Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

Dataene fra S1PRs-Gi-komplekset blev høstet på West China Cryo-EM Center i Sichuan University og Cryo-EM Center ved Southern University of Science and Technology (SUSTech) og behandlet på Duyu High-Performance Computing Center i Sichuan University. Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation of China (32100965 til L.C., 32100988 til W.Y., 31972916 til ZS) og fuldtids postdoc-forskningsfond ved Sichuan University (2021SCU12003 til L.C.)

1. Oprensning af S1PRs-G proteinkompleks
<ol><li>For at rense det humane S1PRs-G-proteinkompleks klones cDNA'erne for S1PR1, der mangler C-terminale rester 338-382, vildtypen S1PR3, S1PR5 afkortet med 345-398 ved C-endestation, og vildtype Gi1 i pFastBac1-vektoren og cDNA'erne for vildtype Gβ1 og Gγ2 i pFastBacdual-vektoren (Materialetabel). BEMÆRK: Alle konstruktioner til S1PR'er indeholder også hæmagglutinin (HA) signalsekvens efterfulgt af et Flag epitope tag ved N-terminale...

Denne protokol beskriver en primær rørledning til bestemmelse af strukturerne af S1PR'er ved kryo-EM og måling af aktiveringsstyrken af S1PR'er ved Gi-medieret cAMP-hæmningsassay. Nogle trin er afgørende for eksperimentets succes.
For at rense S1PRs-Gi-komplekset bør virusets kvalitet og sf9-cellernes sundhed lægges større vægt på. Ekspressionen af receptoren reduceres dramatisk i dårlige sf9-celler . Sf9-cellernes sundhed blev vurderet ved at måle deres ...

Sphingosin-1-phosphat (S1P), et metabolisk produkt af sphingolipider i cellemembranen, er et allestedsnærværende lysophosphatid signalmolekyle, der involverer forskellige biologiske aktiviteter, herunder lymfocythandel, vaskulær udvikling, endotelintegritet og puls 1,2,3. S1P udøver sine forskellige fysiologiske virkninger gennem fem S1P-receptorundertyper (S1PR'er 1-5); S1PR'er findes i en række væv og udviser unikke præferencer for downstream G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært koblet med Gi-proteinet, som efterfølgende hæmmer cAMP-produktionen; S1PR2 og S1PR3 er koblet med Gi, Gq og G12/13, og S1PR4 og S1PR5 transduce signal gennem Gi og G12/136.
S1P-S1PR-signalering er et kritisk terapeutisk mål for flere sygdomme, herunder autoimmune lidelser7, betændelse8, kræft9 og endda COVID-1910. I 2010 blev fingolimod (FTY720) licenseret som et førsteklasses lægemiddel rettet mod S1PR'er til behandling af tilbagefald multipel sklerose (MS)11. Det er imidlertid i stand til at binde til alle S1PR'er undtagen S1PR2, mens uspecifik binding til S1PR3 resulterer i ødem i hjernebarken, vaskulær og bronchial indsnævring og lungeepitellækage12. Som en alternativ strategi til at øge terapeutisk selektivitet er subtypespecifikke ligander til receptoren blevet produceret. Siponimod (BAF312) blev godkendt i 2019 til behandling med tilbagefald af MS13; det er effektivt rettet mod S1PR1 og S1PR5, mens det ikke har nogen affinitet for S1PR3 og udviser færre bivirkninger i klinisk praksis14. I 2020 godkendte den amerikanske Food and Drug Administration ozanimod til MS-terapi15. Det er blevet rapporteret, at ozanimod har en 25 gange større selektivitet for S1PR1 end for S1PR516. Især i forbindelse med den nuværende COVID-19-pandemi er det blevet opdaget, at agonistlægemidler rettet mod S1PR'er kan bruges til behandling af COVID-19 ved hjælp af immunmodulerende terapiteknikker17. I sammenligning med fingolimod har ozanimod vist overlegenhed med hensyn til at sænke symptomer hos COVID-19-patienter og gennemgår nu kliniske forsøg10. Forståelse af det strukturelle grundlag og funktionen af S1PR'er lægger et væsentligt fundament for at udvikle et lægemiddel, der selektivt er målrettet mod S1PR'er18.
Mange teknikker bruges til at undersøge de strukturelle oplysninger om biomacromolecules, herunder røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans (NMR) og elektronmikroskopi (EM). Fra marts 2022 er der mere end 180.000 strukturer deponeret på Protein Databank (PDB), og de fleste af dem er blevet løst ved røntgenkrystallografi. Men med den første næsten-atomare opløsningsstruktur af TPRV1 (3.4 Å-opløsning) rapporteret af Yifan Cheng og David Julius i 201319 er kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) blevet en almindelig teknik til proteinstrukturer, og det samlede antal EM PDB-strukturer var mere end 10.000. De kritiske gennembrudsområder er udviklingen af nye kameraer til billeddannelse kendt som direkte elektrondetekteringskameraer og nye billedbehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolutioneret strukturbiologi og strukturbaseret lægemiddelopdagelse i det sidste årti20. Da forståelse af, hvordan makromolekylære komplekser opfylder deres komplicerede roller i den levende celle, er et centralt tema i biologiske videnskaber, har cryo-EM potentialet til at afsløre konformationer af dynamiske molekylære komplekser, især for transmembranproteiner21. G-protein koblede receptorer (GPCR'er) er den største superfamilie af transmembranproteiner og målene for mere end 30% af de aktuelt markedsførte lægemidler22. Udviklingen af cryo-EM har bidraget til et udbrud af højopløsningsstrukturer af GPCR-G-proteinkomplekser, hvilket muliggør strukturel bestemmelse for 'uhåndterlige' mål, der stadig ikke er tilgængelige for røntgenkrystallografisk analyse i lægemiddeldesign23. Derfor giver cryo-EM-applikationen en chance for at bestemme den tredimensionelle struktur af GPCR'er under næsten indfødte forhold ved tæt på atomopløsning24. Fremskridt inden for cryo-EM gør det muligt at visualisere mekanistiske underlag for GPCR-stimulering eller -hæmning og yderligere fordele ved at afdække de nye bindingssteder for GPCR-målrettet lægemiddelskabelse25.
Baseret på de enorme fremskridt inden for cryo-EM-teknologi har vi identificeret strukturer af forpinte S1PR1-, S1PR3- og S1PR5-Gi-signalkomplekser for nylig26,27. Hos mennesker findes S1PR'er i forskellige væv og udviser unikke præferencer for downstream G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært kombineret med Gi-proteinet, som efterfølgende hæmmer produktionen af 3′,5′-cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP). S1PR3 og S1PR5 er også i stand til at koble med Gi 6,28. Da Gi-koblet receptoraktivering nedsætter produktionen af cAMP29, blev der introduceret et Gi-hæmning cAMP-assay til måling af cAMP-hæmningseffekter til indfangning af funktionelle ændringer26,27. Ved hjælp af en mutant version af Photinus pyralis luciferase, hvor en cAMP-bindende proteindel er indsat, tilbyder dette cAMP-assay en enkel og pålidelig metode til overvågning af GPCR-aktivitet gennem ændringer i intracellulær cAMP-koncentration30. Det er et følsomt og ikke-radioaktivt funktionelt assay og kan anvendes til at overvåge realtids downstream-signalering af en lang række GPCR'er til lægemiddelopdagelsesformål31.
Her gives et resumé af de kritiske metoder til løsning af aktiverings- og lægemiddelgenkendelsesmetoderne for S1PR'er, primært inklusive kryo-EM-manipulationer og et Gi-hæmnings-cAMP-assay. Denne artikel har til formål at give omfattende eksperimentel vejledning til yderligere udforskninger af GPCR'ernes strukturer og funktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

