Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

تم جمع بيانات مجمع S1PRs-Gi في مركز غرب الصين Cryo-EM في جامعة سيتشوان ومركز Cryo-EM في الجامعة الجنوبية للعلوم والتكنولوجيا (SUSTech) ومعالجتها في مركز Duyu للحوسبة عالية الأداء في جامعة سيتشوان. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (32100965 إلى L.C. ، 32100988 إلى W.Y. ، 31972916 إلى Z.S.) وصندوق أبحاث ما بعد الدكتوراه بدوام كامل من جامعة سيتشوان (2021SCU12003 إلى L.C.)

1. تنقية مركب البروتين S1PRs-G
<ol><li>لتنقية مركب البروتين S1PRs-G البشري ، قم باستنساخ cDNAs من S1PR1 التي تفتقر إلى بقايا C-terminal 338-382 ، والنوع البري S1PR3 ، و S1PR5 المبتور مع 345-398 في المحطة C ، والنوع البري Gi1 في ناقل pFastBac1 و cDNAs من النوع البري Gβ1 و Gγ2 في ناقل pFastBacdual (جدول المواد). ملاحظة: تحتو?...

يصف هذا البروتوكول خط أنابيب أساسي لتحديد هياكل S1PRs بواسطة cryo-EM وقياس فعالية تنشيط S1PRs بواسطة اختبار تثبيط cAMP بوساطة Gi. بعض الخطوات حاسمة لنجاح التجربة.
لتنقية مجمع S1PRs-Gi ، يجب إيلاء المزيد من الاهتمام لجودة الفيروس وصحة خلايا sf9 . يتم تقليل التعبير عن المستقبل بشكل كبير ف...

