Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
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NS está financiado por la Beca Del Jubileo de Diamante del Consejo Universitario. JJP cuenta con el apoyo de una beca UKRI Future Leaders Fellowship [Número de subvención: MR/T02223X/1].

1. Expresión proteica y purificación de aSyn
<ol><li>Prepare aSyn siguiendo un informe publicado anteriormente9.</li>
	<li>Dializar en un tampón de almacenamiento seguro (por ejemplo, Tris, pH 7.2 ).</li>
	<li>Si es necesario, concentre la muestra (por ejemplo, tubos de microcentrífuga de filtro de espín utilizando 3 kDa MWCO, 14,000 x g durante aproximadamente 10-30 min, consulte la Tabla de materiales). NOTA: Se aconseja no concentrarse excesi...

En el presente artículo, se describen los siguientes procedimientos: (1) realizar experimentos de mapeo de péptidos en aSyn monomérico para obtener la mayor cobertura de secuencia, (2) adquirir datos de HDX-MS de milisegundos en aSyn monomérico en condiciones fisiológicas, y (3) realizar análisis de datos e interpretación de los datos hdX-MS resultantes. Los procedimientos proporcionados son generalmente fáciles de ejecutar, cada experimento de etiquetado generalmente dura solo alrededor de 8 h para tres réplica...

