Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

הנתונים של קומפלקס S1PRs-Gi נקטפו במרכז Cryo-EM במערב סין באוניברסיטת סצ'ואן ובמרכז Cryo-EM באוניברסיטה הדרומית למדע וטכנולוגיה (SUSTech) ועובדו במרכז המחשוב בעל הביצועים הגבוהים Duyu באוניברסיטת סצ'ואן. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (32100965 ללוס אנג'לס, 32100988 ל- W.Y., 31972916 ל- Z.S.) וקרן המחקר לפוסט-דוקטורט במשרה מלאה של אוניברסיטת סצ'ואן (2021SCU12003 עד L.C.)

1. טיהור קומפלקס חלבונים S1PRs-G
<ol><li>כדי לטהר את קומפלקס החלבון S1PRs-G האנושי, שכפלו את ה-cDNAs של S1PR1 חסר שאריות C-terminal 338-382, S1PR3 מסוג פראי, S1PR5 שנחתך עם 345-398 ב-C-terminus, ואת ה-Gi1 מהסוג הפראי לווקטור pFastBac1 ול-cDNAs של Gβ1 ו-Gγ2 מהסוג הפראי לווקטור pFastBacdual (טבלת חומרים). הערה: כל המבנים עבור S1PRs מ...

פרוטוקול זה מתאר צינור ראשי לקביעת המבנים של S1PRs על ידי cryo-EM ומדידת עוצמת ההפעלה של S1PRs על ידי בדיקת עיכוב cAMP בתיווך Gi. כמה צעדים חיוניים להצלחת הניסוי.
כדי לטהר את קומפלקס S1PRs-Gi, יש לשים לב יותר לאיכות הנגיף ולבריאותם של תאי sf9 . הביטוי של הקולטן מופחת באופן דרמטי בתאי sf9</...