Sphingosine-1-phosphate (S1P) ، وهو منتج استقلابي من الدهون السفينغولية في غشاء الخلية ، هو جزيء إشارات ليسوفوسفاتيدي في كل مكان يتضمن أنشطة بيولوجية مختلفة ، بما في ذلك الاتجار بالخلايا الليمفاوية ، وتطور الأوعية الدموية ، والسلامة البطانية ، ومعدل ضربات القلب1،2،3. يمارس S1P آثاره الفسيولوجية المتنوعة من خلال خمسة أنواع فرعية من مستقبلات S1P (S1PRs 1-5) ؛ تم العثور على S1PRs في مجموعة متنوعة من الأنسجة وتظهر تفضيلات فريدة لبروتينات G المصب 4,5. يقترن S1PR1 في المقام الأول ببروتين Gi ، الذي يمنع لاحقا إنتاج cAMP ؛ يقترن S1PR2 و S1PR3 ب Gi و Gq و G12/13 ، و S1PR4 و S1PR5 ينقلان الإشارة من خلال Gi و G12/136.
تعد إشارات S1P-S1PR هدفا علاجيا حاسما لأمراض متعددة ، بما في ذلك اضطرابات المناعة الذاتية7 والالتهاب8 والسرطان9 وحتى COVID-1910. في عام 2010 ، تم ترخيص fingolimod (FTY720) كأول دواء في فئته يستهدف S1PRs لعلاج التصلب المتعدد الانتكاسي (MS)11. ومع ذلك ، فهو قادر على الارتباط بجميع S1PRs باستثناء S1PR2 ، في حين أن الارتباط غير المحدد ب S1PR3 يؤدي إلى وذمة القشرة الدماغية ، وانقباض الأوعية الدموية والشعب الهوائية ، والتسرب الظهاري الرئوي12. كاستراتيجية بديلة لزيادة الانتقائية العلاجية ، تم إنتاج روابط خاصة بالنوع الفرعي للمستقبلات. تمت الموافقة على Siponimod (BAF312) في عام 2019 لعلاج التصلب المتعدد الانتكاسي13 ؛ يستهدف بشكل فعال S1PR1 و S1PR5 ، في حين أنه ليس لديه تقارب مع S1PR3 ، مما يدل على آثار جانبية أقل في الممارسة السريرية14. في عام 2020 ، أذنت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ب ozanimod لعلاج مرض التصلب العصبي المتعدد15. وقد أفيد أن أوزانيمود يحمل انتقائية أكبر بمقدار 25 ضعفا ل S1PR1 مقارنة ب S1PR516. والجدير بالذكر أنه في سياق جائحة COVID-19 الحالية ، تم اكتشاف أن الأدوية الناهضة التي تستهدف S1PRs يمكن استخدامها لعلاج COVID-19 باستخدام تقنيات العلاج المناعي17. بالمقارنة مع فينجوليمود ، أظهر أوزانيمود تفوقا في خفض الأعراض لدى مرضى COVID-19 ويخضع الآن للتجارب السريرية10. إن فهم الأساس الهيكلي ووظيفة S1PRs يضع أساسا مهما لتطوير دواء يستهدف بشكل انتقائي S1PRs18.
تستخدم العديد من التقنيات للتحقيق في المعلومات الهيكلية للجزيئات الحيوية الكبيرة ، بما في ذلك علم البلورات بالأشعة السينية ، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، والمجهر الإلكتروني (EM). اعتبارا من مارس 2022 ، هناك أكثر من 180،000 هيكل مودع في بنك بيانات البروتين (PDB) ، وقد تم حل معظمها عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية. ومع ذلك ، مع أول بنية دقة شبه ذرية ل TPRV1 (دقة 3.4 Å) التي أبلغ عنها Yifan Cheng و David Julius في 201319 ، أصبح المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) تقنية سائدة لهياكل البروتين ، وكان العدد الإجمالي لهياكل EM PDB أكثر من 10000. تتمثل مجالات الاختراق الحاسمة في تطوير كاميرات جديدة للتصوير تعرف باسم كاميرات الكشف المباشر عن الإلكترونات وخوارزميات معالجة الصور الجديدة. أحدثت Cryo-EM ثورة في بيولوجيا البنية واكتشاف الأدوية القائمة على البنية في العقد الماضي20. نظرا لأن فهم كيفية قيام المجمعات الجزيئية الكبيرة بأدوارها المعقدة في الخلية الحية هو موضوع مركزي في العلوم البيولوجية ، فإن cryo-EM لديه القدرة على الكشف عن تكوينات المجمعات الجزيئية الديناميكية ، خاصة بالنسبة للبروتينات عبر الغشاء21. مستقبلات G-protein المقترنة (GPCRs) هي أكبر عائلة فائقة من البروتينات عبر الغشاء وأهداف أكثر من 30٪ من المستحضرات الصيدلانية المسوقة حاليا22. ساهم تطوير cryo-EM في انفجار الهياكل عالية الدقة لمجمعات بروتين GPCR-G ، مما مكن من التحديد الهيكلي للأهداف "المستعصية" التي لا تزال غير متاحة للتحليل البلوري بالأشعة السينية في تصميم الأدوية23. وبالتالي ، يوفر تطبيق cryo-EM فرصة لتحديد البنية ثلاثية الأبعاد ل GPCRs في ظروف قريبة من الأصل بالقرب من الدقة الذرية24. إن التقدم في مجال التبريد الكهرومغناطيسي يجعل من الممكن تصور الأسس الميكانيكية لتحفيز GPCR أو تثبيطه ، والاستفادة بشكل أكبر في الكشف عن مواقع الربط الجديدة لإنشاء الأدوية المستهدفة GPCR25.
بالاعتماد على الخطوات الهائلة لتقنية cryo-EM ، حددنا هياكل مجمعات إشارات S1PR1 و S1PR3 و S1PR5-Gi المؤلمة مؤخرا26,27. في البشر ، توجد S1PRs في أنسجة مختلفة وتظهر تفضيلات فريدة لبروتينات G 4,5 في المراحل النهائية. يقترن S1PR1 في المقام الأول ببروتين Gi ، الذي يمنع لاحقا إنتاج أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري 3 ′ ، 5 ′ (cAMP). S1PR3 و S1PR5 قادران أيضا على الاقتران مع Gi 6,28. نظرا لأن تنشيط مستقبلات Gi-pair يقلل من إنتاج cAMP29 ، فقد تم إدخال فحص cAMP لتثبيط Gi لقياس تأثيرات تثبيط cAMP لالتقاط التعديلات الوظيفية26,27. باستخدام نسخة متحولة من Photinus pyralis luciferase حيث تم إدخال بروتين ملزم ل cAMP ، يوفر فحص cAMP هذا طريقة بسيطة وموثوقة لمراقبة نشاط GPCR من خلال التغيرات في تركيز cAMPداخل الخلايا 30. وهو اختبار وظيفي حساس وغير مشع ويمكن تطبيقه لمراقبة الإشارات النهائية في الوقت الحقيقي لمجموعة واسعة من GPCRs لأغراض اكتشاف الأدوية31.
هنا ، يتم تقديم ملخص للطرق الحاسمة في حل طرق التنشيط والتعرف على الأدوية ل S1PRs ، بما في ذلك في المقام الأول التلاعب بالتبريد EM وفحص cAMP المثبط Gi. تهدف هذه المقالة إلى توفير إرشادات تجريبية شاملة لمزيد من الاستكشافات في هياكل ووظائف GPCRs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

