos corrigidos por troca de costas e back exchange. Era evidente que a maior parte da troca de hidrogênio/deutério em alfa-sinucleína foi feita por um segundo.A diferença conformacional entre os estados A e B de alfa-sinucleína também foi evidente a partir da maior absorção de deutério por estado B, tanto nos níveis de peptídeos quanto de aminoácidos. Para uma técnica tão sensível, é importante utilizar testes estatísticos robustos de significância ao comparar dados. Aqui, usamos nosso software HDfleX.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Administração oral de rotenona usando um Gavage e Análise de Imagem de Alpha-sinucleína Inclusões no sistema nervoso entérico

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Neurociência

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Implantação de miniosmóticas Bombas e Entrega de Tracers Trato de Estudar Reorganização do cérebro em condições fisiopatológicas

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

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Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

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Músculo levantador Auris Longus Preparação para exame da transmissão Neuromuscular mamíferos sob condições de grampo de tensão

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