ספינגוזין-1-פוספט (S1P), תוצר מטבולי של ספינגוליפידים בקרום התא, היא מולקולת איתות ליזופוספטידית הנמצאת בכל מקום ומערבת פעילויות ביולוגיות שונות, כולל סחר בלימפוציטים, התפתחות כלי דם, שלמות האנדותל וקצב לב 1,2,3. S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות חמישה תת-סוגים של קולטני S1P (S1PRs 1-5); S1PRs נמצאים במגוון רקמות ומפגינים העדפות ייחודיות לחלבוני Gבמורד הזרם 4,5. S1PR1 מוצמד בעיקר לחלבון Gi, אשר לאחר מכן מעכב את ייצור cAMP; S1PR2 ו-S1PR3 משולבים עם Gi, Gq ו-G12/13, ואות מתמר S1PR4 ו-S1PR5 דרך Gi ו-G12/136.
איתות S1P-S1PR הוא יעד טיפולי קריטי למחלות מרובות, כולל הפרעות אוטואימוניות7, דלקת8, סרטן9 ואפילו COVID-1910. בשנת 2010, פינגולימוד (FTY720) קיבל רישיון כתרופה ראשונה מסוגה המכוונת נגד S1PRs לטיפול בטרשת נפוצה חוזרת (MS)11. עם זאת, הוא מסוגל להיקשר לכל S1PRs למעט S1PR2, בעוד שקשירה לא ספציפית ל- S1PR3 גורמת לבצקת של קליפת המוח, כיווץ כלי הדם והסימפונות ודליפת אפיתל הריאה12. כאסטרטגיה חלופית להגברת הסלקטיביות הטיפולית, נוצרו ליגנדות ספציפיות לתת-סוג עבור הקולטן. סיפונימוד (BAF312) אושרה בשנת 2019 לטיפול בטרשת נפוצהחוזרת 13; הוא מכוון ביעילות ל-S1PR1 ול-S1PR5, בעוד שאין לו זיקה ל-S1PR3, מה שמפגין פחות תופעות לוואי בקליניקה14. בשנת 2020, מנהל המזון והתרופות האמריקאי אישר אוזנימוד לטיפול בטרשת נפוצה15. דווח כי אוזנימוד מחזיק בסלקטיביות גדולה פי 25 עבור S1PR1 מאשר עבור S1PR516. יש לציין כי בהקשר של מגפת COVID-19 הנוכחית, התגלה כי תרופות אגוניסטיות המכוונות ל- S1PRs עשויות לשמש לטיפול ב- COVID-19 על ידי שימוש בטכניקות טיפול אימונומודולטוריות17. בהשוואה לפינגולימוד, האוזנימוד הראה עליונות בהורדת הסימפטומים בחולי COVID-19 וכעת הוא עובר ניסויים קליניים10. הבנת הבסיס המבני והתפקוד של S1PRs מניחה בסיס משמעותי לפיתוח תרופה המכוונת באופן סלקטיבי ל- S1PRs18.
טכניקות רבות משמשות לחקר המידע המבני של ביו-מקרומולקולות, כולל קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ומיקרוסקופיית אלקטרונים (EM). נכון למרץ 2022, ישנם יותר מ -180,000 מבנים שהופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB), ורובם נפתרו על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. עם זאת, עם מבנה הרזולוציה הכמעט אטומית הראשונה של TPRV1 (רזולוציה 3.4 Å) שדווחה על ידי ייפאן צ'נג ודיוויד יוליוס בשנת 201319, מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) הפכה לטכניקה מרכזית עבור מבני חלבונים, והמספר הכולל של מבני EM PDB היה יותר מ -10,000. התחומים פורצי הדרך הקריטיים הם פיתוח מצלמות חדשות להדמיה המכונות מצלמות לגילוי אלקטרונים ישירים ואלגוריתמים חדשים לעיבוד תמונה. Cryo-EM חוללה מהפכה בביולוגיה של מבנים ובגילוי תרופות מבוססות מבנה בעשורה-20 האחרון. מכיוון שהבנת האופן שבו קומפלקסים מקרומולקולריים ממלאים את תפקידיהם המורכבים בתא החי היא נושא מרכזי במדעי הביולוגיה, לקריו-EM יש פוטנציאל לחשוף קונפורמציות של קומפלקסים מולקולריים דינמיים, במיוחד עבור חלבונים טרנס-ממברניים21. קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם משפחת-העל הגדולה ביותר של חלבוני טרנס-ממברנה והמטרות של יותר מ-30% מהתרופות המשווקות כיום22. הפיתוח של cryo-EM תרם לפרץ של מבנים ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים של חלבוני GPCR-G, המאפשרים קביעה מבנית של מטרות 'בלתי פתירות' שעדיין אינן נגישות לניתוח קריסטלוגרפי של קרני רנטגן בתכנון תרופות23. לפיכך, יישום cryo-EM מספק הזדמנות לקבוע את המבנה התלת-ממדי של GPCRs בתנאים כמעט מקומיים ברזולוציה אטומית קרובה לרזולוציה אטומית24. ההתקדמות ב- cryo-EM מאפשרת לדמיין יסודות מכניסטיים של גירוי או עיכוב GPCR, ותועלת נוספת בחשיפת אתרי הקשירה החדשים ליצירת תרופות ממוקדות GPCR25.
בהסתמך על הצעדים האדירים של טכנולוגיית cryo-EM, זיהינו מבנים של מתחמי איתות S1PR1-, S1PR3 ו-S1PR5-Gi מיוסרים לאחרונה26,27. בבני אדם, S1PRs נמצאים ברקמות שונות ומפגינים העדפות ייחודיות לחלבוני Gבמורד הזרם 4,5. S1PR1 מוצמד בעיקר לחלבון Gi, אשר לאחר מכן מעכב ייצור של 3′,5′-מחזורי של אדנוזין מונופוספט (cAMP). S1PR3 ו-S1PR5 מסוגלים גם לצימוד עם Gi 6,28. מכיוון שהפעלת קולטן מצומד Gi מפחיתה את הייצור של cAMP29, הוכנסה בדיקת cAMP לעיכוב Gi כדי למדוד את השפעות העיכוב של cAMP ללכידת שינויים פונקציונליים26,27. באמצעות גרסה מוטנטית של Photinus pyralis luciferase שבה הוכנס חלבון קושר cAMP, בדיקת cAMP זו מציעה שיטה פשוטה ואמינה לניטור פעילות GPCR באמצעות שינויים בריכוז cAMPתוך תאי 30. זוהי בדיקה תפקודית רגישה ולא רדיואקטיבית וניתן ליישם אותה כדי לנטר את האיתות בזמן אמת במורד הזרם של מגוון רחב של GPCRs למטרות גילוי תרופות31.
כאן, מסופק סיכום של השיטות הקריטיות לפתרון מצבי ההפעלה וזיהוי התרופות של S1PRs, כולל בעיקר מניפולציות cryo-EM ובדיקת cAMP של עיכוב Gi. מאמר זה נועד לספק הדרכה ניסיונית מקיפה לחקירות נוספות של המבנים והתפקודים של GPCRs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