الليزوفوسفاتيدات (LPLs) هي دهون نشطة بيولوجيا تشمل سفينغوزين 1-فوسفات (S1P) ، وحمض الليسوفوسفاتيديك ، إلخ. S1P ، وهو منتج استقلابي من الدهون السفينغولية في غشاء الخلية ، هو واحد من أفضل LPLs المميزة التي تنظم مجموعة متنوعة من الاستجابات الفسيولوجية الخلوية عبر مسارات الإشارات بوساطة مستقبلات سفينغوزين 1-فوسفات (S1PRs). هذا ينطوي على أن نظام إشارات S1P-S1PRs هو هدف علاجي محتمل ملحوظ للاضطرابات ، بما في ذلك التصلب المتعدد (MS) ، واضطرابات المناعة الذاتية ، والسرطان ، والالتهابات ، وحتى COVID-19. تتكون S1PRs ، وهي مجموعة فرعية صغيرة من عائلة مستقبلات البروتين المقترن من الفئة A G (GPCR) ، من خمسة أنواع فرعية: S1PR1 و S1PR2 و S1PR3 و S1PR4 و S1PR5. ومع ذلك ، فإن الافتقار إلى المعلومات الهيكلية التفصيلية يعوق اكتشاف الأدوية التي تستهدف S1PRs. هنا ، طبقنا طريقة المجهر الإلكتروني المبرد لحل بنية مجمع S1P-S1PRs ، وأوضحنا آلية التنشيط ، والتعرف الانتقائي على الأدوية ، واقتران بروتين G باستخدام الفحوصات الوظيفية القائمة على الخلايا. يمكن أيضا دراسة مستقبلات الليزوفوسفوليبيد الأخرى (LPLRs) و GPCRs باستخدام هذه الاستراتيجية.

قبل تجميد عينة مركب S1PRs-Gi ، يجب فصل العينة النقية بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) وتحليلها باستخدام كروماتوغرافيا ترشيح الهلام. يوضح الشكل 2 مجمع S1PR3-Gi كمثال. عادة ما كان الجزء الأقصى من مركب بروتين GPCR-G المتجانس يقع عند ~ 10.5 مل من كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (<strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

يمارس S1P آثاره الفسيولوجية المتنوعة من خلال الفصيلة الفرعية لمستقبلات S1P (S1PRs). هنا ، يتم وصف خط أنابيب لشرح هياكل ووظيفة S1PRs.