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a millones de personas en todo el mundo1. Se caracteriza por la formación de inclusiones citoplasmáticas conocidas como cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy en la región de la sustancia negra pars compacta del cerebro. Se ha encontrado que estas inclusiones citoplasmáticas contienen agregados de la proteína intrínsecamente desordenada aSyn2. En la EP y otras sinucleinopatías, aSyn se transforma de un estado desordenado soluble en un estado enfermo insoluble y altamente estructurado. En su forma nativa, aSyn monomérico adopta una amplia gama de conformaciones estabilizadas por interacciones electrostáticas de largo alcance entre su N- y C-termini e interacciones hidrofóbicas entre su región C-terminal y el componente beta no amiloide (NAC) 3,4,5,6. Cualquier interrupción en esas interacciones estabilizadoras, como mutaciones, modificaciones post-traduccionales y cambios en el entorno local, puede conducir al plegamiento incorrecto del monómero, desencadenando así el proceso de agregación7.
Si bien existe una gran cantidad de investigación sobre las formas oligomérica y fibrilar de aSyn 8,9,10,11, existe una necesidad crucial de estudiar la forma monomérica de la proteína y comprender mejor qué conformadores son funcionales (y cómo) y cuáles son propensos a agregar 8,9,10,11 . Al ser intrínsecamente desordenado, de solo 14 kDa de tamaño y difícil de cristalizar, el monómero aSyn no es susceptible a la mayoría de las técnicas biológicas estructurales. Sin embargo, una técnica capaz de medir la dinámica conformacional de aSyn monomérico es el HDX-MS de milisegundos, que recientemente ha generado importantes observaciones estructurales que serían desafiantes o imposibles de obtener de otra manera 12,13,14. Millisegundo HDX-MS mide sensiblemente el promedio del conjunto conformacional de proteínas mediante el monitoreo del intercambio isotópico en hidrógenos amida, lo que indica la accesibilidad al solvente y la participación en la red de enlace de hidrógeno de una región proteica particular en la escala de tiempo de milisegundos. Es necesario enfatizar el aspecto de milisegundos del HDX-MS ya que, debido a su naturaleza metaestable y desplegada de forma nativa, aSyn exhibe una cinética de intercambio de hidrógeno muy rápida que se manifiesta muy por debajo del límite inferior de los sistemas HDX-MS convencionales. Por ejemplo, la mayor parte de la molécula aSyn ha intercambiado completamente hidrógeno por deuterio en condiciones intracelulares en menos de 1 s. Varios laboratorios han construido instrumentación de mezcla rápida; en este caso, se utiliza un prototipo de instrumento de flujo de enfriamiento de mezcla rápida capaz de realizar HDX-MS con un tiempo muerto de 50 ms y una resolución temporal de 1 ms15. Si bien HDX-MS de milisegundos ha sido recientemente muy importante en el estudio de aSyn, puede ser valioso para estudiar proteínas / regiones intrínsecamente desordenadas más ampliamente y una gran cantidad de proteínas con asas / regiones que solo son débilmente estables. Por ejemplo, medicamentos peptídicos (por ejemplo, insulina; GLP-1/glucagón; tirzepatida) y las proteínas de fusión peptídica (por ejemplo, el inhibidor del VIH FN3-L35-T1144) son los principales formatos de fármacos en los que la información estructural y de estabilidad en fase de solución puede ser un insumo crítico para las decisiones de desarrollo de fármacos y, sin embargo, la fracción peptídica a menudo solo es débilmente estable e intratable por HDX-MS en la escala de tiempo de segundos 16,17,18,19,20 . Se ha demostrado que los métodos emergentes HDX-MS con etiquetado en los dominios de segundos/minutos derivan información estructural para los G-cuadrúplex de ADN, pero debería ser posible extender esto a estructuras de oligonucleótidos más diversas mediante la aplicación de HDX-MS21 de milisegundos.
Los experimentos hdX-MS se pueden realizar en tres niveles diferentes: (1) de abajo hacia arriba (por lo que la proteína marcada se digiere proteolíticamente), (2) de medio hacia abajo (por lo que la proteína marcada se digiere proteolíticamente y los péptidos resultantes se fragmentan aún más mediante técnicas de fragmentación suave) y (3) de arriba hacia abajo (mediante la cual las técnicas de fragmentación suave fragmentan directamente la proteína marcada)22 . Por lo tanto, los datos submoleculares de HDX-MS nos permiten localizar el comportamiento de intercambio a regiones específicas de una proteína, por lo que es fundamental tener una cobertura de secuencia adecuada para tales experimentos. La resolución estructural de cualquier experimento HDX-MS se basa en el número de péptidos proteolíticos o fragmentos derivados de la proteína en la digestión o la fragmentación suave, respectivamente. En cada uno de los tres tipos de experimentos descritos anteriormente, el cambio en el intercambio de amida en cada péptido / fragmento se mapea de nuevo en la estructura primaria de la proteína para indicar el comportamiento de las regiones localizadas de la proteína. Si bien la resolución estructural más alta se logra a través de la fragmentación suave, la descripción de estos experimentos está fuera del alcance del estudio actual, que se centra en la medición de conformaciones de monómeros aSyn. Se pueden obtener excelentes resultados con el flujo de trabajo "de abajo hacia arriba" comúnmente aplicado que se describe aquí.
Aquí, se proporcionan procedimientos sobre (1) cómo preparar y manejar muestras de aSyn y búferes HDX-MS, (2) cómo realizar el mapeo de péptidos para un experimento HDX-MS de abajo hacia arriba, (3) cómo adquirir datos HDX-MS en aSyn monomérico en condiciones fisiológicas, específicamente en el dominio del tiempo de milisegundos (utilizando un instrumento personalizado; también se han descrito instrumentos alternativos para el etiquetado de milisegundos), y (4) cómo procesar y analizar los datos de HDX-MS. Los métodos que utilizan aSyn monomérico a pH fisiológico (7.40) en dos condiciones de solución se ejemplifican aquí. Si bien son críticamente útiles en el estudio de aSyn, estos procedimientos se pueden aplicar a cualquier proteína y no se limitan a proteínas intrínsecamente desordenadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

La alfa-sinucleína (aSyn) es una proteína intrínsecamente desordenada cuyos agregados fibrilares son abundantes en los cuerpos de Lewy y las neuritas, que son las características distintivas de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, gran parte de su actividad biológica, así como su agregación, involucra centralmente la forma de monómero soluble de la proteína. La elucidación de los mecanismos moleculares de la biología y fisiopatología de aSyn requiere métodos estructuralmente altamente resueltos y es sensible a las condiciones biológicas. Sus estructuras metaestables desplegadas de forma nativa hacen que el aSyn monomérico sea intratable para muchas técnicas de biología estructural. Aquí, se describe la aplicación de uno de estos enfoques: espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX-MS) en la escala de tiempo de milisegundos para el estudio de proteínas con baja estabilidad termodinámica y factores de protección débiles, como aSyn. En la escala de tiempo de milisegundos, los datos de HDX-MS contienen información sobre la accesibilidad al disolvente y la estructura unida al hidrógeno de aSyn, que se pierden en tiempos de etiquetado más largos, lo que en última instancia produce una resolución estructural hasta el nivel de aminoácidos. Por lo tanto, HDX-MS puede proporcionar información a altas resoluciones estructurales y temporales sobre dinámica conformacional y termodinámica, interacciones intra e intermoleculares, y el impacto estructural de mutaciones o alteraciones en las condiciones ambientales. Si bien es ampliamente aplicable, se demuestra cómo adquirir, analizar e interpretar mediciones de HDX-MS de milisegundos en aSyn monomérica.

