Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

NS finansieras av Universitetsrådets Diamantjubileumsstipendium. JJP stöds av ett UKRI Future Leaders Fellowship [Bidragsnummer: MR/T02223X/1].

1. Proteinuttryck och rening av aSyn
<ol><li>Förbered aSyn efter en tidigare publicerad rapport9.</li>
	<li>Dialys till en säker lagringsbuffert (t.ex. Tris, pH 7,2 ).</li>
	<li>Koncentrera vid behov provet (t.ex. mikrocentrifugrör med spinnfilter med 3 kDa MWCO, 14 000 x g i cirka 10–30 minuter, se materialtabell). OBS: Det rekommenderas att inte koncentrera sig för mycket. Monomerensemblens integritet har inte verifierats längre än 25 μM.<...

I den här artikeln beskrivs följande procedurer: (1) utföra peptidkartläggningsexperiment på monomer aSyn för att erhålla den högsta sekvenstäckningen, (2) förvärva millisekund HDX-MS-data på monomer aSyn under fysiologiska förhållanden och (3) utföra dataanalys och tolkning av de resulterande HDX-MS-data. De angivna procedurerna är i allmänhet enkla att utföra, varje märkningsexperiment varar vanligtvis bara cirka 8 timmar för tre replikat och åtta tidpunkter, och kartläggningsexperimentet varar ba...

Parkinsons sjukdom (PD) är en neurodegenerativ sjukdom som drabbar miljontals människor världen över1. Det kännetecknas av bildandet av cytoplasmatiska inklusioner som kallas Lewy-kroppar och Lewy-neuriter i hjärnans substantia nigra pars compacta-region. Dessa cytoplasmatiska inklusioner har visat sig innehålla aggregat av det inneboende oordnade proteinet aSyn2. Vid PD och andra synucleinopatier omvandlas aSyn från ett lösligt oordnat tillstånd till ett olösligt, mycket strukturerat sjukt tillstånd. I sin ursprungliga form antar monomer aSyn ett brett spektrum av konformationer stabiliserade av långväga elektrostatiska interaktioner mellan dess N- och C-termini och hydrofoba interaktioner mellan dess C-terminus och icke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuella störningar i dessa stabiliserande interaktioner, såsom mutationer, post-translationella modifieringar och förändringar i den lokala miljön, kan leda till felveckning av monomeren, vilket utlöser aggregeringsprocessen7.
Medan det finns en stor mängd forskning om oligomera och fibrillära former av aSyn 8,9,10,11, finns det ett avgörande behov av att studera proteinets monomera form och bättre förstå vilka konformatorer som är funktionella (och hur) och vilka som är benägna att aggregera 8,9,10,11 . Att vara inneboende oordnad, endast 14 kDa i storlek och svår att kristallisera, är aSyn-monomeren inte mottaglig för de flesta strukturella biologiska tekniker. En teknik som kan mäta konformationsdynamiken hos monomer aSyn är dock millisekund HDX-MS, som nyligen har genererat viktiga strukturella observationer som annars skulle vara utmanande eller omöjliga att få 12,13,14. Millisekund HDX-MS mäter känsligt medelvärdet av proteinkonformationsensemblen genom att övervaka isotoputbytet vid amidväteer, vilket indikerar lösningsmedelstillgänglighet och vätebindningsnätverksdeltagande för en viss proteinregion på millisekundtidsskalan. Det är nödvändigt att betona millisekundaspekten av HDX-MS eftersom aSyn på grund av sin naturligt utvecklade, metastabila natur uppvisar mycket snabb väteutbyteskinetik som manifesterar sig långt under den nedre gränsen för konventionella HDX-MS-system. Till exempel har det mesta av aSyn-molekylen helt bytt ut väte mot deuterium under intracellulära förhållanden på mindre än 1 s. Flera laboratorier har nu byggt snabbblandande instrument; i detta fall används ett prototyp snabbt mixande släckflödesinstrument som kan utföra HDX-MS med en dödtid på 50 ms och en tidsupplösning på 1 ms15. Medan millisekund HDX-MS nyligen har varit akut viktigt i studien av aSyn, står det att vara värdefullt för att studera inneboende oordnade proteiner / regioner i större utsträckning och ett stort antal proteiner med loopar / regioner som bara är svagt stabila. Till exempel peptidläkemedel (t.ex. insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) och peptidfusionsproteiner (t.ex. HIV-hämmaren FN3-L35-T1144) är viktiga läkemedelsformat där struktur- och stabilitetsinformation i lösningsfasen kan vara en kritisk ingång för beslut om läkemedelsutveckling, och ändå är peptiddelen ofta bara svagt stabil och svårhanterlig av HDX-MS vid sekundernas tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS-metoder med märkning i sekunder/minuter-domänerna har visat sig härleda strukturell information för DNA G-quadruplexer, men det bör vara möjligt att utvidga detta till mer olika oligonukleotidstrukturer genom tillämpning av millisekund HDX-MS21.
HDX-MS-experiment kan utföras på tre olika nivåer: (1) bottom-up (varigenom det märkta proteinet smälts proteolytiskt), (2) middle-down (där det märkta proteinet smälts proteolytiskt och de resulterande peptiderna fragmenteras ytterligare genom mjukfragmenteringstekniker), och (3) top-down (där mjukfragmenteringstekniker direkt fragmenterar det märkta proteinet)22 . Således tillåter submolekylära HDX-MS-data oss att lokalisera utbytesbeteendet till specifika regioner i ett protein, vilket gör det kritiskt att ha tillräcklig sekvenstäckning för sådana experiment. Den strukturella upplösningen för alla HDX-MS-experiment beror på antalet proteolytiska peptider eller fragment härledda från proteinet vid matsmältning respektive mjukfragmentering. I var och en av de tre experimenttyperna som beskrivs ovan mappas förändringen i amidutbyte vid varje peptid / fragment tillbaka på proteinets primära struktur för att indikera beteendet hos lokaliserade regioner i proteinet. Medan den högsta strukturella upplösningen uppnås genom mjuk fragmentering, är beskrivningen av dessa experiment utanför ramen för den aktuella studien, som fokuserar på mätning av aSyn-monomerkonformationer. Utmärkta resultat kan erhållas med det vanliga "bottom-up" -arbetsflödet som beskrivs här.
Här tillhandahålls procedurer för (1) hur man förbereder och hanterar aSyn-prover och HDX-MS-buffertar, (2) hur man utför peptidkartläggning för ett HDX-MS-experiment underifrån, (3) hur man förvärvar HDX-MS-data på monomer aSyn under fysiologiska förhållanden, särskilt i millisekundtidsdomänen (med hjälp av ett specialbyggt instrument; alternativa instrument för millisekundmärkning har också beskrivits), och (4) hur man bearbetar och analyserar HDX-MS-data. Metoder som använder monomer aSyn vid fysiologiskt pH (7,40) i två lösningsförhållanden exemplifieras här. Även om de är kritiskt användbara i studien av aSyn, kan dessa procedurer tillämpas på vilket protein som helst och är inte begränsade till inneboende oordnade proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