خط أنابيب للتحقيق في الهياكل ومسارات الإشارات لمستقبلات سفينغوزين 1-فوسفات

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

لقد تناولنا أمزجة التنشيط وإعادة حساب الدواء ل S1PRS من قبل الطاقم ، والتلاعب بالأسواق الناشئة وحالة GI INHAB A M P A والأساس الأقل أهمية لتطوير دواء يستهدف بقوة تطورات S1PRS في جعل من الممكن إظهار اللوحات السفلية المزيفة لتحفيز GP ZR أو السكن والمزيد من الفوائد في الكشف عن مواقع الربط الطبيعية لإنشاء الأدوية المستهدفة T BCR. جودة العينة هي الأساس لكل شيء في تجربة EM الصحيحة. العوامل الأساسية للتحضير البسيط تشمل حالة المنتج المختلفة لبيع خط SF وتركيز N g مما يدل على الإجراء سيكون Heli Wang طالب دراسات عليا من مستواي.لتحميل تنقية البروتين ، فإن مشهد الإصبع هذا واحد من مستقبلات الفوسفات أو S one P R S G محلول مركب للبروتين إلى كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو عمود ترشيح S E C هلام متوازن مسبقا مع المخزن المؤقت S E C بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة عند أربع درجات مئوية. لاستخدام الكسور المجمعة للمجهر الإلكتروني المبرد ، قم بتركيزها باستخدام مكثف قطع 100 كيلودالتون عند 1،300 XG عند أربع درجات مئوية. أثناء معالجة البيانات للتصنيف ثنائي الأبعاد في التصنيف الأولي للجسيمات، اختر وظيفة التصنيف ثنائي الأبعاد في برنامج الاعتماد على وانقر فوق استعراض على يمين ملف نجمة صور الإدخال في خيار IO.ثم اختر particles.star. بعد ذلك ، في خيار التحسين ، اضبط عدد الفئات على 100 وقطر القناع A على 140. في خيار الحساب، اضبط عدد الجسيمات المجمعة على 10 وأدخل الدليل من محرك أقراص محلي سريع وسريع في حقل نسخ الجسيمات إلى دليل الخدش.لمعالجة أسرع، حدد نعم لتسريع وحدة معالجة الرسومات المستخدمة. لاختيار مجموعة فرعية من نتائج 2D الجيدة كقوالب ، انتقل إلى خيار IO لوظيفة تحديد المجموعة الفرعية وانقر فوق تصفح إلى يمين فئات التحديد من model.star. بعد ذلك، اختر run_it025_model.نجمة كإدخال وانقر على تشغيل في النافذة المنبثقة تحقق من فرز الصور على وعكس الفرز. ثم انقر على الشاشة. بعد اختيار نتائج 2D تمثيلية جيدة كمرجع للرجوع إليها في وظيفة الانتقاء التلقائي ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد حفظ الفئات المحددة.لاستخدام القالب للجولة الثانية من الانتقاء التلقائي، انتقل إلى خيار IO لوظيفة الانتقاء التلقائي. انقر فوق استعراض على يسار الصور المجهرية للإدخال للانتقاء التلقائي، واختر micrographs.star. ثم انقر فوق تصفح على يمين مراجع 2D واختر class_averages.star.أيضا ، حدد لا ل أو استخدم leplossian في Gaussian. بعد ذلك ، قم بإجراء استخراج الجسيمات باستخدام لاحقة تسطير سفلي الحبل تسطير سفلي تلقائي pick.star. أداء تصنيف 2D باستخدام الجسيمات.النجمة، متبوعة بتحديد مجموعة فرعية باستخدام تسطير التشغيل تحت الصفر 20 five_optimizer. نجمة لاستخراج الجسيمات، بعد النقر فوق استعراض إلى يسار ملف نجمة المجهر في خيار IO، اختر الصور المجهرية. نجمة وحدد نعم ل أو إعادة استخراج الجسيمات المكررة.بعد النقر فوق استعراض على يمين ملف نجمة الجسيمات المكررة، حدد الجسيمات. نجمة لإنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد أولي وخريطة مرجعية ، انقر فوق تصفح النموذج الأولي ثلاثي الأبعاد على يمين ملف نجمة صور الإدخال في خيار IO واختر particles.star السابق. ثم في خيار التحسين ، اضبط عدد الفئات على واحد وقطر القناع A على 140.للتصنيف ثلاثي الأبعاد وإنشاء خريطة أولية ثلاثية الأبعاد ، بعد اختيار الجسيمات. نجمة كما هو موضح سابقا ، انقر فوق تصفح إلى يمين الخريطة المرجعية واختر نموذج تسطير سفلي أولي نقطة mrc. ثم، في خيار التحسين، اضبط عدد الفئات على أربعة إلى ستة وقطر القناع A على 140.لتوليد القناع ، بعد تحديد خريطة 3D جيدة كإدخال في خيار IO ، قم بتعيين عتبة الربط الأولية إلى 0.05 ، وتوسيع الخريطة الثنائية إلى هذا العدد الكبير من وحدات البكسل إلى ثلاثة. بعد ذلك ، انتقل إلى خيار القناع واضبطه. أضف حافة ناعمة إلى هذا العدد الكبير من وحدات البكسل إلى ثمانية.للمعالجة التالية ، افتح برنامج Trino Spark ، وقم بإنشاء مساحة عمل جديدة ، وانقر فوق منشئ الوظائف للوظيفة الأولى. لاستيراد مكدس الجسيمات، أدخل مسار الجسيمات في حقل مسار ميتا الجسيمات ومسار الأفلام في حقل مسار بيانات الجسيمات. بعد ذلك ، قم باستيراد وحدات تخزين ثلاثية الأبعاد عن طريق إدخال مسار أفضل وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد تم إنشاؤها من قبل في مسار بيانات وحدة التخزين ، وتحديد قناع لنوع وحدة التخزين التي يتم استيرادها.