Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

Les données du complexe S1PRs-Gi ont été récoltées au West China Cryo-EM Center de l’Université du Sichuan et au Cryo-EM Center de la Southern University of Science and Technology (SUSTech) et traitées au Duyu High-Performance Computing Center de l’Université du Sichuan. Ce travail a été soutenu par la Natural Science Foundation of China (32100965 à L.C., 32100988 à W.Y., 31972916 à Z.S.) et le Fonds de recherche postdoctorale à temps plein de l’Université du Sichuan (2021SCU12003 à L.C.)

1. Purification du complexe protéique S1PRs-G
<ol><li>Pour purifier le complexe protéique humain S1PRs-G, cloner les ADNc de S1PR1 dépourvus de résidus C-terminaux 338-382, le type sauvage S1PR3, S1PR5 tronqué avec 345-398 à l’extrémité C, et le Gi1 de type sauvage dans le vecteur pFastBac1 et les ADNc des Gβ1 et Gγ2 de type sauvage dans le vecteur pFastBacdual (Table of Materials). REMARQUE: Toutes les constructions pour les S1PR contiennent également la séquence de s...

Ce protocole décrit un pipeline primaire pour déterminer les structures des S1PR par cryo-EM et mesurer le pouvoir d’activation des S1PR par test d’inhibition de l’AMPc médié par Gi. Certaines étapes sont cruciales pour le succès de l’expérience.
Pour purifier le complexe S1PRs-Gi, il convient d’accorder plus d’attention à la qualité du virus et à la santé des cellules sf9 . L’expression du récepteur est considérablement réduite dans les cellules sf9</e...

