Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
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S1PR-Gi复合物的数据在四川大学华西冷冻电镜中心和南方科技大学低温电镜中心采集，并在四川大学杜玉高性能计算中心进行处理。本研究由中国自然科学基金（32100965至LC.C.，32100988至W.Y.，31972916至Z.S.）和四川大学专职博士后研究基金（2021SCU12003至L.C.）资助。

1. S1PRs-G蛋白复合物的纯化
<ol><li>为了纯化人S1PRs-G蛋白复合物，将缺乏C端残基338-382的S1PR1的C1PR1的cDNA、在C末端用345-398截断的野生型S1PR5和野生型Gi1克隆到pFastBac1载体中，将野生型Gβ1和Gγ2的cDNA克隆到pFastBacdual载体中（材料表）。 注意：S1PR的所有构建体还包含血凝素（HA）信号序列，后跟N端的Flag表位标签和C端的10倍他的标签。此外，将用于翻译T4溶菌酶（T4L）的合成D...

该协议描述了通过冷冻电镜测定S1PR结构的主要管道，并通过Gi介导的cAMP抑制测定法测量S1PR的活化效力。一些步骤对实验的成功至关重要。
为了纯化S1PR-Gi复合物，病毒的质量和 sf9 细胞的健康应该更加关注。受体的表达在较差 的sf9 细胞中显着降低。通过测量 sf9 细胞的直径来评估其健康状况。健康的 sf9 细胞的直径约为15μm。S1PRs-Gi复合物的产量受?...

鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是细胞膜中鞘脂的代谢产物，是一种无处不在的溶血磷脂信号分子，涉及各种生物活性，包括淋巴细胞运输，血管发育，内皮完整性和心率1，2，3。S1P通过五种S1P受体亚型（S1PRs 1-5）发挥其多样化的生理作用;S1PR存在于各种组织中，对下游G蛋白表现出独特的偏好4，5。S1PR1主要与Gi蛋白偶联，随后抑制cAMP的产生;S1PR2 和 S1PR3 与 Gi、Gq 和 G12/13 耦合，S1PR4 和 S1PR5 通过 Gi 和 G12/136 转换信号。
S1P-S1PR信号传导是多种疾病的关键治疗靶点，包括自身免疫性疾病7，炎症8，癌症9，甚至COVID-1910。2010年，芬戈莫德（FTY720）被批准为靶向S1PR治疗复发性多发性硬化症（MS）11的同类药物。然而，它能够与除S1PR2以外的所有S1PR结合，而与S1PR3的非特异性结合导致大脑皮层水肿，血管和支气管收缩以及肺上皮渗漏12。作为增加治疗选择性的替代策略，已经产生了受体的亚型特异性配体。西波尼莫德（BAF312）于2019年被批准用于复发性MS治疗13;它有效地靶向S1PR1和S1PR5，而它对S1PR3没有亲和力，在临床实践中表现出较少的副作用14。2020年，美国食品和药物管理局授权奥扎尼莫特用于MS治疗15。据报道，臭氧莫德对S1PR1的选择性比S1PR516高25倍。值得注意的是，在当前COVID-19大流行的背景下，已经发现靶向S1PR的激动剂药物可以通过使用免疫调节治疗技术来治疗COVID-19 17。与芬戈莫德相比，奥扎尼莫德在降低COVID-19患者的症状方面显示出优越性，目前正在进行临床试验10。了解S1PR的结构基础和功能为开发选择性靶向S1PR18的药物奠定了重要基础。
许多技术用于研究生物大分子的结构信息，包括X射线晶体学，核磁共振（NMR）和电子显微镜（EM）。截至2022年3月，蛋白质数据库（PDB）上沉积了超过180，000个结构，其中大多数已通过X射线晶体学解析。然而，随着程轶凡和David Julius在2013年19日报道了TPRV1的第一个近原子分辨率结构（3.4 Å分辨率），冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为蛋白质结构的主流技术，EM PDB结构的总数超过10，000个。关键的突破领域是开发新的成像相机，称为直接电子检测相机和新的图像处理算法。在过去的十年中，冷冻电镜彻底改变了结构生物学和基于结构的药物发现20.由于了解大分子复合物如何在活细胞中履行其复杂的作用是生物科学的中心主题，冷冻电镜有可能揭示动态分子复合物的构象，特别是对于跨膜蛋白21。G蛋白偶联受体（GPCRs）是跨膜蛋白的最大超家族，也是目前上市药物中30%以上的靶标22。冷冻电镜的发展促成了GPCR-G蛋白复合物的高分辨率结构的爆发，从而能够确定药物设计23中X射线晶体学分析仍然无法获得的“难处理”靶标的结构。因此，冷冻电镜应用提供了在接近原子分辨率24的情况下确定近天然条件下GPCR三维结构的机会。冷冻电镜的进步使得可视化GPCR刺激或抑制的机制基础成为可能，并进一步有利于揭示GPCR靶向药物创造的新型结合位点25。
依靠冷冻电镜技术的巨大进步，我们最近确定了激动的S1PR1-，S1PR3-和S1PR5-Gi信号复合物的结构26，27。在人类中，S1PR存在于各种组织中，对下游G蛋白表现出独特的偏好4，5。S1PR1主要与Gi蛋白偶联，随后抑制3'，5'-环磷酸腺苷（cAMP）的产生。S1PR3 和 S1PR5 也能够与 Gi6，28 耦合。由于Gi偶联受体激活降低了cAMP29的产生，因此引入了Gi抑制cAMP测定法来测量捕获功能改变26，27的cAMP抑制作用。使用萤 火虫 荧光素酶的突变版本，其中插入了cAMP结合蛋白部分，该cAMP测定提供了一种简单可靠的方法，用于通过细胞内cAMP浓度30的变化来监测GPCR活性。它是一种灵敏的非放射性功能测定，可用于监测各种GPCR的实时下游信号传导，用于药物发现目的31.
这里总结了解决S1PR的活化和药物识别模式的关键方法，主要包括冷冻电镜操作和Gi抑制cAMP测定。本文旨在为进一步探索GPCR的结构和功能提供全面的实验指导。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