ליזופוספוליפידים (LPLs) הם ליפידים ביו-אקטיביים הכוללים ספינגוזין 1-פוספט (S1P), חומצה ליזופוספטידית וכו '. S1P, תוצר מטבולי של ספינגוליפידים בקרום התא, הוא אחד ה-LPLs המאופיינים בצורה הטובה ביותר המווסת מגוון תגובות פיזיולוגיות תאיות באמצעות מסלולי איתות המתווכים על ידי קולטני ספינגוזין 1-פוספט (S1PRs). זה רמז לכך שמערכת האיתות S1P-S1PRs היא מטרה טיפולית פוטנציאלית יוצאת דופן להפרעות, כולל טרשת נפוצה (MS), הפרעות אוטואימוניות, סרטן, דלקת ואפילו COVID-19. S1PRs, תת-קבוצה קטנה ממשפחת הקולטן המצומד לחלבון G מסוג A (GPCR), מורכבת מחמישה תתי-סוגים: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 ו-S1PR5. עם זאת, היעדר מידע מבני מפורט מעכב את גילוי התרופה המכוון ל-S1PRs. כאן, יישמנו את שיטת המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית כדי לפתור את המבנה של קומפלקס S1P-S1PRs, והבהרנו את מנגנון ההפעלה, זיהוי תרופות סלקטיבי וצימוד חלבון G באמצעות מבחנים פונקציונליים מבוססי תאים. קולטני ליזופוספוליפידים אחרים (LPLR) ו- GPCRs יכולים גם הם להיחקר באמצעות אסטרטגיה זו.

לפני הקפאת הדגימה של קומפלקס S1PRs-Gi, יש להפריד את הדגימה המטוהרת על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ולנתח אותה באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל. איור 2 מציג את קומפלקס S1PR3-Gi כדוגמה. חלק השיא של קומפלקס החלבון ההומוגני GPCR-G היה ממוקם בדרך כלל ב~10.5 מ"ל של הכרומטוגרפיה של אי-הכלל?...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות תת-משפחת קולטני S1P (S1PRs). כאן, צינור מתואר כדי להרחיב על המבנים והתפקוד של S1PRs.

