Name: millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

NS, Üniversite Konseyi Elmas Jübile Bursu tarafından finanse edilmektedir. JJP, UKRI Geleceğin Liderleri Bursu [Hibe numarası: MR/T02223X/1] tarafından desteklenmektedir.

1. Protein ekspresyonu ve aSyn'in saflaştırılması
<ol><li>Daha önce yayınlanmış bir rapor9'u takiben aSyn'i hazırlayın.</li>
	<li>Güvenli bir depolama tamponuna diyaliz yapın (örneğin, Tris, pH 7.2).</li>
	<li>Gerekirse, numuneyi konsantre edin (örneğin, yaklaşık 10-30 dakika boyunca 3 kDa MWCO, 14.000 x g kullanarak spin filtre mikrosantrifüj tüpleri, bkz. NOT: Aşırı konsantre olunmaması tavsiye edilir. Monomer topluluğunun ...

Bu makalede, aşağıdaki prosedürler açıklanmaktadır: (1) en yüksek sekans kapsamını elde etmek için monomerik aSyn üzerinde peptid haritalama deneyleri yapmak, (2) fizyolojik koşullar altında monomerik aSyn üzerinde milisaniye HDX-MS verilerinin elde edilmesi ve (3) elde edilen HDX-MS verilerinin veri analizi ve yorumlanması gerçekleştirilmiştir. Sağlanan prosedürlerin uygulanması genellikle basittir, her etiketleme deneyi tipik olarak üç çoğaltma ve sekiz zaman noktası için yalnızca 8 saat s?...