Lysophospholipider (LPL'er) er bioaktive lipider, der inkluderer sphingosin-1-phosphat (S1P), lysophosphatidinsyre osv. S1P, et metabolisk produkt af sphingolipider i cellemembranen, er en af de bedst karakteriserede LPL'er, der regulerer en række cellulære fysiologiske reaktioner via signalveje medieret af sphingosin-1-phosphatreceptorer (S1PR'er). Dette implicerede, at S1P-S1PRs signalsystem er et bemærkelsesværdigt potentielt terapeutisk mål for lidelser, herunder multipel sklerose (MS), autoimmune lidelser, kræft, betændelse og endda COVID-19. S1PR'er, en lille delmængde af klasse A G-proteinkoblet receptor (GPCR) familien, består af fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 og S1PR5. Manglen på detaljerede strukturelle oplysninger hindrer imidlertid lægemiddelopdagelsen rettet mod S1PR'er. Her anvendte vi kryo-elektronmikroskopimetoden til at løse strukturen af S1P-S1PRs-komplekset og belyste mekanismen for aktivering, selektiv lægemiddelgenkendelse og G-proteinkobling ved hjælp af cellebaserede funktionelle assays. Andre lysophospholipidreceptorer (LPLR'er) og GPCR'er kan også undersøges ved hjælp af denne strategi.

Før frysning af prøven af S1PRs-Gi-komplekset skal den rensede prøve adskilles ved størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og analyseres med gelfiltreringskromatografi. Figur 2 viser S1PR3-Gi-komplekset som et eksempel. Topfraktionen af det homogene GPCR-G-proteinkompleks var sædvanligvis placeret ved ~ 10,5 ml af størrelsesekskluderingskromatografien (figur 2A). SDS-sideanalyse af S1PR3-Gi-komplekset (figur 2B) afslører fi...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P udøver sine forskellige fysiologiske virkninger gennem S1P-receptorer (S1PRs) underfamilien. Her beskrives en rørledning for at forklare strukturerne og funktionen af S1PR'er.