溶血磷脂（LPL）是生物活性脂质，包括鞘氨醇1-磷酸（S1P），溶血磷脂酸等。S1P是细胞膜中鞘脂的代谢产物，是表征最好的LPL之一， 通过 鞘氨醇1-磷酸受体（S1PRs）介导的信号通路调节各种细胞生理反应。这意味着S1P-S1PR信号系统是疾病（包括多发性硬化症（MS），自身免疫性疾病，癌症，炎症甚至COVID-19）的显着潜在治疗靶点。S1PR是A类G蛋白偶联受体（GPCR）家族的一小部分，由五种亚型组成：S1PR1，S1PR2，S1PR3，S1PR4和S1PR5。然而，缺乏详细的结构信息阻碍了靶向S1PR的药物发现。在这里，我们应用冷冻电子显微镜方法求解了S1P-S1PR复合物的结构，并利用基于细胞的功能测定阐明了活化，选择性药物识别和G蛋白偶联的机制。其他溶酶磷脂受体（LPLR）和GPCR也可以使用这种策略进行研究。

在冷冻S1PRs-Gi复合物的样品之前，需要通过尺寸排阻色谱（SEC）分离纯化的样品，并用凝胶过滤色谱进行分析。 图2 显示了以S1PR3-Gi复合物为例。均相GPCR-G蛋白复合物的峰分数通常位于大小排阻色谱的~10.5mL（图2A）。S1PR3-Gi配合物的SDS页面分析（图2B）揭示了对应于S1PR3，Gαi，Gβ和scFv16的理论条带的四个条带，因此表明该配...

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A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P通过S1P受体（S1PRs）亚家族发挥其多样化的生理作用。这里描述了一个管道来阐述S1PR的结构和功能。