Parkinson hastalığı (PH), dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır1. Beynin substantia nigra pars compacta bölgesinde Lewy cisimleri ve Lewy nöritleri olarak bilinen sitoplazmik inklüzyonların oluşumu ile karakterizedir. Bu sitoplazmik inklüzyonların özünde düzensiz protein aSyn2'nin agregalarını içerdiği bulunmuştur. PD ve diğer sinükleinopatilerde, aSyn çözünür düzensiz bir durumdan çözünmez, yüksek oranda yapılandırılmış hastalıklı bir duruma dönüşür. Doğal formunda, monomerik aSyn, N- ve C-termini arasındaki uzun menzilli elektrostatik etkileşimler ve C-terminus ile amiloid olmayan beta bileşeni (NAC) bölgesi 3,4,5,6 arasındaki hidrofobik etkileşimler ile stabilize edilen çok çeşitli konformasyonları benimser. Mutasyonlar, çeviri sonrası modifikasyonlar ve yerel ortamdaki değişiklikler gibi bu stabilize edici etkileşimlerdeki herhangi bir bozulma, monomerin yanlış katlanmasına yol açabilir ve böylece toplama sürecini tetikleyebilir7.
 aSyn 8,9,10,11'in oligomerik ve fibriller formları üzerinde çok sayıda araştırma mevcut olsa da, proteinin monomerik formunu incelemek ve hangi konformatörlerin işlevsel (ve nasıl) olduğunu ve hangilerininagregaya eğilimli olduğunu daha iyi anlamak için çok önemli bir ihtiyaç vardır. . İçsel olarak düzensiz, sadece 14 kDa büyüklüğünde ve kristalleşmesi zor olan aSyn monomeri, çoğu yapısal biyolojik tekniğe uygun değildir. Bununla birlikte, monomerik aSyn'in konformasyonel dinamiklerini ölçebilen bir teknik, son zamanlarda aksi takdirde elde edilmesi zor veya imkansız olacak önemli yapısal gözlemler üreten milisaniye HDX-MS'dir12,13,14. Milisaniye HDX-MS, amid hidrojenlerindeki izotopik değişimi izleyerek, milisaniye zaman ölçeğinde belirli bir protein bölgesinin çözücü erişilebilirliğini ve hidrojen bağlama ağı katılımını göstererek, protein konformasyonel topluluğunun ortalamasını hassas bir şekilde ölçer. HDX-MS'in milisaniyelik yönünü vurgulamak gerekir, çünkü doğal olarak açılmış, meta-kararlı doğası nedeniyle, aSyn, geleneksel HDX-MS sistemlerinin alt sınırının çok altında tezahür eden çok hızlı hidrojen değişim kinetiği sergiler. Örneğin, aSyn molekülünün çoğu, hücre içi koşullar altında 1 saniyeden daha az bir sürede döteryum için hidrojeni tamamen değiştirmiştir. Birkaç laboratuvar şimdi hızlı karıştırma enstrümantasyonu inşa etti; Bu durumda, 50 ms'lik bir ölü zaman ve 1 ms'lik bir zamansal çözünürlük ile HDX-MS'yi gerçekleştirebilen prototip bir hızlı karıştırma söndürme-akışcihazı kullanılır. Milisaniye HDX-MS son zamanlarda aSyn çalışmasında akut olarak önemli olsa da, özünde düzensiz proteinlerin / bölgelerin daha yaygın olarak ve sadece zayıf derecede kararlı olan döngüleri / bölgeleri olan çok sayıda proteinin incelenmesinde değerli olduğu görülmektedir. Örneğin, peptit ilaçları (örneğin, insülin; GLP-1/glukagon ; tirzepatid) ve peptid-füzyon proteinleri (örneğin, HIV inhibitörü FN3-L35-T1144), çözelti fazı yapısal ve stabilite bilgisinin ilaç geliştirme kararları için kritik bir girdi olabileceği başlıca ilaç formatlarıdır ve yine de, peptid moiety genellikle HDX-MS tarafından saniyeler zaman ölçeğinde zayıf bir şekilde stabil ve inatçıdır16,17,18,19,20 saniye zaman çizelgesinde HDX-MS tarafından inatçıdır. . Saniye/dakika alanlarında etiketleme ile ortaya çıkan HDX-MS yöntemlerinin DNA G-dörtlüleri için yapısal bilgi elde ettiği gösterilmiştir, ancak milisaniye HDX-MS21 uygulaması ile bunu daha çeşitli oligonükleotid yapılarına genişletmek mümkün olmalıdır.
HDX-MS deneyleri üç farklı seviyede gerçekleştirilebilir: (1) aşağıdan yukarıya (etiketli proteinin proteolitik olarak sindirildiği), (2) orta-aşağı (etiketli proteinin proteolitik olarak sindirildiği ve elde edilen peptitlerin yumuşak parçalanma teknikleriyle daha da parçalandığı) ve (3) yukarıdan aşağıya (yumuşak parçalanma tekniklerinin etiketli proteini doğrudan parçaladığı)22 . Bu nedenle, alt moleküler HDX-MS verileri, değişim davranışını bir proteinin belirli bölgelerine lokalize etmemize izin verir ve bu tür deneyler için yeterli dizi kapsamına sahip olmayı kritik hale getirir. Herhangi bir HDX-MS deneyinin yapısal çözünürlüğü, sırasıyla sindirim veya yumuşak parçalanma üzerine proteinden türetilen proteolitik peptitlerin veya fragmanların sayısına dayanır. Yukarıda özetlenen üç deney tipinin her birinde, her bir peptit / fragmandaki amid değişimindeki değişim, proteinin lokalize bölgelerinin davranışını belirtmek için proteinin birincil yapısına geri eşlenir. En yüksek yapısal çözünürlük yumuşak parçalanma yoluyla elde edilirken, bu deneylerin tanımı, aSyn monomer konformasyonlarının ölçümüne odaklanan mevcut çalışmanın kapsamı dışındadır. Burada açıklanan yaygın olarak uygulanan "aşağıdan yukarıya" iş akışı ile mükemmel sonuçlar elde edilebilir.
Burada, (1) aSyn örneklerinin ve HDX-MS tamponlarının nasıl hazırlanacağı ve işleneceği, (2) aşağıdan yukarıya HDX-MS deneyi için peptid haritalamanın nasıl gerçekleştirileceği, (3) monomerik aSyn üzerinde HDX-MS verilerinin fizyolojik koşullar altında, özellikle milisaniye zaman alanında nasıl elde edileceği (özel yapım bir cihaz kullanılarak; milisaniye etiketleme için alternatif araçlar da tanımlanmıştır), ve (4) HDX-MS verilerinin nasıl işleneceği ve analiz edileceği. Monomerik aSyn'in fizyolojik pH'ta (7.40) iki çözelti koşulunda kullanıldığı yöntemler burada örneklendirilmiştir. ASIN çalışmasında kritik derecede yararlı olsa da, bu prosedürler herhangi bir proteine uygulanabilir ve özünde düzensiz proteinlerle sınırlı değildir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#215; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &#956;m C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186002346</td>
			<td>Analytical column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HPLC grade &#62;99.9% HiPerSolv</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20060.420</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chronos</td>
			<td>Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation)</td>
			<td>667006090</td>
			<td>Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-2-50</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide (99.9% D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176016027</td>
			<td>Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymate BEH Pepsin Column</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186007233</td>
			<td>Pepsin digestion column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10596814</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>RDD001-500G</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDfleX</td>
			<td>University of Exeter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>725000637</td>
			<td>Autosampler robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine enkephalin</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186006013</td>
			<td>For mass spectrometry lockspray calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>667004007</td>
			<td>Software controlling inlet methods and mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maximum recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000670CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>N9CA7069B</td>
			<td>Syringe filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ms2min</td>
			<td>Applied Photophysics Ltd</td>
			<td>N/A</td>
			<td>fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Salt for HDX buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>LEAP Technologies Inc.</td>
			<td>HP115-COOL/D</td>
			<td>Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinLynx Global Server 3.0</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>715001030</td>
			<td>Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pot caps</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004632</td>
			<td>100 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent pots for LEAP HDX-2</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186001420</td>
			<td>100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)</td>
			<td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td>
			<td>DLM-57</td>
			<td>For HDX labelling buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)</td>
			<td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td>
			<td>UFC5003</td>
			<td>Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapt G2-Si mass spectrometer</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>176850035</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total recovery vials</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>600000671CV</td>
			<td>100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253-250G</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T60040-B2005</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U5378-1KG</td>
			<td>Chaotrope/Denaturant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column&#160;</td>
			<td>Waters Corporation</td>
			<td>186004623</td>
			<td>Trap desalting column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions

Alfa-sinüklein (aSyn), Parkinson hastalığının ayırt edici özellikleri olan Lewy cisimlerinde ve nöritlerinde fibriller agregaları bol miktarda bulunan, özünde düzensiz bir proteindir. Bununla birlikte, biyolojik aktivitesinin çoğu ve toplanması, proteinin çözünür monomer formunu merkezi olarak içerir. aSyn biyolojisinin ve patofizyolojisinin moleküler mekanizmalarının aydınlatılması, yapısal olarak yüksek oranda çözümlenmiş yöntemler gerektirir ve biyolojik koşullara duyarlıdır. Doğal olarak açılmış, meta-kararlı yapıları, monomerik aSyn'i birçok yapısal biyoloji tekniğine karşı dayanıklı hale getirir. Burada, böyle bir yaklaşımın uygulanması açıklanmaktadır: düşük termodinamik stabiliteye ve aSyn gibi zayıf koruma faktörlerine sahip proteinlerin incelenmesi için milisaniyelik zaman ölçeğinde hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS). Milisaniyelik zaman ölçeğinde, HDX-MS verileri, daha uzun etiketleme sürelerinde kaybolan ve sonuçta amino asit seviyesine kadar yapısal çözünürlük sağlayan aSyn'in çözücü erişilebilirliği ve hidrojene bağlı yapısı hakkında bilgi içerir. Bu nedenle, HDX-MS, konformasyonel dinamikler ve termodinamik, moleküller arası ve moleküller arası etkileşimler ve mutasyonların veya değişikliklerin çevresel koşullara yapısal etkisi hakkında yüksek yapısal ve zamansal çözünürlüklerde bilgi sağlayabilir. Geniş çapta uygulanabilir olsa da, monomerik aSyn'de milisaniye HDX-MS ölçümlerinin nasıl elde edileceği, analiz edileceği ve yorumlanacağı gösterilmiştir.

İçsel olarak düzensiz doğası nedeniyle, fizyolojik pH'ta aSyn'deki karmaşık yapısal değişiklikleri yakalamak zordur. HDX-MS, omurga amid hidrojenlerindeki izotopik değişimi izler ve protein konformasyonel dinamiklerini ve etkileşimlerini araştırır. Bu bilgiyi yüksek yapısal ve zamansal çözünürlüklerde elde etmek için kullanılan birkaç teknikten biridir. Bu protokol, çok çeşitli proteinlere ve tampon koşullarına geniş çapta uygulanabilir ve bu, aSyn'in değişim kinetiğinin iki farklı ç...

