Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

De gegevens van het S1PR-Gi-complex werden geoogst in het West China Cryo-EM Center in Sichuan University en Cryo-EM Center in de Southern University of Science and Technology (SUSTech) en verwerkt in het Duyu High-Performance Computing Center in Sichuan University. Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation of China (32100965 tot L.C., 32100988 tot W.Y., 31972916 tot Z.S.) en het fulltime Postdoctoraal Onderzoeksfonds van Sichuan University (2021SCU12003 tot L.C.)

1. Zuivering van het S1PR-G eiwitcomplex
<ol><li>Om het menselijke S1PRRs-G-eiwitcomplex te zuiveren, kloont u de cDA's van S1PR1 zonder C-terminale residuen 338-382, de wild-type S1PR3, S1PR5 afgekapt met 345-398 bij C-terminus, en de wild-type Gi1 in de pFastBac1-vector en de cDNA's van het wildtype Gβ1 en Gγ2 in de pFastBacdual-vector (Materiaaltabel). OPMERKING: Alle constructen voor S1PR's bevatten ook de hemagglutinine (HA) signaalsequentie gevolgd door een Flag epitoop tag ...

Dit protocol beschrijft een primaire pijplijn voor het bepalen van de structuren van S1PR's door cryo-EM en het meten van de activeringspotentie van S1PR's door Gi-gemedieerde cAMP-remmingstest. Sommige stappen zijn cruciaal voor het succes van het experiment.
Om het S1PR-Gi-complex te zuiveren, moet meer aandacht worden besteed aan de kwaliteit van het virus en de gezondheid van sf9-cellen . De expressie van de receptor is dramatisch verminderd in arme sf9-cellen . De gezond...