La sphingosine-1-phosphate (S1P), un produit métabolique des sphingolipides dans la membrane cellulaire, est une molécule de signalisation lysophosphatique omniprésente qui implique diverses activités biologiques, y compris le trafic de lymphocytes, le développement vasculaire, l’intégrité endothéliale et la fréquence cardiaque 1,2,3. Le S1P exerce ses divers effets physiologiques par l’intermédiaire de cinq sous-types de récepteurs S1P (S1PRs 1-5); Les S1PR se trouvent dans une variété de tissus et présentent des préférences uniques pour les protéines G en aval 4,5. S1PR1 est principalement couplé à la protéine Gi, qui inhibe par la suite la production d’AMPc; S1PR2 et S1PR3 sont couplés avec Gi, Gq et G12/13, et S1PR4 et S1PR5 transduisent le signal via Gi et G12/136.
La signalisation S1P-S1PR est une cible thérapeutique essentielle pour de multiples maladies, notamment les maladies auto-immunes7, l’inflammation8, le cancer9 et même la COVID-1910. En 2010, le fingolimod (FTY720) a été homologué en tant que médicament de première classe ciblant les RP S1 pour traiter la sclérose en plaques (SEP)11. Cependant, il est capable de se lier à tous les S1PR sauf S1PR2, tandis que la liaison non spécifique à S1PR3 entraîne un œdème du cortex cérébral, une constriction vasculaire et bronchique et une fuite épithélialepulmonaire 12. Comme stratégie alternative pour augmenter la sélectivité thérapeutique, des ligands spécifiques au sous-type pour le récepteur ont été produits. Le siponimod (BAF312) a été approuvé en 2019 pour le traitement de la SEP en rechute13; il cible efficacement S1PR1 et S1PR5, alors qu’il n’a aucune affinité pour S1PR3, présentant moins d’effets secondaires dans la pratique clinique14. En 2020, la Food and Drug Administration des États-Unis a autorisé l’ozanimod pour le traitement de la SEP15. Il a été rapporté que l’ozanimod détient une sélectivité 25 fois plus grande pour S1PR1 que pour S1PR516. Notamment, dans le contexte de la pandémie actuelle de COVID-19, il a été découvert que des médicaments agonistes ciblant les RP S1 peuvent être utilisés pour traiter la COVID-19 en utilisant des techniques de thérapie immunomodulatrice17. En comparaison avec le fingolimod, l’ozanimod a montré sa supériorité dans la réduction des symptômes chez les patients atteints de COVID-19 et fait actuellement l’objet d’essais cliniques10. Comprendre la base structurelle et la fonction des RP S1 jette des bases importantes pour le développement d’un médicament qui cible sélectivement les PRS11 18.
De nombreuses techniques sont utilisées pour étudier l’information structurelle des biomacromolécules, y compris la cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la microscopie électronique (EM). En mars 2022, plus de 180 000 structures ont été déposées sur la banque de données sur les protéines (PDB), et la plupart d’entre elles ont été résolues par cristallographie aux rayons X. Cependant, avec la première structure de résolution quasi atomique de TPRV1 (résolution de 3,4 Å) rapportée par Yifan Cheng et David Julius en 2013 19, la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est devenue une technique courante pour les structures protéiques, et le nombre total de structures EM PDB était supérieur à10 000. Les domaines de percée critiques sont le développement de nouvelles caméras pour l’imagerie connues sous le nom de caméras de détection directe d’électrons et de nouveaux algorithmes de traitement d’image. Cryo-EM a révolutionné la biologie des structures et la découverte de médicaments basés sur la structure au cours de la dernière décennie20. Comme comprendre comment les complexes macromoléculaires remplissent leurs rôles complexes dans la cellule vivante est un thème central en sciences biologiques, la cryo-EM a le potentiel de révéler des conformations de complexes moléculaires dynamiques, en particulier pour les protéines transmembranaires21. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande superfamille de protéines transmembranaires et les cibles de plus de 30 % des produits pharmaceutiques actuellement commercialisés22. Le développement de la cryo-EM a contribué à une explosion de structures à haute résolution de complexes protéiques GPCR-G, permettant la détermination structurelle de cibles « réfractaires » qui ne sont toujours pas accessibles à l’analyse cristallographique aux rayons X dans la conception de médicaments23. Par conséquent, l’application cryo-EM offre une chance de déterminer la structure tridimensionnelle des RCPG dans des conditions quasi natives à une résolution atomique proche de24. Les progrès de la cryo-EM permettent de visualiser les fondements mécanistes de la stimulation ou de l’inhibition des RCPG, et d’autres avantages dans la découverte de nouveaux sites de liaison pour la création de médicaments ciblant les RCPG25.
En nous appuyant sur les énormes progrès de la technologie cryo-EM, nous avons identifié des structures de complexes de signalisation agonisés S1PR1-, S1PR3- et S1PR5-Gi récemment26,27. Chez l’homme, les S1PR se trouvent dans divers tissus et présentent des préférences uniques pour les protéines G en aval 4,5. S1PR1 est principalement couplé à la protéine Gi, qui inhibe par la suite la production d’adénosine monophosphate 3′,5′-cyclique (AMPc). S1PR3 et S1PR5 sont également capables de se coupler avec Gi 6,28. Étant donné que l’activation des récepteurs gicouplés diminue la production d’AMPc29, un test d’inhibition de l’AMPc de Gi a été introduit pour mesurer les effets d’inhibition de l’AMPc pour capturer les altérations fonctionnelles26,27. Utilisant une version mutante de Photinus pyralis luciferase dans laquelle une fraction protéique de liaison à l’AMPc a été insérée, ce test d’AMPc offre une méthode simple et fiable pour surveiller l’activité des RCPG par des changements dans la concentration intracellulaire d’AMPc30. Il s’agit d’un essai fonctionnel sensible et non radioactif qui peut être appliqué pour surveiller la signalisation en aval en temps réel d’un large éventail de RCPG à des fins de découverte de médicaments31.
Ici, un résumé est fourni des méthodes critiques pour résoudre les modes d’activation et de reconnaissance des médicaments des S1PR, y compris principalement des manipulations cryo-EM et un test d’AMPc d’inhibition de Gi. Cet article vise à fournir des conseils expérimentaux complets pour d’autres explorations des structures et des fonctions des RCPG.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