En rørledning til undersøgelse af strukturer og signalveje for sphingosin-1-phosphatreceptorer

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Vi behandlede aktiverings- og lægemiddelberegningsstemningerne i S1PRS af besætning, EM-manipulationer og GI-inhab-tilstand A M P A og mindre signifikant grundlag for at udvikle et lægemiddel, der solidt målretter S1PRS-fremskridt i gør det muligt at virulere magnistiske undermalinger af GP ZR-stimulering eller beboelse og yderligere fordele ved at afdække de normale bindingssteder for T BCR-målrettet lægemiddeldannelse. Kvaliteten af prøven er grundlaget for alt I det korrekte EM-eksperiment. De væsentlige faktorer for simpel forberedelse inkluderer forskellige produkttilstande for SF-linjesalg og en N g-koncentration Demonstration af proceduren vil være Heli Wang, en kandidatstuderende fra mit niveau.Til proteinrensning indlæses denne fingerscene en fosfatreceptorer eller S en P R S G proteinkompleks opløsning til en størrelsesekskluderingskromatografi eller S E C gelfiltreringskolonne forækvilibreret med S E C-buffer ved en strømningshastighed på 0,5 ml pr. Minut ved fire grader Celsius. For at bruge de indsamlede fraktioner til kryoelektronmikroskopi koncentreres dem ved hjælp af en 100 kilodalton cutoff koncentrator ved 1.300 XG ved fire grader Celsius. Under databehandling til 2D-klassificering i den foreløbige klassificering af partikler skal du vælge 2D-klassificeringsfunktionen i Rely On-softwaren og klikke på gennemse til højre for inputbilledernes stjernefil i IO-indstillingen.Vælg derefter particles.star. Derefter skal du i optimeringsindstillingen indstille antallet af klasser til 100 og maskediameteren A til 140. I beregningsindstillingen skal du indstille antallet af samlede partikler til 10 og indtaste mappen fra et hurtigt, hurtigt lokalt drev i kopipartiklen til ridsemappefeltet.For hurtigere behandling skal du vælge ja til brugt GPU-acceleration. For delmængdevalg af gode 2D-resultater som skabeloner, gå til IO-indstillingen for delmængdevalgsfunktion og klik på gennemse til højre for udvalgte klasser fra model.star. Vælg derefter run_it025_model.stjerne som input og klik på kør i pop op-vinduet kontroller sorter billeder på og omvendt sortering. Klik derefter på display. Når du har valgt gode repræsentative 2D-resultater som reference til reference for auto-picking-funktionen, skal du højreklikke og vælge Gem valgte klasser.For at bruge skabelonen til den anden runde af automatisk plukning skal du gå til IO-indstillingen for automatisk plukningsfunktion. Klik på Gennemse til højre for inputmikrografer for automatisk valg, og vælg micrographs.star. Klik derefter på gennemse til højre for 2D-referencer, og vælg class_averages.star.Vælg også nej for eller brug leplossian i af Gaussian. Udfør derefter partikelekstraktion ved hjælp af ledningsunderstregningssuffikset understregning auto pick.star. Udfør 2D-klassificering ved hjælp af partikler.stjerne, efterfulgt af delmængdevalg ved hjælp af kør understreg det nul 20 five_optimizer. stjerne For partikelekstraktion skal du vælge mikrografer, når du har klikket på Gennemse til højre for mikrografstjernefilen i IO-indstillingen. stjerne og vælg ja for eller genudtræk raffinerede partikler.Når du har klikket på gennemse til højre for den raffinerede partikelstjernefil, skal du vælge partikler. stjerne for at generere en indledende 3D-model og et referencekort, klik på gennemse 3D-startmodellen til højre for inputbilledernes stjernefil i IO-indstillingen og vælg den forrige particles.star. Indstil derefter antallet af klasser til en og maskediameteren A til 140 i optimeringsindstillingen.Til 3D-klassificering og generering af et foreløbigt 3D-kort efter valg af partikler. stjerne Som demonstreret tidligere skal du klikke på Gennemse til højre for referencekortet og vælge Initial Underunderlines Model Dot Mrc. Indstil derefter antallet af klasser til fire til seks og maskediameteren A til 140 i optimeringsindstillingen.For maskegenerering, efter at have valgt et godt 3D-kort som input i IO-indstillingen, skal du indstille den oprindelige binariseringstærskel til 0,05 og udvide binært kort til så mange pixels til tre. Gå derefter til maskeindstillingen og indstil. Tilføj blød kant til så mange pixels til otte.For den næste behandling skal du åbne Trino Spark-softwaren, oprette et nyt arbejdsområde og klikke på jobbygger for det første job. Hvis du vil importere partikelstakken, skal du angive partikelstien i feltet partikelmetasti og filmstien i feltet partikeldatasti. Importer derefter 3D-diskenheder ved at angive stien til den bedste 3D-diskenhed, der er