Alfa-synuklein (aSyn) är ett inneboende oordnat protein vars fibrillära aggregat är rikliga i Lewy-kroppar och neuriter, som är kännetecknen för Parkinsons sjukdom. Ändå involverar mycket av dess biologiska aktivitet, liksom dess aggregering, centralt den lösliga monomerformen av proteinet. Belysning av de molekylära mekanismerna i aSynbiologi och patofysiologi kräver strukturellt högt upplösta metoder och är känslig för biologiska förhållanden. Dess naturligt utfällda, metastabila strukturer gör monomer aSyn svårhanterlig för många strukturbiologiska tekniker. Här beskrivs tillämpningen av ett sådant tillvägagångssätt: väte/ deuteriumutbytesmasspektrometri (HDX-MS) på millisekundens tidsskala för studier av proteiner med låg termodynamisk stabilitet och svaga skyddsfaktorer, såsom aSyn. Vid millisekundens tidsskala innehåller HDX-MS-data information om lösningsmedelstillgänglighet och vätebunden struktur hos aSyn, som går förlorad vid längre märkningstider, vilket i slutändan ger strukturell upplösning upp till aminosyranivån. Därför kan HDX-MS ge information vid höga strukturella och tidsmässiga upplösningar om konformationsdynamik och termodynamik, intra- och intermolekylära interaktioner och de strukturella effekterna av mutationer eller förändringar i miljöförhållandena. Även om det är allmänt tillämpligt visas det hur man förvärvar, analyserar och tolkar millisekunder HDX-MS-mätningar i monomer aSyn.