研究鞘氨醇1-磷酸受体结构和信号通路的管道

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

我们解决了船员对S1PRS的激活和药物重新计算情绪，EM操作和GI在HAB状态A M P A以及开发牢固针对S1PRS的药物的不太重要的基础进展，使得可以病毒化GP ZR刺激或居住的放大底漆，以及揭示T BCR靶向药物创造的正常结合位点的进一步益处。样品的质量是一切的基础 在正确的电镜实验中。简单制备的基本因素包括顺丰生产线销售的各种产品状态和N g浓度 演示该程序的将是我水平的研究生王合力。对于蛋白质纯化，将此手指场景一磷酸受体或S one P R S G蛋白质复合物溶液加载到尺寸排阻色谱或S E C凝胶过滤柱中，在4摄氏度下以每分钟0.5毫升的流速预平衡。要将收集的馏分用于冷冻电子显微镜，请使用100千道尔顿截止浓度器在1， 300 XG和4摄氏度下浓缩它们。在粒子初步分类的二维分类数据处理过程中，选择Reliance On软件中的二维分类功能，然后单击IO选项中输入图像星形文件右侧的浏览。然后选择粒子.star。接下来，在优化选项中，将类数设置为 100，将掩码直径 A 设置为 140。在计算选项中，将池化粒子的数量设置为 10，然后在将粒子复制到暂存目录字段中输入来自快速、快速本地驱动器的目录。为了加快处理速度，请为使用的 GPU 加速选择“是”。对于良好 2D 结果作为模板的子集选择，请转到子集选择功能的 IO 选项，然后单击从 model.star 中选择类右侧的浏览。接下来，选择run_it025_model。星号作为输入，然后单击弹出窗口中的运行，选中对图像进行排序和反向排序。然后点击显示。选择具有代表性的良好二维结果作为自动拾取功能的参考后，右键单击并选择保存所选类。要将模板用于第二轮自动拣选，请转到自动拣选功能的IO选项。单击输入显微照片右侧的浏览以进行自动选取，然后选择显微照片.star。然后单击 2D 参考右侧的浏览并选择 class_averages.star。此外，在高斯中选择 no 或使用 leplossian。接下来，使用绳索下划线后缀下划线自动拾取.star执行粒子提取。使用粒子执行 2D 分类。星号，然后使用运行下划线 20 five_optimizer进行子集选择。星星 对于粒子提取，在 IO 选项中单击显微照片星形文件右侧的浏览后，选择显微照片。星标并选择“是”或重新提取精炼颗粒。单击优化粒子星形文件右侧的浏览后，选择粒子。星形 要生成初始 3D 模型和参考地图，请单击 IO 选项中输入图像星形文件右侧的 3D 初始模型浏览，然后选择上一个 Particles.star。然后在优化选项中，将类数设置为 1，将掩码直径 A 设置为 140。用于 3D 分类并在选择粒子后生成初步 3D 地图。星形 如前所述，单击参考地图右侧的浏览，然后选择初始下划线模型点 MRC。然后，在优化选项中，将类数设置为 4 到 6，将掩码直径 A 设置为 140。对于掩码生成，在 IO 选项中选择良好的 3D 贴图作为输入后，将初始二值化阈值设置为 0.05，并将二进制贴图扩展到此多个像素设置为 3。接下来，转到掩码选项并设置。将柔和边缘添加到这许多像素到 8 个。对于下一个处理，打开Trino Spark软件，创建一个新的工作区，然后单击第一个作业的作业生成器。要导入粒子堆栈，请在粒子元路径字段中输入粒子路径，在粒子数据路径字段中输入电影路径。接下来，通过在体积数据路径中输入之前生成的最佳 3D 体积的路径，并为要导入的卷类型选择掩码来导入 3D 体积。对于非均匀细化，将先前生成的导入下划线粒子拖动为非均匀细化粒子粒子的输入。导入下划线体积，下划线 1 作为非均匀细化体积的输入，导入下划线掩码下划线 1 作为非均匀细化掩码的输入。面具。接下来，单击 Q 开始处理并重复该过程以获得良好的分辨率。S1PRGI 3D 地图。质粒构建和瞬时转染制备后，将2微克制备好的DNA加入200微升转染试剂缓冲液中。通过涡旋 10 秒钟并在使用前短暂旋转混合物来混合。加入四微升转染试剂，如前所述通过涡旋和旋转进行混合。将试管在室温下孵育15分钟后，将200微升转染混合物缓慢滴入含有CHOK 1细胞的六孔板的每个孔中，轻轻摇动板或彻底混合。孵育4至6小时后，将转染培养基替换为由F 12培养基和10%fbs组成的细胞生长培养基，然后将板送回培养箱。细胞横断收获后24至48小时，将细胞悬浮在三毫升含有D荧光法钾盐的SA缓冲液中。然后使用多通道移液器，将90微升细胞悬液加入到轻轻混合的96孔板的每个孔中，并在室温下孵育40分钟。对于荧光信号测定，首先，在D M S O中制备辛波莫德的10毫摩尔储备溶液，然后在含有25微摩尔福斯卡林的H B S S缓冲液中进行连续稀释，并用10微升各种浓度的该激动剂溶液刺激细胞30分钟。接下来，通过选择发光作为检测方法来计数酶标仪中的发光信号。相关软件中读取类型的端点和光学类型的发光光纤。此外，将光学增益设置为 255。然后将获得的荧光信号值导入电子表格程序，并使用非线性回归曲线拟合剂量响应函数处理数据。S1PRS GI复合物可通过体积排阻色谱法成功纯化，并通过SDS页面验证。此外，本研究中遵循的电子显微镜方案可有效区分具有清晰且定义明确的2D类别的S1PRSGI颗粒和质量差的颗粒。此外，通过非均匀细化，通过毛皮壳相关性可以生成具有良好分辨率的S1PR3 GI电子显微镜图。结构分析后，通过用受体和传感器质粒转染C H O K 一细胞进行S one P R 3的功能测定，结果表明受体质粒与传感器质粒的比例为1-3，可产生最佳结果。然而，在 2 93 个细胞中的结果不太现实 在该过程中，颗粒部分以及 2D 和 3D 分类部分中算法的选择对于解决 so MPS G 蛋白复合物非常重要，尤其是对于泄漏和 ECFS 建模。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

模拟信号蛋白的功能：走向人工信号转导疗法

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

科研

生物化学

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

通过放射性标记的GTP结合测量G蛋白偶联的受体信号

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

利用分子荧光互补的方法照亮 Caspase 活化的途径

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

滴定 ELISA 法测定受体配体相互作用的离解常数

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

使用开源 MALDI TOF-MS IDBac 管道分析微生物蛋白和专用代谢物数据

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

使用免疫过氧化物酶和免疫荧光方法鉴定成年斑马鱼中的奥列辛和内他大麻素受体

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

视觉GPCR-迷你G蛋白信号复合物的战略筛选与表征，成功结晶

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

荧光泄漏测定研究细胞穿透肽对膜的破坏稳定性

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 光束线微晶样品制备管道

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

利用时间分辨蛋白诱导的荧光增强来鉴定稳定的局部构象，一次一α-突触核蛋白单体

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...