Les lysophospholipides (LPL) sont des lipides bioactifs qui comprennent la sphingosine 1-phosphate (S1P), l’acide lysophosphatidique, etc. S1P, un produit métabolique des sphingolipides dans la membrane cellulaire, est l’un des LPL les mieux caractérisés qui régule une variété de réponses physiologiques cellulaires via des voies de signalisation médiées par les récepteurs de la sphingosine 1-phosphate (S1PR). Cela implique que le système de signalisation S1P-S1PRs est une cible thérapeutique potentielle remarquable pour des troubles, notamment la sclérose en plaques (SEP), les maladies auto-immunes, le cancer, l’inflammation et même la COVID-19. Les S1PR, un petit sous-ensemble de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A, sont composés de cinq sous-types: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 et S1PR5. Le manque d’informations structurelles détaillées, cependant, entrave la découverte de médicaments ciblant les RP S1. Ici, nous avons appliqué la méthode de cryo-microscopie électronique pour résoudre la structure du complexe S1P-S1PRs et élucidé le mécanisme d’activation, la reconnaissance sélective des médicaments et le couplage des protéines G en utilisant des tests fonctionnels cellulaires. D’autres récepteurs des lysophospholipides (LPLR) et RCPG peuvent également être étudiés en utilisant cette stratégie.

Avant de congeler l’échantillon du complexe S1PRs-Gi, l’échantillon purifié doit être séparé par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et analysé par chromatographie par filtration sur gel. La figure 2 montre le complexe S1PR3-Gi à titre d’exemple. La fraction maximale du complexe homogène de protéines GPCR-G était habituellement située à ~10,5 mL de la chromatographie d’exclusion de taille (Figure 2A). L’analyse SDS du complexe S1...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P exerce ses divers effets physiologiques à travers la sous-famille des récepteurs S1P (S1PR). Ici, un pipeline est décrit pour expliquer les structures et la fonction des S1PR.

Un pipeline pour étudier les structures et les voies de signalisation des récepteurs de la sphingosine 1-phosphate