På grund av dess inneboende oordnade natur är det svårt att fånga de invecklade strukturella förändringarna i aSyn vid fysiologiskt pH. HDX-MS övervakar isotoputbytet vid ryggradsamidväteer och undersöker proteinkonformationsdynamiken och interaktionerna. Det är en av få tekniker för att förvärva denna information vid höga strukturella och tidsmässiga upplösningar. Detta protokoll är i stort sett tillämpligt på ett brett spektrum av proteiner och buffertförhållanden, och detta exemplifieras genom m?...

Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Det strukturella ensemblet av monomer alfa-synuklein påverkar dess fysiologiska funktion och fysikalisk-kemiska egenskaper. Detta protokoll beskriver hur man utför millisekundväte / deuteriumutbytesmasspektrometri och efterföljande dataanalyser för att bestämma konformationsinformationen om monomeren av detta inneboende oordnade protein under fysiologiska förhållanden.

Millisekund väte / deuteriumutbyte masspektrometri för studier av alfa-synuklein strukturell dynamik under fysiologiska förhållanden

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Alla organismer har störningar i sitt proteom, uppskattat upp till 33% Dessa regioner kan observeras med väte / deuteriumutbytesmasspektrometri, men endast i millisekundens tidsintervall. Vårt protokoll visar dig hur du gör detta framgångsrikt. Detta är en helautomatisk analysteknik.Du ställer bara in allt, programmerar önskade tidsmätningar, trycker på gå och gå iväg. Denna teknik öppnar den spännande möjligheten att screena för föreningar som stabiliserar specifika bekräftelser av inneboende oordnade proteiner som alfa-synuklein. För att börja provberedningen för peptidkartläggning, ta först en injektionsflaska med lagrat alfa-synukleinproteinbestånd från frysen minus 80 grader Celsius.Och när det har tinats, filtrera med ett 0,22 mikrometer sprutfilter. Mät sedan lösningens absorbans vid 218 nanometer för att bestämma proteinkoncentrationen med hjälp av Beer-Lamberts lag och späd proteinet med jämviktsbuffert till en slutlig koncentration av fem mikromolar. Därefter, för att ställa in autosamplerroboten, tillsätt 50 mikroliter av den fem mikromolära proteinlösningen till en injektionsflaska med total återhämtning och placera injektionsflaskan i provpositionen i den högra kammaren i väte / deuteriumutbytet, eller HDX, robotik i linje med masspektrometern.Sätt sedan en injektionsflaska med jämviktsbuffert och två injektionsflaskor med pepsintvättbuffert till reagenspositionerna en, fyra och fem av de vänstra kamrarna och en injektionsflaska med släckningsbuffert till reagensposition en i HDX högra kammare och ställ in temperaturen på 20 grader Celsius med peltiers temperaturregulator. Lägg sedan till lika många injektionsflaskor för total återhämtning och injektionsflaskor med maximal återhämtning i samma reaktionspositioner i HDX vänstra kammare respektive HDX högra kammare. Ställ sedan in en exempellista med lämpliga LC- och MS-metoder i schemaläggningsprogramvaran och starta schemat.För att få den slutliga peptidtäckningskartan, kurera isotoptilldelningarna manuellt i DynamX HDX-dataanalysprogramvaran. Efter rengöring av Fast HDX-prototypinstrumentet öppnar du det grafiska användargränssnittet för den kompatibla HDX-programvaran för att initiera systemet. Ange 20 grader Celsius och 0,5 grader Celsius som provkammare respektive släckkammartemperaturer, följt av att klicka på set för att applicera de nya temperaturerna.För att rengöra och förbereda instrumentet, ställ in centrifugrören med LC / MS-vatten vid alla inlopp, kontrollera sedan både vänster och höger sprutor i titratorns VVS-leveransflik och fortsätt klicka på prime tills alla latenta luftbubblor i rören är borta. För att kontrollera alla rutor för sprutor, gå först till makrofliken och klicka på kalibrera sprutor hemposition, klicka sedan först på tvätta sprutbelastningsslingan, följt av tvätta alla blandningsslingvolymer. Om det finns någon bubbla i en buffertspruta, koppla bort sprutan och avgasa den genom att vertikalt mata ut bubblan.Innan du kalibrerar om till nollläget, byt ut sprutan. För att ställa in Fast HDX-prototypinstrumentet för HDX-experiment, sätt först in det vänstra titreringsinloppsröret i injektionsflaskan med total återhämtning. För att förhindra temperaturinducerad oligomerisering och aggregering, placera röret i ett bordskylskåp.Tillsätt sedan 50 ml jämvikts-, märknings-, släck- och pepsintvättbuffertar till respektive buffertinlopp i instrumentets