Sfingosine-1-fosfaat (S1P), een metabolisch product van sfingolipiden in het celmembraan, is een alomtegenwoordig lysofosfatidisch signaalmolecuul dat verschillende biologische activiteiten omvat, waaronder lymfocytenhandel, vasculaire ontwikkeling, endotheelintegriteit en hartslag 1,2,3. S1P oefent zijn diverse fysiologische effecten uit via vijf S1P-receptorsubtypen (S1PR's 1-5); S1PR's worden aangetroffen in een verscheidenheid aan weefsels en vertonen unieke voorkeuren voor downstream G-eiwitten 4,5. S1PR1 is voornamelijk gekoppeld aan het Gi-eiwit, dat vervolgens de cAMP-productie remt; S1PR2 en S1PR3 zijn gekoppeld aan Gi, Gq en G12/13, en S1PR4 en S1PR5 transduce signaal via Gi en G12/136.
S1P-S1PR-signalering is een cruciaal therapeutisch doelwit voor meerdere ziekten, waaronder auto-immuunziekten7, ontsteking8, kanker9 en zelfs COVID-1910. In 2010 werd fingolimod (FTY720) gelicentieerd als een eersteklas medicijn gericht op S1PR's voor de behandeling van recidief multiple sclerose (MS)11. Het is echter in staat om zich te binden aan alle S1PRRs behalve S1PR2, terwijl niet-specifieke binding aan S1PR3 resulteert in oedeem van de hersenschors, vasculaire en bronchiale vernauwing en longepitheellekkage12. Als alternatieve strategie voor het verhogen van de therapeutische selectiviteit zijn subtype-specifieke liganden voor de receptor geproduceerd. Siponimod (BAF312) werd in 2019 goedgekeurd voor de recidief MS behandeling13; het richt zich effectief op S1PR1 en S1PR5, terwijl het geen affiniteit heeft met S1PR3 en minder bijwerkingen vertoont in de klinische praktijk14. In 2020 heeft de Amerikaanse Food and Drug Administration ozanimod goedgekeurd voor MS-therapie15. Er is gemeld dat ozanimod een 25-voudig grotere selectiviteit heeft voor S1PR1 dan voor S1PR516. Met name in de context van de huidige COVID-19-pandemie is ontdekt dat agonisten die gericht zijn op S1PR's kunnen worden gebruikt om COVID-19 te behandelen met behulp van immunomodulerende therapietechnieken17. In vergelijking met fingolimod heeft de ozanimod superioriteit getoond in het verlagen van de symptomen bij COVID-19-patiënten en ondergaat nu klinische onderzoeken10. Inzicht in de structurele basis en functie van S1PR's legt een belangrijke basis voor het ontwikkelen van een medicijn dat zich selectief richt op S1PR's18.
Veel technieken worden gebruikt om de structurele informatie van biomacromolecules te onderzoeken, waaronder röntgenkristallografie, nucleaire magnetische resonantie (NMR) en elektronenmicroscopie (EM). Vanaf maart 2022 zijn er meer dan 180.000 structuren gedeponeerd op de Protein Databank (PDB), en de meeste daarvan zijn opgelost door röntgenkristallografie. Echter, met de eerste bijna-atomaire resolutiestructuur van TPRV1 (3,4 Å-resolutie) gerapporteerd door Yifan Cheng en David Julius in 201319, is cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) een mainstream techniek geworden voor eiwitstructuren, en het totale aantal EM PDB-structuren was meer dan 10.000. De kritieke doorbraakgebieden zijn de ontwikkeling van nieuwe camera's voor beeldvorming die bekend staan als directe elektronendetectiecamera's en nieuwe beeldverwerkingsalgoritmen. Cryo-EM heeft in het afgelopen decennium een revolutie teweeggebracht in de structuurbiologie en op structuur gebaseerde geneesmiddelenontdekking20. Omdat het begrijpen hoe macromoleculaire complexen hun gecompliceerde rollen in de levende cel vervullen een centraal thema is in de biologische wetenschappen, heeft cryo-EM het potentieel om conformaties van dynamische moleculaire complexen te onthullen, met name voor transmembraaneiwitten21. G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn de grootste superfamilie van transmembraaneiwitten en de doelen van meer dan 30% van de momenteel op de markt gebrachte geneesmiddelen22. De ontwikkeling van cryo-EM heeft bijgedragen aan een uitbarsting van hoge-resolutie structuren van GPCR-G eiwitcomplexen, waardoor structurele bepaling mogelijk is voor 'hardnekkige' doelen die nog steeds niet toegankelijk zijn voor röntgenkristallografische analyse in medicijnontwerp23. Daarom biedt de cryo-EM-toepassing een kans om de driedimensionale structuur van GPCR's te bepalen in bijna-inheemse omstandigheden bij bijna atomaire resolutie24. Vooruitgang in cryo-EM maakt het mogelijk om mechanistische onderbouwing van GPCR-stimulatie of -remming te visualiseren, en verder voordeel bij het ontdekken van de nieuwe bindingsplaatsen voor GPCR-gerichte medicijncreatie25.
Vertrouwend op de enorme vooruitgang van cryo-EM-technologie, hebben we structuren van gekwelde S1PR1-, S1PR3- en S1PR5-Gi-signaleringscomplexen geïdentificeerd die onlangs26,27 zijn. Bij mensen worden S1PR's gevonden in verschillende weefsels en vertonen ze unieke voorkeuren voor downstream G-eiwitten 4,5. S1PR1 wordt voornamelijk gekoppeld aan het Gi-eiwit, dat vervolgens de productie van 3′,5′-cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) remt. S1PR3 en S1PR5 kunnen ook worden gekoppeld aan Gi 6,28. Omdat Gi-gekoppelde receptoractivering de productie van cAMP29 vermindert, werd een Gi-inhibitie cAMP-test geïntroduceerd om cAMP-remmingseffecten te meten voor het vastleggen van functionele veranderingen26,27. Met behulp van een gemuteerde versie van Photinus pyralis luciferase waarin een cAMP-bindende eiwitgroep is ingebracht, biedt deze cAMP-test een eenvoudige en betrouwbare methode voor het monitoren van GPCR-activiteit door veranderingen in intracellulaire cAMP-concentratie30. Het is een gevoelige en niet-radioactieve functionele test en kan worden toegepast om de real-time downstream signalering van een breed scala aan GPCR's te monitoren voor het ontdekken van geneesmiddelen31.
Hier wordt een samenvatting gegeven van de kritieke methoden voor het oplossen van de activerings- en medicijnherkenningsmodi van S1PR's, voornamelijk inclusief cryo-EM-manipulaties en een Gi-inhibition cAMP-test. Dit artikel is bedoeld als uitgebreide experimentele leidraad voor verdere verkenningen van de structuren en functies van GPCR's.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