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Nous avons abordé les humeurs d’activation et de recalcul des médicaments de S1PRS par l’équipage, les manipulations EM et l’état gastro-intestinal A M P A et une base moins importante pour le développement d’un médicament qui cible solidement S1PRS Les progrès permettent de viruliser les sous-peintures magnistiques de la stimulation ou de l’habitation GP ZR et d’autres avantages dans la découverte des sites de liaison normaux pour la création de médicaments ciblant T BCR. La qualité de l’échantillon est la base de tout dans l’expérience EM correcte. Les facteurs essentiels pour une préparation simple comprennent divers états de produit de la vente de ligne SF et une concentration de N g Démonstration de la procédure sera Heli Wang un étudiant diplômé de mon niveau.Pour la purification des protéines, cette scène de doigt un récepteur phosphate ou une solution complexe protéique S P r s g à une chromatographie d’exclusion de taille ou colonne de filtration sur gel S E C prééquilibrée avec un tampon S E C à un débit de 0,5 millilitres par minute à quatre degrés Celsius. Pour utiliser les fractions collectées pour la cryomicroscopie électronique, concentrez-les à l’aide d’un concentrateur de coupure de 100 kilodaltons à 1 300 XG à quatre degrés Celsius. Pendant le traitement des données pour la classification 2D dans la classification préliminaire des particules, choisissez la fonction de classification 2D dans le logiciel Rely On et cliquez sur Parcourir à droite du fichier étoile des images d’entrée dans l’option IO.Choisissez ensuite le particles.star. Ensuite, dans l’option d’optimisation, définissez le nombre de classes sur 100 et le diamètre du masque A sur 140. Dans l’option de calcul, définissez le nombre de particules regroupées sur 10 et entrez le répertoire à partir d’un lecteur local rapide et rapide dans le champ copier la particule vers le répertoire de travail.Pour un traitement plus rapide, sélectionnez oui pour l’accélération GPU utilisée. Pour la sélection de sous-ensembles de bons résultats 2D en tant que modèles, accédez à l’option IO de la fonction de sélection de sous-ensembles et cliquez sur Parcourir à droite de sélectionner des classes de model.star. Ensuite, choisissez run_it025_model.Étoilez comme entrée et cliquez sur Exécuter dans la fenêtre contextuelle Cochez Trier les images et inverser le tri. Cliquez ensuite sur l’affichage. Après avoir choisi de bons résultats 2D représentatifs comme référence pour la référence de la fonction de sélection automatique, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Enregistrer les classes sélectionnées.Pour utiliser le modèle pour la deuxième série de prélèvement automatique, accédez à l’option E/S de la fonction de prélèvement automatique. Cliquez sur Parcourir à droite de Micrographies d’entrée pour la sélection automatique, puis choisissez micrographs.star. Cliquez ensuite sur Parcourir à droite des références 2D et choisissez class_averages.star.Aussi, sélectionnez non pour ou utilisez leplossian dans de gaussien. Ensuite, effectuez l’extraction de particules à l’aide du suffixe de soulignement du cordon automatiquement pick.star. Effectuez une classification 2D à l’aide de particules., suivie de la sélection du sous-ensemble à l’aide de Run Underscore It Zero 20 five_optimizer. étoile Pour l’extraction des particules, après avoir cliqué sur Parcourir à droite du fichier étoile micrographique dans l’option IO, choisissez micrographies. et sélectionnez Oui pour ou Réextraire les particules raffinées.Après avoir cliqué sur Parcourir à droite du fichier étoile des particules raffinées, sélectionnez particules. pour générer un modèle 3D initial et une carte de référence, cliquez sur Parcourir le modèle initial 3D à droite du fichier étoile d’images d’entrée dans l’option IO et choisissez le fichier particles.star précédent. Ensuite, dans l’option d’optimisation, définissez le nombre de classes sur une et le diamètre du masque A sur 140.Pour la classification 3D et la génération d’une carte 3D préliminaire, après sélection des particules. Comme illustré précédemment, cliquez sur Parcourir à droite de la carte de référence et choisissez Initial Underscore Model Dot MRC. Ensuite, dans l’option d’optimisation, définissez le nombre de classes sur quatre à six et le diamètre du masque A sur 140.Pour la génération de masques, après avoir sélectionné une bonne carte 3D en entrée dans l’option E/S, définissez le seuil de binarisation initial sur 0,05 et étendez la carte binaire à ce nombre de pixels à trois. Ensuite, accédez à l’option de masque et définissez. Ajoutez un bord souple à ce nombre de pixels à huit.Pour le traitement suivant, ouvrez le logiciel Trino Spark, créez un nouvel espace de travail et cliquez sur Job Builder pour la première tâche. Pour importer la pile de particules, entrez le chemin de la particule dans le champ du méta-chemin des particules et le chemin des films dans le champ du chemin des données des particules. Ensuite, importez des volumes 3D en entrant le chemin du meilleur volume 3D généré auparavant dans le chemin de données du volume et en sélectionnant le masque pour le type de volume importé.Pour un raffinement non uniforme, faites glisser les particules de soulignement