Watch this Scientific Journal Video about Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions at JoVE.com

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Monomerik alfa-sinükleinin yapısal topluluğu fizyolojik fonksiyonunu ve fizikokimyasal özelliklerini etkiler. Mevcut protokol, fizyolojik koşullar altında bu içsel olarak düzensiz proteinin monomeri hakkında konformasyonel bilgileri belirlemek için milisaniye hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometrisinin ve müteakip veri analizlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Fizyolojik Koşullar Altında Alfa-Sinüklein Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Milisaniye Hidrojen / Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Tüm organizmaların proteomlarında bozukluk vardır,% 33'e kadar tahmin edilmektedirBu bölgeler hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometrisi ile gözlemlenebilir, ancak sadece milisaniye zaman aralığında. Protokolümüz size bunu nasıl başarılı bir şekilde yapacağınızı gösterecektir. Bu tam otomatik bir analitik tekniktir.Sadece her şeyi ayarlarsınız, istediğiniz zaman ölçümlerini programlayın, git ve uzaklaşın. Bu teknik, alfa-sinüklein gibi özünde düzensiz proteinlerin spesifik onaylarını stabilize eden bileşiklerin taranması için heyecan verici bir fırsat sunar. Peptit haritalaması için numune hazırlamaya başlamak için, önce eksi 80 santigrat derece dondurucudan depolanmış alfa-sinüklein protein stoğundan bir şişe alın.Çözüldükten sonra, 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Daha sonra, Beer-Lambert yasasını kullanarak protein konsantrasyonunu belirlemek için çözeltinin 218 nanometredeki emiciliğini ölçün ve proteini denge tamponu ile beş mikromolar'lık son konsantrasyona kadar seyreltin. Daha sonra, otomatik örnekleme robotunu kurmak için, toplam geri kazanım şişesine beş mikromolar protein çözeltisinden 50 mikrolitre ekleyin ve şişeyi, kütle spektrometresine uygun olarak hidrojen / döteryum değişiminin veya HDX, robotiğin sağ odasındaki numune konumuna yerleştirin.Daha sonra, sol odaların bir, dört ve beş reaktif pozisyonuna bir şişe denge tamponu ve iki şişe pepsin yıkama tamponu ve HDX sağ haznesinde bir reaktif pozisyonuna bir şişe söndürme tamponu koyun ve Peltier sıcaklık kontrol cihazını kullanarak sıcaklığı 20 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, sırasıyla HDX sol haznesinin ve HDX sağ haznesinin aynı reaksiyon pozisyonlarına eşit sayıda toplam geri kazanım şişesi ve maksimum geri kazanım şişesi ekleyin. Ardından, zamanlama yazılımında uygun LC ve MS yöntemleriyle bir örnek liste oluşturun ve zamanlamayı başlatın.Son peptid kapsama haritasını elde etmek için DynamX HDX veri analizi yazılımında izotopik atamaları manuel olarak düzenleyin. Fast HDX prototip cihazını temizledikten sonra, sistemi başlatmak için uyumlu HDX yazılımının grafik kullanıcı arabirimini açın. Numune odası ve söndürme odası sıcaklıkları olarak sırasıyla 20 santigrat derece ve 0,5 santigrat derece girin, ardından yeni sıcaklıkları uygulamak için ayarlanan tıklamayı tıklayın.Cihazı temizlemek ve hazırlamak için santrifüj tüplerini tüm girişlerde LC/MS sınıfı suyla ayarlayın, ardından titratör sıhhi tesisat dağıtım sekmesinde hem sol hem de sağ şırıngaları kontrol edin ve tüplerdeki tüm gizli hava kabarcıkları gidene kadar prime tıklamaya devam edin. Şırıngalar için tüm kutuları işaretlemek için, önce makrolar sekmesine gidin ve şırıngaların ev konumunu kalibre et'e tıklayın, ardından önce şırınga yük döngüsünü yıka, ardından tüm karıştırma döngüsü hacimlerini yıka. Bir tampon şırıngada herhangi bir kabarcık varsa, şırıngayı ayırın ve kabarcığı dikey olarak çıkararak gazını çözün.Sıfır konumuna yeniden kalibre etmeden önce, şırıngayı değiştirin. HDX deneyleri için Hızlı HDX prototip cihazını ayarlamak üzere önce sol titrasyon