Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

Die Daten des S1PRs-Gi-Komplexes wurden im West China Cryo-EM Center der Sichuan University und im Cryo-EM Center an der Southern University of Science and Technology (SUSTech) gesammelt und im Duyu High-Performance Computing Center der Sichuan University verarbeitet. Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China (32100965 an L.C., 32100988 an W.Y., 31972916 an Z.S.) und dem Vollzeit-Postdoctoral Research Fund der Universität Sichuan (2021SCU12003 bis L.C.)

1. Reinigung des S1PRs-G-Proteinkomplexes
<ol><li>Um den humanen S1PRs-G-Proteinkomplex zu reinigen, klonen Sie die cDNAs von S1PR1 ohne C-terminale Reste 338-382, den Wildtyp S1PR3, S1PR5 abgeschnitten mit 345-398 am C-Terminus und den Wildtyp Gi1 in den pFastBac1-Vektor und die cDNAs des Wildtyps Gβ1 und Gγ2 in den pFastBacdual Vektor (Table of Materials). HINWEIS: Alle Konstrukte für S1PRs enthalten auch die Hämagglutinin (HA)-Signalsequenz, gefolgt von einem Flag-Epitop-Tag ...

Dieses Protokoll beschreibt eine primäre Pipeline zur Bestimmung der Strukturen von S1PRs durch Kryo-EM und zur Messung der Aktivierungspotenz von S1PRs durch Gi-vermittelten cAMP-Inhibitionsassay. Einige Schritte sind entscheidend für den Erfolg des Experiments.
Um den S1PRs-Gi-Komplex zu reinigen, sollte der Qualität des Virus und der Gesundheit der sf9-Zellen mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden. Die Expression des Rezeptors ist in armen sf9-Zellen dramatisch reduziert....