importées précédemment générées en tant qu’entrée de particules de raffinements non uniformes. Le volume de soulignement importé, le trait de soulignement un en tant qu’entrée du volume des raffinements non uniformes et le masque de soulignement importé le trait de soulignement un en tant qu’entrée du masque d’affinement non uniforme. Masque. Ensuite, cliquez sur Q pour démarrer le traitement et répétez la procédure pour obtenir une bonne résolution.Carte 3D S1PRGI. Après la construction du plasmide et la préparation pour la transfection transitoire, ajoutez deux microgrammes d’ADN préparé dans 200 microlitres de tampon de réactif de transfection. Mélanger en tourbillonnant pendant 10 secondes et en faisant tourner le mélange brièvement avant utilisation.Ajoutez quatre microlitres de réactif de transfection et mélangez-le en tourbillonnant et en tournant comme démontré précédemment. Après avoir incubé le tube à température ambiante pendant 15 minutes, déposez lentement 200 microlitres du mélange de transfection dans chaque puits d’une plaque de six puits contenant des cellules CHOK one et agitez doucement la plaque ou mélangez soigneusement. Après quatre à six heures d’incubation, remplacez le milieu de transfection par le milieu de croissance cellulaire constitué de milieu F 12 et 10%fbs avant de remettre la plaque dans l’incubateur.24 à 48 heures après la récolte des cellules par transsection, suspendre les cellules dans trois millilitres d’un tampon SA avec du sel de potassium luciférien D. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 90 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 96 puits mélangée délicatement et incuber à température ambiante pendant 40 minutes. Pour la détermination du signal de fluorescence, préparer d’abord 10 solutions mères millimolaires de siponimod dans D M S O.Puis faire une dilution en série dans un tampon H B S S contenant 25 micromolaires forscaline et stimuler les cellules avec 10 microlitres de différentes concentrations de cette solution agoniste pendant 30 minutes.Ensuite, comptez le signal de luminescence dans un lecteur de microplaques en sélectionnant la méthode de luminescence pour la détection. Point de terminaison pour le type de lecture et fibre de luminescence pour le type d’optique dans le logiciel associé. Réglez également le gain optique sur 255.Ensuite, importez les valeurs de signal de fluorescence obtenues dans un tableur et traitez les données à l’aide de la fonction dose-réponse non linéaire de la courbe de régression. Le complexe gastro-intestinal S1PRS a pu être purifié avec succès par chromatographie d’exclusion de taille, ce qui a été vérifié par la page SDS. De plus, le protocole de microscopie électronique suivi dans cette étude a été efficace pour différencier les particules S1PRSGI avec des classes 2D claires et bien définies et les particules de mauvaise qualité.De plus, une carte de microscopie électronique de S1PR3 GI avec une bonne résolution pourrait être générée par corrélation de la coquille de fourreur grâce à un raffinement non uniforme. Après analyse structurale, des dosages fonctionnels pour S one P R trois ont été effectués par transfection de cellules C H O K one avec plasmides récepteurs et capteurs, ce qui a révélé que le rapport plasmide récepteur/plasmide capteur de un à trois produit des résultats optimaux. Cependant, les résultats étaient moins réalistes dans 2 93 cellules Dans ce traitement, le choix des algorithmes en section de particules et la section de classification 2D et 3D est important pour résoudre les complexes protéiques MPS G en particulier pour modéliser les fuites et les ecfs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Imitant la fonction des protéines de signalisation: Vers Artificial Signal Therapy transduction

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Recherche

Biochimie

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Mesure de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G via liaison GTP radiomarquée

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrage ELISA comme une méthode pour déterminer la constante de Dissociation de l’Interaction Ligand du récepteur

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Utilisation du pipeline Open-Source MALDI TOF-MS IDBac pour l'analyse des protéines microbiennes et des données spécialisées sur les métabolites

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identification des récepteurs d'orexine et d'endocannabinoïdes chez le poisson zèbre adulte à l'aide de méthodes d'immunoperoxidase et d'immunofluorescence

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Dépistage stratégique et caractérisation du complexe de signalisation des protéines VISUAL GPCR-mini-G pour une cristallisation réussie

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Test de fuite fluorescente pour étudier la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Un pipeline de préparation d’échantillons pour les microcristaux à la ligne de faisceau VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Utilisation de l’amélioration de la fluorescence induite par les protéines résolues dans le temps pour identifier les conformations locales stables un α-synucléine à la fois

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...