Lysofosfolipiden (LPL's) zijn bioactieve lipiden die sfingosine-1-fosfaat (S1P), lysofosfatidisch zuur, enz. Omvatten. S1P, een metabolisch product van sfingolipiden in het celmembraan, is een van de best gekarakteriseerde LPL's die een verscheidenheid aan cellulaire fysiologische reacties reguleert via signaalroutes gemedieerd door sfingosine 1-fosfaatreceptoren (S1PR's). Dit impliceerde dat het S1P-S1PR-signaleringssysteem een opmerkelijk potentieel therapeutisch doelwit is voor aandoeningen, waaronder multiple sclerose (MS), auto-immuunziekten, kanker, ontsteking en zelfs COVID-19. S1PR's, een kleine subset van de klasse A G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) familie, zijn samengesteld uit vijf subtypen: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 en S1PR5. Het gebrek aan gedetailleerde structurele informatie belemmert echter de ontdekking van geneesmiddelen gericht op S1PR's. Hier pasten we de cryo-elektronenmicroscopiemethode toe om de structuur van het S1P-S1PR-complex op te lossen en het mechanisme van activering, selectieve medicijnherkenning en G-eiwitkoppeling op te helderen met behulp van celgebaseerde functionele assays. Andere lysofosfolipidereceptoren (LPLRs) en GPCR's kunnen ook worden bestudeerd met behulp van deze strategie.

Alvorens het monster van het S1PR-Gi-complex in te vriezen, moet het gezuiverde monster worden gescheiden door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en geanalyseerd met gelfiltratiechromatografie. Figuur 2 toont het S1PR3-Gi complex als voorbeeld. De piekfractie van het homogene GPCR-G-eiwitcomplex bevond zich meestal op ~10,5 ml van de grootte-uitsluitingschromatografie (figuur 2A). SDS-pagina analyse van het S1PR3-Gi complex (Figuur 2B<...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P oefent zijn diverse fysiologische effecten uit via de S1P-receptoren (S1PR's) subfamilie. Hier wordt een pijplijn beschreven om de structuren en functie van S1PR's uit te leggen.

Een pijplijn om de structuren en signaalroutes van sfingosine-1-fosfaatreceptoren te onderzoeken