Debido a su naturaleza intrínsecamente desordenada, es difícil capturar los intrincados cambios estructurales en aSyn a pH fisiológico. HDX-MS monitorea el intercambio isotópico en los hidrógenos de amida de la columna vertebral, sondeando la dinámica e interacciones conformacionales de las proteínas. Es una de las pocas técnicas para adquirir esta información a altas resoluciones estructurales y temporales. Este protocolo es ampliamente aplicable a una amplia gama de proteínas y condiciones tampón, y esto se ...

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Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

El conjunto estructural de la alfa-sinucleína monomérica afecta su función fisiológica y sus propiedades fisicoquímicas. El presente protocolo describe cómo realizar espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos y análisis de datos posteriores para determinar información conformacional sobre el monómero de esta proteína intrínsecamente desordenada en condiciones fisiológicas.

Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Todos los organismos tienen desorden en su proteoma, estimado hasta un 33%Estas regiones son observables por espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio, pero solo en el rango de tiempo de milisegundos. Nuestro protocolo le mostrará cómo hacer esto con éxito. Esta es una técnica analítica totalmente automatizada.Simplemente configura todo, programa las mediciones de tiempo deseadas, presiona ir y aléjate. Esta técnica abre la emocionante oportunidad de detectar compuestos que estabilicen confirmaciones específicas de proteínas intrínsecamente desordenadas como la alfa-sinucleína. Para comenzar la preparación de la muestra para el mapeo de péptidos, primero tome un vial de proteína alfa-sinucleína almacenada del congelador de menos 80 grados centígrados.Y una vez descongelado, filtre con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. Luego mida la absorbancia de la solución a 218 nanómetros para determinar la concentración de proteína utilizando la ley de Beer-Lambert, y diluya la proteína con un tampón de equilibrio a una concentración final de cinco micromolares. A continuación, para configurar el robot de automuestreo, agregue 50 microlitros de la solución de proteína de cinco micromolares a un vial de recuperación total y coloque el vial en la posición de muestra en la cámara derecha del intercambio de hidrógeno / deuterio, o HDX, robótica en línea con el espectrómetro de masas.Luego coloque un vial de tampón de equilibrio y dos viales de tampón de lavado de pepsina en las posiciones de reactivo uno, cuatro y cinco de las cámaras izquierdas y un vial de tampón de enfriamiento para colocar uno en la cámara derecha hdX y ajuste la temperatura a 20 grados Celsius usando el controlador de temperatura Peltier. A continuación, agregue un número igual de viales de recuperación total y viales de recuperación máxima en las mismas posiciones de reacción de la cámara izquierda HDX y la cámara derecha HDX, respectivamente. A continuación, configure una lista de ejemplo con los métodos LC y MS apropiados en el software de programación e inicie la programación.Para obtener el mapa final de cobertura de péptidos, seleccione manualmente las asignaciones isotópicas en el software de análisis de datos DynamX HDX. Después de limpiar el prototipo de instrumento Fast HDX, abra la interfaz gráfica de usuario del software HDX compatible para inicializar el sistema. Introduzca 20 grados Celsius y 0,5 grados Celsius como temperaturas de la cámara de muestra y de la cámara de enfriamiento respectivamente, seguido de hacer clic en establecer para aplicar las nuevas temperaturas.Para limpiar y preparar el instrumento, configure los tubos de la centrífuga con agua de grado LC / MS en todas las entradas, luego verifique las jeringas izquierda y derecha en la pestaña de entrega de plomería del valorador y continúe haciendo clic en la imprimación hasta que todas las burbujas de aire latentes en los tubos desaparezcan. Para marcar todas las casillas de jeringas, primero vaya a la pestaña macros y haga clic en calibrar jeringas en la posición de inicio, luego primero haga clic en el bucle de carga de la jeringa de lavado, seguido de lavar todos los volúmenes del bucle de mezcla. Si hay alguna burbuja en una jeringa tampón, desconecte la jeringa y desgasifá desgasificándola verticalmente.Antes de recalibrar a la