للصقل غير المنتظم، اسحب جسيمات التسطير السفلي المستوردة التي تم إنشاؤها مسبقا كمدخلات لجسيمات التكرير غير الموحدة. حجم التسطير المستورد ، تسطير واحد كمدخل حجم التكرير غير الموحد وقناع التسطير المستورد يسطر واحد كمدخل قناع تنقيحات غير موحدة. قناع. بعد ذلك ، انقر فوق Q لبدء المعالجة وكرر الإجراء للحصول على دقة جيدة.S1PRGI خريطة 3D. بعد بناء البلازميد وإعداده للنقل العابر ، أضف ميكروغرام من الحمض النووي المحضر إلى 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكاشف النقل. اخلطي المزيج عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان وقم بتدوير الخليط لفترة وجيزة قبل الاستخدام.أضف أربعة ميكرولترات من كاشف النقل واخلطه عن طريق الدوامة والغزل كما هو موضح سابقا. بعد احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، قم بإسقاط 200 ميكرولتر ببطء من مزيج النقل في كل بئر من صفيحة من ستة آبار تحتوي على خلية واحدة CHOK وهز اللوحة بلطف أو خلط شامل. بعد أربع إلى ست ساعات من الحضانة ، استبدل وسط النقل بوسط نمو الخلية المكون من F 12 medium و 10٪ fbs قبل إعادة اللوحة إلى الحاضنة.24 إلى 48 ساعة بعد حصاد التحويل للخلايا ، قم بتعليق الخلايا في ثلاثة ملليلترات من مخزن SA العازل مع ملح البوتاسيوم D luciferian. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 90 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة بئر 96 مختلطة بلطف واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. لتحديد إشارة التألق ، أولا ، قم بإعداد محاليل مخزون 10 ملليمولار من سيبونيمود في D M S O.ثم قم بإجراء تخفيف تسلسلي في المخزن المؤقت H B S S الذي يحتوي على 25 فورسكالين ميكرومولار وتحفيز الخلايا ب 10 ميكرولترات من تركيزات مختلفة من هذا المحلول الناهض لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك ، قم بحساب إشارة التلألؤ في قارئ microplate عن طريق تحديد التلألؤ لطريقة الكشف. نقطة النهاية لنوع القراءة، وألياف التلألؤ لنوع البصريات في البرنامج المقترن. أيضا ، اضبط مكاسب البصريات على 255.ثم قم باستيراد قيم إشارة التألق التي تم الحصول عليها إلى برنامج جدول بيانات ، وقم بمعالجة البيانات باستخدام وظيفة استجابة منحنى الانحدار غير الخطي لتناسب الجرعة. يمكن تنقية مجمع S1PRS GI بنجاح بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، والتي تم التحقق منها بواسطة صفحة SDS. علاوة على ذلك ، كان بروتوكول المجهر الإلكتروني المتبع في هذه الدراسة فعالا في التمييز بين جسيمات S1PRSGI ذات الفئات ثنائية الأبعاد الواضحة والمحددة جيدا والجسيمات ذات الجودة الرديئة.وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء خريطة مجهرية إلكترونية ل S1PR3 GI بدقة جيدة عن طريق ارتباط الغلاف الفروي من خلال الصقل غير المنتظم. بعد التحليل الهيكلي ، تم إجراء الفحوصات الوظيفية ل S one P R Three عن طريق نقل خلايا C H O K مع بلازميدات المستقبل والمستشعر ، والتي كشفت أن نسبة بلازميد المستقبل إلى بلازميد المستشعر من واحد إلى ثلاثة تنتج نتائج مثالية. ومع ذلك ، كانت النتائج أقل واقعية في خلايا هيك 2 93 في تلك المعالجة ، فإن اختيار الخوارزميات في قسم الجسيمات وقسم التصنيف 2D و 3D مهم لحل مجمعات البروتين MPS G خاصة لنمذجة التسريبات و ecfs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

محاكاة وظيفة من البروتينات اشارة: نحو الاصطناعي الإشارة العلاج تنبيغ

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

قياس إشارة مستقبلات G- البروتينات عبر الملزمة غتب المسمى راديو

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

تضيء سبل تفعيل Caspase استخدام التكامل Bimolecular Fluorescence

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

معايرة أليسا كأسلوب لتحديد ثابت تفكك مستقبلات يجند التفاعل

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

استخدام خط أنابيب MALDI TOF-MS IDBac المفتوح المصدر لتحليل البروتين الميكروبي وبيانات المستقلب المتخصصة

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

تحديد مستقبلات أوريكسين وإندوكانابينويد في أسماك حمار وحشي للبالغين باستخدام المناعية وطريقة الفلور المناعي

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

الفحص الاستراتيجي وتوصيف مجمع إشارات البروتين البصرية GPCR-mini-G للتبلور الناجح

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

فحص التسرب الفلوري للتحقيق في زعزعة استقرار الغشاء عن طريق الببتيد المخترق للخلايا

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

استخدام تحسين الفلورية المستحث بالبروتين الذي تم حله زمنيا لتحديد التركيبات المحلية المستقرة α-Synuclein Monomer في كل مرة

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...