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

We hebben de activerings- en herberekeningsstemmingen van S1PRS door de bemanning, EM-manipulaties en GI-inhab-toestand A M P A en minder belangrijke basis voor het ontwikkelen van een medicijn dat zich stevig richt op S1PRS-Verbeteringen die het mogelijk maken om magnistische onderschilderingen van GP ZR-stimulatie of bewoning te viruliseren en verdere voordelen bij het blootleggen van de normale bindingsplaatsen voor T BCR-gerichte medicijncreatie. De kwaliteit van het monster is de basis voor alles In het juiste EM-experiment. De essentiële factoren voor eenvoudige bereiding omvatten verschillende productstatus van SF-lijnverkoop en een N g-concentratie Het demonstreren van de procedure zal Heli Wang zijn, een afgestudeerde student van mijn niveau.Voor eiwitzuiveringsbelasting deze vingerscène één fosfaatreceptoren of S één P R S G eiwitcomplexoplossing voor een grootte-uitsluitingschromatografie of S E C-gelfiltratiekolom vooraf in evenwicht gebracht met S E C-buffer met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut bij vier graden Celsius. Om de verzamelde fracties te gebruiken voor cryo-elektronenmicroscopie, concentreer ze met behulp van een 100 kilodalton cutoff concentrator bij 1.300 XG bij vier graden Celsius. Kies tijdens de gegevensverwerking voor 2D-classificatie in de voorlopige classificatie van deeltjes de 2D-classificatiefunctie in de Rely On-software en klik op bladeren rechts van het sterbestand van de invoerafbeeldingen in de IO-optie.Kies dan de particles.star. Stel vervolgens in de optimalisatieoptie het aantal klassen in op 100 en de maskerdiameter A op 140. Stel in de rekenoptie het aantal gepoolde deeltjes in op 10 en voer de map in vanaf een snelle, snelle lokale schijf in het veld deeltje kopiëren naar krasmap.Voor snellere verwerking selecteert u ja voor gebruikte GPU-versnelling. Voor subsetselectie van goede 2D-resultaten als sjablonen, gaat u naar de IO-optie van de subsetselectiefunctie en klikt u op bladeren rechts van geselecteerde klassen van model.star. Kies vervolgens run_it025_model.ster als invoer en klik op uitvoeren in het pop-upvenster controleer sorteer afbeeldingen op en omgekeerd sorteren. Klik vervolgens op display. Nadat u goede representatieve 2D-resultaten hebt gekozen als referentie voor referentie van de automatische selectiefunctie, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u Geselecteerde klassen opslaan.Als u de sjabloon wilt gebruiken voor de tweede ronde van automatisch kiezen, gaat u naar de IO-optie van de automatische pickfunctie. Klik rechts van de invoermicrografieën voor automatisch kiezen en kies micrographs.star. Klik vervolgens op bladeren rechts van 2D-referenties en kies class_averages.star.Selecteer ook nee voor of gebruik leplossian in van Gaussisch. Voer vervolgens deeltjesextractie uit met behulp van het achtervoegsel cord underscore onderstreping auto pick.star. Voer 2D-classificatie uit met behulp van deeltjes.ster, gevolgd door subsetselectie met behulp van run underscore het nul 20 five_optimizer. ster Voor deeltjesextractie kiest u na het klikken op bladeren rechts van het micrograafsterbestand in de OPTIE IO microfoto's. ster en selecteer ja voor of herextractieer geraffineerde deeltjes.Nadat u op bladeren rechts van het sterbestand met geraffineerde deeltjes hebt geklikt, selecteert u deeltjes. ster voor het genereren van een initieel 3D-model en een referentiekaart, klik op bladeren door het oorspronkelijke 3D-model rechts van het sterbestand met invoerafbeeldingen in de IO-optie en kies de vorige particles.star. Stel vervolgens in de optimalisatieoptie het aantal klassen in op één en de maskerdiameter A op 140.Voor 3D-classificatie en het genereren van een voorlopige 3D-kaart, na het selecteren van deeltjes. ster zoals eerder gedemonstreerd, klik op bladeren rechts van de referentiekaart en kies initiële onderstrepingsmodel dot mrc. Stel vervolgens in de optimalisatieoptie het aantal klassen in op vier tot zes en de maskerdiameter A op 140.Voor het genereren van maskers, na het selecteren van een goede 3D-kaart als invoer in de IO-optie, stelt u de initiële binarisatiedrempel in op 0,05 en breidt u de binaire kaart uit naar zoveel pixels naar drie. Ga vervolgens naar de maskeroptie en stel in. Voeg een zachte rand toe aan dit aantal