giriş tüpünü toplam geri kazanım şişesine takın. Sıcaklığa bağlı oligomerizasyonu ve kümelenmeyi önlemek için, tüpü bir masa üstü buzdolabına yerleştirin.Daha sonra, cihazın sağ ve sol odalarındaki ilgili tampon girişlerine 50 mililitre denge, etiketleme, söndürme ve pepsin yıkama tamponları ekleyin, ardından pepsin yıkama girişine 50 mililitre kolon yıkama tamponu ekleyin. Protein ve kolon yıkama hatlarını astarlamak için, titratör sıhhi tesisat dağıtım sekmesindeki sağ ve sol şırıngaları kontrol edin ve bir kez astar'a tıklayın. Daha önce gösterildiği gibi şırıngalar için tüm kutuları işaretledikten sonra, gerekli ayarları girmek için manuel söndürme akışı sekmesine gidin.Bir zaman kursu denemesinde, süreleri milisaniye cinsinden girmek için sembolik nokta düğmesini kullanın. Ardından tuzak süresini üçe ayarlayın ve HPLC'nin tuzak süresini artı çalışma süresini artı 1,5 dakika olarak bekleyin. Örnek çalıştırmalar arasında boş denemeler çalıştırılırsa, her örnek çalıştırmadan sonra boş çalıştırma için alma yazılımında bir girdi sağladıktan sonra boş çalıştır kutusuna tıklayın.Örnek liste hazır olduğunda ve uygun girişler vurgulandığında, yazılımda oynat ve Hızlı HDX'e tıklayarak çalıştırmayı başlatın. Veri işleme için, peptid haritalama deneylerinden spektral olarak atanmış peptitler dosyasının dosya menüsünü açın ve DynamX yazılımında aç'a tıklayın, ardından ham dosyaları DynamX yazılımına aktarın. Veri menüsünü açtıktan sonra, MS Files'a tıklayın.İncelenen her protein koşulu için durumlar oluşturmak üzere, yeni duruma tıklayın. Her HDX zaman noktasını eklemek için yeni pozlama'yı ve ardından yeni raw'u tıklayın. Ham dosyaları içe aktarmak için, her dosyayı doğru konuma sürükleyin ve bittiğinde Tamam'ı tıklatın.İzotopları otomatik olarak atadıktan sonra, yüksek veri kalitesi sağlamak için izotopik atamayı manuel olarak düzenleyin. Küme verilerini, makalede açıklandığı gibi sütun sırasına göre csv dosyasında dışa aktarın. Kütle ölçüm yazılımındaki veri menüsünü açın ve küme verilerini dışa aktar'a tıklayın.Veri analizi için, önce dışa aktarılan kümelenmiş verileri HDX analiz yazılımı HDfleX'e yükleyin. Tüm deneyler ve durumlar için deneysel verileri sığdırmak üzere, HDX reaksiyonu için gözlemlenen hız sabitlerini elde etmek üzere uygun geri değişim düzeltme yöntemlerini seçin. Ardından, HDfleX'te tercih edilen bir yöntemi kullanarak küresel bir anlamlılık eşiği hesaplayın ve karşılaştırılan eyaletler arasındaki önemli farklılıkları belirlemek için hibrit anlamlılık testi gerçekleştirin.Alfa-sinüklein üzerindeki haritalama deneyi, protein dizisinin% 100'ünü kapsayan ve ortalama 3.79 fazlalık ile bir peptid kapsama haritası oluşturdu. Dahası, bu protokol, alfa-sinükleinin farklı peptitleri için döteryum alım eğrilerinin üretilmesini sağladı ve bunlar daha sonra takılı ve geri değişim düzeltilmiş grafikler olarak ifade edildi. Alfa-sinükleindeki hidrojen / döteryum değişiminin çoğunun bir saniye içinde yapıldığı açıktı.Alfa-sinükleinin A ve B durumları arasındaki konformasyonel fark, hem peptit hem de amino asit seviyelerinde B durumu tarafından daha yüksek döteryum alımından da belirgindi. Böyle hassas bir teknik için, verileri karşılaştırırken sağlam istatistiksel anlamlılık testleri kullanmak önemlidir. Burada yazılımımız HDfleX'i kullandık.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Enterik Sinir Sistemi Alpha-sinüklein İçermelerin bir sonda ve Görüntü Analizi kullanarak Rotenone Oral İdaresi

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Ozmotik implantasyonu Pompalar ve Sistem izleyicilerin teslim fizyopatolojik Koşullarında Beyin Reorganizasyon Çalışması için

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel Aşılama sonrası Tranjenik Farelerde Nöroinflamasyondan Biyoparlaklık Görüntüleme

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...