genereret før i volumendatastien, og vælge maske for den type diskenhed, der importeres.For ikke-ensartet raffinement skal du trække de tidligere genererede importerede understregningspartikler som input af ikke-ensartede raffinementspartikler. Importeret understregningsvolumen, understreg en som input af ikke-ensartet forfiningsvolumenvolumen og importeret understregningsmaske understreger en som input af ikke-ensartet raffinementsmaske. Maske. Klik derefter på Q for at starte behandlingen og gentage proceduren for at opnå en god opløsning.S1PRGI 3D-kort. Efter plasmidkonstruktion og forberedelse til forbigående transfektion tilsættes to mikrogram forberedt DNA i 200 mikroliter transfektionsreagensbuffer. Bland ved hvirveldannelse i 10 sekunder og spinding af blandingen kort før brug.Tilsæt fire mikroliter transfektionsreagens og bland det ved hvirvlning og spinding som tidligere demonstreret. Efter inkubation af røret ved stuetemperatur i 15 minutter skal du langsomt droppe 200 mikroliter af transfektionsblandingen i hver brønd i en seks brøndplade indeholdende CHOK en celle og forsigtigt ryste pladen eller grundig blanding. Efter fire til seks timers inkubation udskiftes transfektionsmediet med cellevækstmediet bestående af F 12 medium og 10% fbs, før pladen returneres til inkubatoren.24 til 48 timer efter transektionshøst af cellerne suspenderes cellerne i tre milliliter af en SA-buffer med D luciferian kaliumsalt. Brug derefter en flerkanalspipette til at tilføje 90 mikroliter cellesuspension til hver brønd i en 96 brøndplade blandet forsigtigt og inkuberes ved stuetemperatur i 40 minutter. Til bestemmelse af fluorescenssignal fremstilles først 10 millimolære stamopløsninger af siponimod i D M S O.Derefter foretages en seriel fortynding i h b s s buffer indeholdende 25 mikromolær forskalin og stimulere cellerne med 10 mikroliter forskellige koncentrationer af denne agonistopløsning i 30 minutter.Tæl derefter luminescenssignalet i en mikropladelæser ved at vælge luminescens til detektionsmetode. Slutpunkt for læsetype og luminescensfiber for optiktype i den tilhørende software. Indstil også optikforstærkningen til 255.Importer derefter de opnåede fluorescenssignalværdier til et regnearksprogram, og behandl dataene ved hjælp af den ikke-lineære regressionskurve, der passer til dosisresponsfunktionen. S1PRS GI-komplekset kunne med succes renses ved størrelsesekskluderingskromatografi, som blev verificeret af SDS-siden. Desuden var elektronmikroskopiprotokollen, der blev fulgt i denne undersøgelse, effektiv til at skelne mellem S1PRSGI-partikler med klare og veldefinerede 2D-klasser og partikler af dårlig kvalitet.Desuden kunne et elektronmikroskopikort over S1PR3 GI med en god opløsning genereres ved furrier shell-korrelation gennem ikke-ensartet raffinement. Efter strukturel analyse blev funktionelle assays for S one P R tre udført ved transfektion af C H O K en celler med receptor- og sensorplasmider, hvilket afslørede, at receptorplasmid til sensorplasmidforhold på en til tre giver optimale resultater. Resultaterne var dog mindre realistiske i pokker 2 93 celler I den behandling er valget af algoritmer i partikelsektionen og sektionen af 2D- og 3D-klassificering vigtig for at løse de så MPS G-proteinkomplekser, især til modellering af lækager og ecfs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Efterligning af funktion signalproteiner: Mod Artificial Signal transduktion Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling af G-proteinkoblet receptorreceptor via radio-mærket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Belysning op veje til Caspase aktivering ved hjælp af Bimolecular fluorescens komplementering

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som en metode til at bestemme dissociationskonstant Receptor Ligand interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Brug af open source-MALDI TOF-MS IDBac-rørledningen til analyse af mikrobiel protein og specialiserede metabolit data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifikation af orexin og Endocannabinoide receptorer hos voksne zebrafisk ved hjælp af Immunoperoxidase og immunofluorescens metoder

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering af Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Fluorescerende lækage assay til at undersøge membranen destabilisering af Cell-gennemtrængende peptid

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Udnyttelse af tidsforelt protein-induceret fluorescensforbedring til at identificere stabile lokale konformationer En α-Synuclein Monomer ad gangen

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...