Sphingosin-1-phosphat (S1P), ein Stoffwechselprodukt von Sphingolipiden in der Zellmembran, ist ein ubiquitäres lysophosphatidisches Signalmolekül, das verschiedene biologische Aktivitäten umfasst, einschließlich Lymphozytentransport, vaskuläre Entwicklung, endotheliale Integrität und Herzfrequenz 1,2,3. S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen durch fünf S1P-Rezeptor-Subtypen (S1PRs 1-5); S1PRs kommen in einer Vielzahl von Geweben vor und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine 4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die cAMP-Produktion hemmt; S1PR2 und S1PR3 sind mit Gi, Gq und G12/13 gekoppelt, und S1PR4 und S1PR5 übertragen Signale über Gi und G12/136.
Die S1P-S1PR-Signalübertragung ist ein kritisches therapeutisches Ziel für mehrere Krankheiten, darunter Autoimmunerkrankungen7, Entzündungen8, Krebs9 und sogar COVID-1910. Im Jahr 2010 wurde Fingolimod (FTY720) als First-in-Class-Medikament gegen S1PRs zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)11 zugelassen. Es ist jedoch in der Lage, an alle S1PRs außer S1PR2 zu binden, während eine unspezifische Bindung an S1PR3 zu Ödemen der Großhirnrinde, Gefäß- und Bronchialverengung und Lungenepithelleckage führt12. Als alternative Strategie zur Erhöhung der therapeutischen Selektivität wurden subtypspezifische Liganden für den Rezeptor hergestellt. Siponimod (BAF312) wurde 2019 für die rezidivierende MS-Behandlung zugelassen13; Es zielt effektiv auf S1PR1 und S1PR5 ab, während es keine Affinität zu S1PR3 hat und in der klinischen Praxis weniger Nebenwirkungen aufweist14. Im Jahr 2020 genehmigte die US-amerikanische Food and Drug Administration Ozanimod für die MS-Therapie15. Es wurde berichtet, dass Ozanimod eine 25-fach höhere Selektivität für S1PR1 als für S1PR516 aufweist. Insbesondere wurde im Zusammenhang mit der aktuellen COVID-19-Pandemie entdeckt, dass agonistische Medikamente, die auf S1PRs abzielen, zur Behandlung von COVID-19 unter Verwendung immunmodulatorischer Therapietechniken eingesetzt werden können17. Im Vergleich zu Fingolimod hat Ozanimod eine Überlegenheit bei der Senkung der Symptome bei COVID-19-Patienten gezeigt und befindet sich nun in klinischen Studien10. Das Verständnis der strukturellen Basis und Funktion von S1PRs legt eine wichtige Grundlage für die Entwicklung eines Medikaments, das selektiv auf S1PRs18 abzielt.
Viele Techniken werden verwendet, um die Strukturinformationen von Biomakromolekülen zu untersuchen, einschließlich Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und Elektronenmikroskopie (EM). Mit Stand März 2022 sind mehr als 180.000 Strukturen in der Protein Databank (PDB) hinterlegt, von denen die meisten durch Röntgenkristallographie aufgelöst wurden. Mit der ersten nahezu atomaren Auflösungsstruktur von TPRV1 (3,4 Å Auflösung), die Yifan Cheng und David Julius 201319 berichteten, ist die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu einer Mainstream-Technik für Proteinstrukturen geworden, und die Gesamtzahl der EM-PDB-Strukturen betrug mehr als 10.000. Die entscheidenden Durchbruchsbereiche sind die Entwicklung neuer Kameras für die Bildgebung, die als direkte Elektronendetektionskameras bekannt sind, und neue Bildverarbeitungsalgorithmen. Kryo-EM hat die Strukturbiologie und die strukturbasierte Wirkstoffforschung in den letzten zehn Jahren revolutioniert20. Da das Verständnis, wie makromolekulare Komplexe ihre komplizierten Rollen in der lebenden Zelle erfüllen, ein zentrales Thema in den biologischen Wissenschaften ist, hat Kryo-EM das Potenzial, Konformationen dynamischer Molekülkomplexe aufzudecken, insbesondere für Transmembranproteine21. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Superfamilie von Transmembranproteinen und die Ziele von mehr als 30% der derzeit vermarkteten Arzneimittel22. Die Entwicklung von Kryo-EM hat zu einem Ausbruch hochauflösender Strukturen von GPCR-G-Proteinkomplexen beigetragen, was die Strukturbestimmung für "hartnäckige" Ziele ermöglicht, die für die röntgenkristallographische Analyse im Arzneimitteldesign noch nicht zugänglich sind23. Daher bietet die Kryo-EM-Anwendung die Möglichkeit, die dreidimensionale Struktur von GPCRs unter nahezu nativen Bedingungen mit nahezu atomarer Auflösung zu bestimmen24. Fortschritte in der Kryo-EM ermöglichen es, mechanistische Grundlagen der GPCR-Stimulation oder -Hemmung zu visualisieren und weitere Vorteile bei der Aufdeckung der neuartigen Bindungsstellen für die GPCR-zielgerichtete Arzneimittelherstellungzu erzielen 25.
Gestützt auf die enormen Fortschritte der Kryo-EM-Technologie haben wir kürzlich Strukturen von gequälten S1PR1-, S1PR3- und S1PR5-Gi-Signalkomplexen identifiziert26,27. Beim Menschen werden S1PRs in verschiedenen Geweben gefunden und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine 4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die Produktion von 3′,5′-zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) hemmt. S1PR3 und S1PR5 können auch mit Gi 6,28 gekoppelt werden. Da die Gi-gekoppelte Rezeptoraktivierung die Produktion von cAMP29 verringert, wurde ein Gi-Inhibition cAMP-Assay eingeführt, um cAMP-Hemmungseffekte zur Erfassung funktioneller Veränderungen zu messen26,27. Unter Verwendung einer mutierten Version von Photinus pyralis luciferase, in die ein cAMP-bindendes Proteinteil eingefügt wurde, bietet dieser cAMP-Assay eine einfache und zuverlässige Methode zur Überwachung der GPCR-Aktivität durch Änderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration30. Es handelt sich um einen empfindlichen und nicht radioaktiven funktionellen Assay, der zur Überwachung der nachgeschalteten Echtzeitsignalisierung einer Vielzahl von GPCRs für die Wirkstoffforschung eingesetzt werdenkann 31.
Hier wird eine Zusammenfassung der kritischen Methoden zur Auflösung der Aktivierungs- und Arzneimittelerkennungsmodi von S1PRs gegeben, hauptsächlich einschließlich Kryo-EM-Manipulationen und eines Gi-Inhibition cAMP-Assays. Dieser Artikel zielt darauf ab, umfassende experimentelle Leitlinien für weitere Untersuchungen der Strukturen und Funktionen von GPCRs bereitzustellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