pixels tot acht.Voor de volgende verwerking opent u de Trino Spark-software, maakt u een nieuwe werkruimte en klikt u op job builder voor de eerste taak. Als u de deeltjesstapel wilt importeren, voert u het deeltjespad in het deeltjesmetapadveld en het filmpad in het deeltjesgegevenspadveld in. Importeer vervolgens 3D-volumes door het pad van het beste 3D-volume dat eerder is gegenereerd in het volumegegevenspad in te voeren en masker te selecteren voor het type volume dat wordt geïmporteerd.Voor niet-uniforme verfijning sleept u de eerder gegenereerde geïmporteerde onderstrepingsdeeltjes als de invoer van niet-uniforme verfijning deeltjesdeeltje. Geïmporteerd onderstrepingsvolume, onderstreping één als de invoer van niet-uniforme verfijningen volumevolume en geïmporteerd onderstrepingsmasker onderstrepen één als de invoer van niet-uniforme verfijningen masker. Masker. Klik vervolgens op Q om de verwerking te starten en herhaal de procedure om een goede oplossing te verkrijgen.S1PRGI 3D-kaart. Voeg na de constructie van plasmide en de voorbereiding op voorbijgaande transfectie twee microgram bereid DNA toe aan 200 microliter transfectiereagensbuffer. Meng door 10 seconden te vortexen en het mengsel kort voor gebruik te draaien.Voeg vier microliter transfectiereagens toe en meng het door vortexing en spinnen zoals eerder aangetoond. Nadat u de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur hebt geïncubeerd, laat u langzaam 200 microliter van het transfectiemengsel in elk putje van een zes putjesplaat met CHOK één cel vallen en schudt u de plaat voorzichtig of grondig mengen. Vervang na vier tot zes uur incubatie het transfectiemedium door het celgroeimedium bestaande uit F 12-medium en 10% fbs voordat u de plaat terugbrengt naar de incubator.24 tot 48 uur na het transsectie oogsten van de cellen, suspensie de cellen in drie milliliter van een SA buffer met D luciferian kaliumzout. Voeg vervolgens met behulp van een meerkanaals pipet 90 microliter van de celsuspensie toe aan elke put van een 96 putplaat die voorzichtig wordt gemengd en incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Voor fluorescentiesignaalbepaling bereidt u eerst 10 millimolaire stamoplossingen van siponimod in D M S O.Maak vervolgens een seriële verdunning in H B S S-buffer met 25 micromolaire forscaline en stimuleer de cellen met 10 microliter verschillende concentraties van deze agonistoplossing gedurende 30 minuten.Tel vervolgens het luminescentiesignaal in een microplaatlezer door luminescentie te selecteren voor detectiemethode. Eindpunt voor leestype en luminescentievezel voor opticatype in de bijbehorende software. Stel ook de optiekwinst in op 255.Importeer vervolgens de verkregen fluorescentiesignaalwaarden in een spreadsheetprogramma en verwerk de gegevens met behulp van de niet-lineaire regressiecurve fit dosisresponsfunctie. Het S1PRS GI-complex kon met succes worden gezuiverd door grootte-uitsluitingschromatografie, die werd geverifieerd door de SDS-pagina. Bovendien was het elektronenmicroscopieprotocol dat in deze studie werd gevolgd effectief in het onderscheiden tussen S1PRSGI-deeltjes met heldere en goed gedefinieerde 2D-klassen en deeltjes van slechte kwaliteit.Bovendien zou een elektronenmicroscopiekaart van S1PR3 GI met een goede resolutie kunnen worden gegenereerd door furrier shell-correlatie door niet-uniforme verfijning. Na structurele analyse werden functionele testen voor S één P R drie uitgevoerd door transfectie van C H O K één cellen met receptor- en sensorplasmiden, waaruit bleek dat de verhouding tussen receptorplasmide en sensorplasmide van één tot drie optimale resultaten oplevert. De resultaten waren echter minder realistisch in heck 2 93 cellen In die verwerking is de keuze van algoritmen in deeltjessectie en het gedeelte van 2D- en 3D-classificatie belangrijk voor het oplossen van de SoO MPS G-eiwitcomplexen, vooral voor het modelleren van de lekken en ecfs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titratie ELISA als een methode om te bepalen van de dissociatieconstante van Receptor-Ligand interactie

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identificatie van Orexin en endocannabinoïde receptoren bij volwassen zebravis met behulp van immunoperoxidasekleuring en immunofluorescentie methoden

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...