högra och vänstra kammare, följt av tillsats av 50 ml kolonntvättbuffert till pepsintvättinloppet. För att grunda protein- och kolonntvättlinjerna, kontrollera höger och vänster sprutor i titratorns VVS-leveransflik och klicka på prime en gång. Efter att ha kontrollerat alla rutor för sprutor som visats tidigare, gå till fliken manuellt släckflöde för att ange önskade inställningar.För ett tidskursexperiment använder du den symboliska punktknappen för att ange tiderna i millisekunder. Ställ sedan in fälltiden på tre och vänta på att HPLC ska fälla tid plus körtid plus 1,5 minuter. Om tomma experiment körs mellan exempelkörningar klickar du på rutan Kör tom när du har säkerställt en post i förvärvsprogramvaran för den tomma körningen efter varje exempelkörning.När exempellistan är klar och lämpliga poster har markerats startar du körningen genom att klicka på play och Fast HDX i programvaran. För databehandling, öppna filmenyn för filen med spektralt tilldelade peptider från peptidmappningsexperimenten och klicka på öppna i DynamX-programvaran och importera sedan råfilerna till DynamX-programvaran. När du har öppnat datamenyn klickar du på MS Files.För att skapa tillstånd för varje proteintillstånd som studeras, klicka på nytt tillstånd. För att lägga till varje HDX-tidpunkt, klicka på ny exponering och klicka sedan på ny rå. Om du vill importera råfiler drar du varje fil till rätt plats och klickar på OK när du är klar.Efter automatisk tilldelning av isotoper, kurera isotoptilldelningen manuellt för att säkerställa hög datakvalitet. Exportera klusterdata i csv-fil med kolumnordningen enligt beskrivningen i manuskriptet. Öppna datamenyn i massmätningsprogrammet och klicka på exportera klusterdata.För dataanalys läser du först in exporterade klustrade data i HDX-analysprogramvaran HDfleX. För att passa experimentella data för alla experiment och tillstånd, välj lämpliga korrigeringsmetoder för bakåtväxling för att få de observerade hastighetskonstanterna för HDX-reaktionen. Beräkna sedan en global signifikanströskel med hjälp av en föredragen metod i HDfleX och utför hybridbetydelsetestning för att bestämma de signifikanta skillnaderna mellan de jämförda tillstånden.Kartläggningsexperimentet på alfa-synuklein genererade en peptidtäckningskarta som täckte 100% av proteinsekvensen med en genomsnittlig redundans på 3,79. Dessutom möjliggjorde detta protokoll generering av deuteriumupptagskurvor för olika peptider av alfa-synuklein, som sedan uttrycktes som monterade och bakåtväxlingskorrigerade grafer. Det var uppenbart att de flesta väte/ deuteriumutbyte i alfa-synuklein gjordes med en sekund.Konformationsskillnaden mellan tillstånd A och B av alfa-synuklein var också uppenbar från det högre deuteriumupptaget av tillstånd B både vid peptid- och aminosyranivåerna. För en sådan känslig teknik är det viktigt att använda robusta statistiska signifikanstester när man jämför data. Här använde vi vår programvara HDfleX.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Oral administrering av Rotenon med en sondmatning och bildanalys av alfa-synuklein införanden i det enteriska nervsystemet

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-härledda celler i den vuxna mänskliga hjärnan i inducerade Nervceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Implantation av miniosmotiska Pumpar och leverans av Tract Tracers att studera hjärnan Omorganisation i patofysiologiska tillstånd

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sekventiell Utvinning av lösliga och olösliga alfa-synuklein från Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Djupgående fysiologisk analys av Bestämda cellpopulationer i akut vävnadssnitt av Mouse Vomeronasalorganet

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Övervakning Astrocyten reaktivitet och spridning in Vitro ischemisk-liknande villkor

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimering av DAN Matrix för detektion och visualisering av gangliosider i råtthjärnvävnad för MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescence avbildning av Neuroinflammation i transgena möss efter perifer ympning av alfa-synuklein fibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsberoende ökning av nätverkssvaret till stimulering av neuronala cellkulturer på mikroelektroder

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Förberedelse för undersökning av däggdjur neuromuskulär Transmission spänningen klämman villkor

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...