Lysophospholipide (LPLs) sind bioaktive Lipide, die Sphingosin-1-phosphat (S1P), Lysophosphatidsäure usw. enthalten. S1P, ein Stoffwechselprodukt von Sphingolipiden in der Zellmembran, ist eines der am besten charakterisierten LPLs, das eine Vielzahl von zellulären physiologischen Reaktionen über Signalwege reguliert, die durch Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptoren (S1PRs) vermittelt werden. Dies implizierte, dass das S1P-S1PRs-Signalsystem ein bemerkenswertes potenzielles therapeutisches Ziel für Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS), Autoimmunerkrankungen, Krebs, Entzündungen und sogar COVID-19 ist. S1PRs, eine kleine Untergruppe der GPCR-Familie (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) der Klasse A, bestehen aus fünf Subtypen: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 und S1PR5. Der Mangel an detaillierten Strukturinformationen behindert jedoch die Wirkstoffentdeckung, die auf S1PRs abzielt. Hier haben wir die Kryo-Elektronenmikroskopie-Methode angewendet, um die Struktur des S1P-S1PRs-Komplexes aufzuklären, und den Mechanismus der Aktivierung, selektiven Wirkstofferkennung und G-Protein-Kopplung mithilfe zellbasierter funktioneller Assays aufgeklärt. Andere Lysophospholipidrezeptoren (LPLRs) und GPCRs können ebenfalls mit dieser Strategie untersucht werden.

Vor dem Einfrieren der Probe des S1PRs-Gi-Komplexes muss die gereinigte Probe durch Größenausschlusschromatographie (SEC) getrennt und mit Gelfiltrationschromatographie analysiert werden. Abbildung 2 zeigt den S1PR3-Gi-Komplex als Beispiel. Der Spitzenanteil des homogenen GPCR-G-Proteinkomplexes lag üblicherweise bei ~10,5 ml der Größenausschlusschromatographie (Abbildung 2A). Die SDS-Seitenanalyse des S1PR3-Gi-Komplexes (Abbildung 2B</...

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A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen über die Unterfamilie der S1P-Rezeptoren (S1PRs). Hier wird eine Pipeline beschrieben, um die Strukturen und Funktionen von S1PRs zu erläutern.

Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Wir befassten uns mit den Aktivierungs- und Neuberechnungsstimmungen von S1PRS durch Besatzung, EM-Manipulationen und GI-Inhab-Zustand A M P A und weniger signifikanten Grundlagen für die Entwicklung eines Medikaments, das solide auf S1PRS abzielt. Fortschritte in ermöglichen es, magnistische Untermalungen der GP ZR-Stimulation oder -Besiedlung zu virulisieren, und weitere Vorteile bei der Aufdeckung der normalen Bindungsstellen für die gezielte Wirkstoffherstellung von T BCR. Die Qualität der Probe ist die Grundlage für alles im richtigen EM-Experiment. Die wesentlichen Faktoren für eine einfache Zubereitung sind verschiedene Produktzustände des SF-Linienverkaufs und eine Ng-Konzentration Demonstration des Verfahrens wird Heli Wang, ein Doktorand von meinem Niveau, sein.Zur Proteinreinigung laden diese Fingerszene einen Phosphatrezeptor oder eine S P R S G Proteinkomplexlösung auf eine Größenausschlusschromatographie oder S E C Gelfiltrationssäule voräquilibriert mit S E C Puffer bei einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute bei vier Grad Celsius. Um die gesammelten Fraktionen für die Kryoelektronenmikroskopie zu verwenden, konzentrieren Sie sie mit einem 100 Kilodalton Cutoff-Konzentrator bei 1,300 XG bei vier Grad Celsius. Während der Datenverarbeitung für die 2D-Klassifizierung in der vorläufigen Klassifizierung von Partikeln wählen Sie die 2D-Klassifizierungsfunktion in der Rely On-Software und klicken Sie rechts neben der Sterndatei der Eingabebilder in der IO-Option auf Durchsuchen.Wählen Sie dann den particles.star. Legen Sie anschließend in der Optimierungsoption die Anzahl der Klassen auf 100 und den Maskendurchmesser A auf 140 fest. Legen Sie in der Berechnungsoption die Anzahl der gepoolten Partikel auf 10 fest und geben Sie das Verzeichnis von einem schnellen, schnellen lokalen Laufwerk in das Feld Partikel in Scratch-Verzeichnis kopieren ein.Für eine schnellere Verarbeitung wählen Sie Ja für die verwendete GPU-Beschleunigung. Für die Teilmenge Auswahl von guten 2D-Ergebnissen als Vorlagen, gehen Sie zur IO-Option der Teilmengenauswahlfunktion und klicken Sie auf Navigieren rechts neben wählen Sie Klassen von model.star. Wählen Sie als Nächstes run_it025_model.Als Eingabe markieren und im Popup-Fenster auf Ausführen klicken, Bilder sortieren auf und umgekehrt sortieren. Klicken Sie dann auf Display. Nachdem Sie gute repräsentative 2D-Ergebnisse als Referenz für die Auto-Picking-Funktion ausgewählt haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie ausgewählte Klassen speichern.Um die Vorlage für die zweite Runde der automatischen Kommissionierung zu verwenden, gehen Sie zur IO-Option der automatischen Kommissionierfunktion. Klicken Sie rechts neben Mikroaufnahmen für die automatische Auswahl auf Durchsuchen und wählen Sie micrographs.star aus. Klicken Sie dann rechts neben 2D-Referenzen auf Durchsuchen und wählen Sie class_averages.star.Wählen Sie außerdem Nein für oder verwenden Sie Leplossian in von Gauß. Führen Sie als Nächstes die Partikelextraktion mit dem Schnurunterstrich-Suffix Unterstrich auto pick.star durch. Führen Sie eine 2D-Klassifizierung mit Partikeln durch.Stern, gefolgt von Teilmengenauswahl mit Run Underscore It Zero 20 five_optimizer. Stern Wählen Sie für die Partikelextraktion rechts neben der Sterndatei des Mikrographen in der Option IO die Option Mikroskopische Aufnahmen aus. Stern und wählen Sie Ja für oder reextrahieren Sie raffinierte Partikel.Nachdem Sie rechts neben der Sterndatei für raffinierte Partikel auf Navigieren geklickt haben, wählen Sie Partikel aus. Stern zum Generieren eines ersten 3D-Modells und einer Referenzkarte, klicken Sie auf Durchsuchen des 3D-Ausgangsmodells rechts neben der Sterndatei der Eingabebilder in der IO-Option und wählen Sie die vorherige particles.star. Stellen Sie dann in der Optimierungsoption die Anzahl der Klassen auf eine und den Maskendurchmesser A auf 140 ein.Zur 3D-Klassifizierung und Erstellung einer vorläufigen 3D-Karte nach Auswahl der Partikel. Stern Wie zuvor gezeigt, klicken Sie rechts neben der Referenzkarte auf Durchsuchen und wählen Sie Initial Underscore Model Dot MRC. Stellen Sie dann in der Optimierungsoption die Anzahl der Klassen auf vier bis sechs und den Maskendurchmesser A auf 140 ein.Setzen Sie für die Maskengenerierung nach Auswahl einer guten 3D-Karte als Eingabe in der IO-Option den anfänglichen Binarisierungsschwellenwert auf 0,05 und die binäre Karte auf so viele Pixel auf drei erweitern. Als nächstes gehen Sie zur Maskenoption und legen Sie fest. Fügen Sie dieser Anzahl von Pixeln bis acht eine weiche Kante hinzu.