posición cero, reemplace la jeringa. Para configurar el prototipo de instrumento Fast HDX para experimentos HDX, primero inserte el tubo de entrada de valoración izquierdo en el vial de recuperación total. Para evitar la oligomerización y agregación inducida por la temperatura, coloque el tubo en un refrigerador de mesa.A continuación, agregue 50 mililitros de equilibrio, etiquetado, enfriamiento y tampones de lavado de pepsina a las respectivas entradas de tampón en las cámaras derecha e izquierda del instrumento, seguido de agregar 50 mililitros de tampón de lavado de columna a la entrada de lavado de pepsina. Para cebar las líneas de lavado de proteínas y columnas, verifique las jeringas derecha e izquierda en la pestaña de entrega de plomería del valorador y haga clic en cebar una vez. Después de marcar todas las casillas de jeringas como se demostró anteriormente, vaya a la pestaña de flujo de enfriamiento manual para ingresar la configuración requerida.Para un experimento de curso de tiempo, use el botón de punto simbólico para ingresar los tiempos en milisegundos. A continuación, establezca el tiempo de captura en tres y la espera a que HPLC recoja el tiempo más el tiempo de ejecución más 1,5 minutos. Si se ejecutan experimentos en blanco entre ejecuciones de muestra, haga clic en el cuadro en blanco Ejecutar después de asegurarse de que haya una entrada en el software de adquisición para la ejecución en blanco después de cada ejecución de muestra.Una vez que la lista de muestra esté lista y se hayan resaltado las entradas apropiadas, inicie la ejecución haciendo clic en reproducir y Fast HDX en el software. Para el procesamiento de datos, abra el menú de archivos del archivo de péptidos asignados espectralmente de los experimentos de mapeo de péptidos y haga clic en abrir en el software DynamX, luego importe los archivos sin procesar al software DynamX. Después de abrir el menú de datos, haga clic en MS Files.Para crear estados para cada condición de proteína que se está estudiando, haga clic en nuevo estado. Para agregar cada punto de tiempo HDX, haga clic en nueva exposición y, a continuación, haga clic en nuevo raw. Para importar archivos sin procesar, arrastre cada archivo a la posición correcta y haga clic en Aceptar cuando haya terminado.Después de asignar automáticamente isótopos, seleccione manualmente la asignación isotópica para garantizar una alta calidad de los datos. Exporte los datos del clúster en un archivo csv con el orden de columnas como se describe en el manuscrito. Abra el menú de datos en el software de medición de masa y haga clic en exportar datos de clúster.Para el análisis de datos, primero cargue los datos agrupados exportados en el software de análisis HDX HDfleX. Para ajustar los datos experimentales de todos los experimentos y estados, seleccione los métodos de corrección de intercambio posterior apropiados para obtener las constantes de velocidad observadas para la reacción HDX. Luego calcule un umbral de significancia global utilizando un método preferido en HDfleX y realice pruebas de significación híbridas para determinar las diferencias significativas entre los estados comparados.El experimento de mapeo en alfa-sinucleína generó un mapa de cobertura peptídica que cubrió el 100% de la secuencia de proteínas con una redundancia promedio de 3.79. Además, este protocolo permitió la generación de curvas de captación de deuterio para diferentes péptidos de alfa-sinucleína, que luego se expresaron como gráficos corregidos ajustados y de intercambio posterior. Fue evidente que la mayor parte del intercambio de hidrógeno / deuterio en alfa-sinucleína se realizó por un segundo.La diferencia conformacional entre los estados A y B de alfa-sinucleína también fue evidente a partir de la mayor absorción de deuterio por el estado B tanto a nivel de péptido como de aminoácidos. Para una técnica tan sensible, es importante utilizar pruebas de significación estadística robustas al comparar datos. Aquí, utilizamos nuestro software HDfleX.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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La administración oral de la rotenona con una sonda y Análisis de Imágenes de la alfa-sinucleína inclusiones en el sistema nervioso entérico

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Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

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