Öffnen Sie für die nächste Bearbeitung die Trino Spark-Software, erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich und klicken Sie für den ersten Auftrag auf Job Builder. Um den Partikelstapel zu importieren, geben Sie den Partikelpfad in das Feld Partikelmetapfad und den Filmpfad in das Feld Partikeldatenpfad ein. Importieren Sie als Nächstes 3D-Volumes, indem Sie den Pfad des besten zuvor generierten 3D-Volumes in den Volume-Datenpfad eingeben und die Maske für den Typ des zu importierenden Volumes auswählen.Für eine ungleichmäßige Verfeinerung ziehen Sie die zuvor generierten importierten Unterstrichpartikel als Eingabe von Partikelpartikeln mit ungleichmäßigen Verfeinerungen. Importiertes Unterstrichvolumen, Unterstrich eins als Eingabe des Volumenvolumens für ungleichmäßige Verfeinerungen und importierte Unterstrichmaske Unterstrich eins als Eingabe einer nicht gleichmäßigen Verfeinerungsmaske. Maske. Klicken Sie anschließend auf Q, um die Verarbeitung zu starten, und wiederholen Sie den Vorgang, um eine gute Auflösung zu erhalten.S1PRGI 3D-Karte. Nach dem Plasmidaufbau und der Vorbereitung für die transiente Transfektion fügen Sie zwei Mikrogramm präparierte DNA in 200 Mikroliter Transfektionsreagenzpuffer hinzu. Mischen Sie durch Wirbeln für 10 Sekunden und drehen Sie die Mischung kurz vor Gebrauch.Fügen Sie vier Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu und mischen Sie es durch Vortexen und Spinnen, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, lassen Sie langsam 200 Mikroliter der Transfektionsmischung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte fallen, die CHOK-One-Zellen enthält, und schütteln Sie die Platte vorsichtig oder mischen Sie sie gründlich. Nach vier bis sechs Stunden Inkubation ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch das Zellwachstumsmedium, das aus F 12 Medium und 10% fbs besteht, bevor Sie die Platte in den Inkubator zurückbringen.24 bis 48 Stunden nach der Transsektionsernte der Zellen suspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter eines SA-Puffers mit D-luziferischem Kaliumsalz. Dann mit einer Mehrkanalpipette 90 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geben, die vorsichtig gemischt wird, und 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Für die Bestimmung des Fluoreszenzsignals bereiten Sie zunächst 10 Millimolar-Stammlösungen von Siponimod in D M S O vor.Dann machen Sie eine serielle Verdünnung in H B S S-Puffer, der 25 Mikromolare Forskalin enthält, und stimulieren Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern verschiedener Konzentrationen dieser Agonistenlösung für 30 Minuten.Als nächstes zählen Sie das Lumineszenzsignal in einem Mikrotiterplattenleser, indem Sie Lumineszenz für die Detektionsmethode auswählen. Endpunkt für Lesetyp und Lumineszenzfaser für Optiktyp in der zugehörigen Software. Stellen Sie außerdem die Optikverstärkung auf 255 ein.Importieren Sie dann die erhaltenen Fluoreszenzsignalwerte in ein Tabellenkalkulationsprogramm und verarbeiten Sie die Daten mit der nichtlinearen Regressionskurve passen Dosis-Wirkungs-Funktion. Der S1PRS-GI-Komplex konnte erfolgreich durch Größenausschlusschromatographie gereinigt werden, die von der SDS-Seite verifiziert wurde. Darüber hinaus war das Elektronenmikroskopieprotokoll, das in dieser Studie befolgt wurde, wirksam bei der Unterscheidung zwischen S1PRSGI-Partikeln mit klaren und gut definierten 2D-Klassen und Partikeln schlechter Qualität.Darüber hinaus konnte eine elektronenmikroskopische Karte von S1PR3 GI mit einer guten Auflösung durch kürzere Schalenkorrelation durch ungleichmäßige Verfeinerung erzeugt werden. Nach der Strukturanalyse wurden funktionelle Assays für S one P R three durch Transfektion von C H O K one Zellen mit Rezeptor- und Sensorplasmiden durchgeführt, die zeigten, dass das Rezeptorplasmid-Sensor-Plasmid-Verhältnis von eins zu drei optimale Ergebnisse liefert. Die Ergebnisse waren jedoch bei insgesamt 2 93 Zellen weniger realistisch Bei dieser Verarbeitung ist die Wahl der Algorithmen im Partikelschnitt und im Abschnitt der 2D- und 3D-Klassifizierung wichtig für die Lösung der so MPS G-Proteinkomplexe, insbesondere für die Modellierung der Lecks und ECFS.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Imitieren die Funktion von Signalproteinen: Gegen künstliches Signal Transduction Therapie

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Forschung

Biochemie

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Die Wege zur Aktivierung der Caspase bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung mit Beleuchtung

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titration ELISA als eine Methode zur Bestimmung der Dissoziationskonstante Rezeptor Liganden Interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisches Screening und Charakterisierung des Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex für eine erfolgreiche Kristallisation

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...