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

התייחסנו למצבי הרוח של הפעלה וחישוב מחדש של תרופות של S1PRS על ידי צוות, מניפולציות EM ו- GI inhab state A M P A ובסיס פחות משמעותי לפיתוח תרופה שמכוונת באופן מוצק ל- S1PRS Advancements בכך שמאפשרת להפוך את האנדרדוגיות המגנטיות של גירוי או מגורים של GP ZR ויתרונות נוספים בחשיפת אתרי הקשירה הרגילים ליצירת תרופות ממוקדות T BCR. איכות המדגם היא הבסיס לכל דבר בניסוי EM הנכון. הגורמים החיוניים להכנה פשוטה כוללים מצב מוצר שונים של מכירת קו SF וריכוז N g המדגים את ההליך יהיה חלי וואנג סטודנט לתואר שני מהרמה שלי.עבור טיהור חלבון עומס זה אצבע סצנה קולטני פוספט אחד או S אחד P R S G חלבון מורכב פתרון לכרומטוגרפיה אי הכללת גודל או S E C ג'ל סינון עמודה מראש שיווי משקל עם מאגר S E C בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה בארבע מעלות צלזיוס. כדי להשתמש בשברים שנאספו עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו, רכז אותם באמצעות רכז חיתוך של 100 קילודלטון ב-1, 300 XG בארבע מעלות צלזיוס. במהלך עיבוד נתונים לסיווג דו-ממדי בסיווג הראשוני של חלקיקים, בחר את פונקציית הסיווג הדו-ממדית בתוכנת Rely On ולחץ על דפדף מימין לקובץ כוכב תמונות הקלט באפשרות IO.לאחר מכן בחר את החלקיקים.כוכב. לאחר מכן, באפשרות האופטימיזציה, הגדר את מספר הכיתות ל -100 ואת קוטר המסכה A ל -140. באפשרות המחשוב, הגדר את מספר החלקיקים המאוגדים ל-10 והזן את הספריה מכונן מקומי מהיר ומהיר בשדה ספריית ההעתקה לשדה ספריית הגירוד.לעיבוד מהיר יותר, בחר כן להאצת GPU בשימוש. לבחירת תת-ערכה של תוצאות דו-ממדיות טובות כתבניות, עבור אל האפשרות IO של פונקציית בחירת תת-ערכה ולחץ על דפדף מימין למחלקות נבחרות מ- model.star. לאחר מכן, בחר run_it025_model.כוכב כקלט ולחץ על הפעל בחלון הקופץ בדוק מיין תמונות במיון הפוך ומיון לאחור. לאחר מכן לחץ על תצוגה. לאחר בחירת תוצאות דו-ממדיות מייצגות טובות כהפניה להפניה לפונקציית הבחירה האוטומטית, לחץ לחיצה ימנית ובחר שמור מחלקות נבחרות.כדי להשתמש בתבנית עבור הסיבוב השני של בחירה אוטומטית, עבור אל אפשרות IO של פונקציית בחירה אוטומטית. לחץ על דפדף משמאל למיקרוגרפים של קלט לבחירה אוטומטית, ובחר micrographs.star. לאחר מכן לחץ על דפדף מימין להפניות דו-ממדיות ובחר class_averages.star.כמו כן, בחר לא עבור או השתמש leplossian ב של גאוס. לאחר מכן, בצע חילוץ חלקיקים באמצעות סיומת קו תחתון כבל תחתון auto pick.star. בצע סיווג דו-ממדי באמצעות חלקיקים.כוכב, ואחריו בחירת תת-קבוצה באמצעות קו תחתון ריצה זה אפס 20 five_optimizer. כוכב לחילוץ חלקיקים, לאחר לחיצה על דפדף מימין לקובץ כוכב המיקרוגרף באפשרות IO, בחר מיקרוגרפים. כוכב ובחר כן עבור או לחלץ מחדש חלקיקים מזוקקים.לאחר לחיצה על דפדף מימין לקובץ הכוכבים של החלקיקים המזוקקים, בחר חלקיקים. כוכב ליצירת מודל תלת-ממדי ראשוני ומפת ייחוס, לחץ על עיון במודל הראשוני התלת-ממדי מימין לקובץ כוכב תמונות הקלט באפשרות IO ובחר את החלקיקים הקודמים.star. לאחר מכן באפשרות האופטימיזציה, הגדר את מספר הכיתות לאחת ואת קוטר המסכה A ל -140.לסיווג תלת מימדי ויצירת מפה תלת-ממדית ראשונית, לאחר בחירת חלקיקים. כוכב כפי שהודגם קודם לכן, לחץ על דפדף מימין למפת ההפניה ובחר קו תחתון ראשוני דגם נקודה MRC. לאחר מכן, באפשרות האופטימיזציה, הגדר את מספר הכיתות לארבע עד שש ואת קוטר המסכה A ל- 140.ליצירת מסיכות, לאחר בחירת מפה תלת-ממדית טובה כקלט באפשרות IO, הגדר את סף הבינאריזציה הראשוני ל- 0.05, ואת המפה הבינארית הרחבה לפיקסלים רבים אלה לשלושה. לאחר מכן, עבור אל אפשרות המסכה והגדר. הוסף קצה רך לפיקסלים רבים אלה לשמונה.לעיבוד הבא, פתח את תוכנת Trino Spark, צור סביבת עבודה חדשה ולחץ על בונה המשרות עבור העבודה הראשונה. לייבוא ערימת החלקיקים, הזינו את נתיב החלקיקים בשדה מטא-נתיב החלקיקים ואת נתיב הסרטים בשדה נתיב נתוני החלקיקים. לאחר מכן, יבא אמצעי אחסון תלת-ממדיים על-ידי הזנת הנתיב של אמצעי האחסון התלת-ממדי הטוב ביותר שנוצר בעבר בנתיב נתוני אמצעי האחסון, ובחירת מסיכה עבור סוג אמצעי האחסון המיובא.עבור עידון לא אחיד, גרור את חלקיקי הקו התחתון המיובאים שנוצרו קודם לכן כקלט של חלקיקי חידודים לא אחידים. נפח קו תחתון מיובא, קו תחתון אחד כקלט של נפח נפח חידודים לא אחידים ומסיכת קו תחתון מיובאת מדגישים אחד כקלט של מסיכת חידודים לא אחידה. מסכה. לאחר מכן, לחץ על Q כדי להתחיל בעיבוד ולחזור על ההליך כדי לקבל רזולוציה טובה.S1PRGI 3D מפה. לאחר בניית פלסמיד והכנה להעברה חולפת, הוסף שני מיקרוגרם של דנ"א מוכן לתוך 200 מיקרוליטרים של מאגר מגיב טרנספקציה. מערבבים על ידי מערבולת במשך 10 שניות ומסובבים את התערובת לזמן קצר לפני השימוש.הוסף ארבעה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה וערבב אותו על ידי מערבולת וסיבוב כפי שהוכח קודם לכן. לאחר דגירה של הצינור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, יש לזרוק באיטיות 200 מיקרוליטרים של תערובת הטרנספקציה לתוך כל באר של צלחת שש בארות המכילה CHOK תא אחד ולנער בעדינות את הצלחת או ערבוב יסודי. לאחר ארבע עד שש שעות של דגירה, החלף את מדיום הטרנספקציה במדיום צמיחת התאים המורכב מ- F 12 בינוני ו- 10% fbs לפני החזרת הצלחת לאינקובטור.24 עד 48 שעות לאחר קצירת התאים, להשעות את התאים בשלושה מיליליטר של חיץ SA עם מלח אשלגן לוציפריאן D. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב ערוצית, הוסף 90 מיקרוליטרים של מתלה התא לכל באר של צלחת 96 באר מעורבב בעדינות ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות. לקביעת אות פלואורסצנטי, ראשית, הכינו תמיסות מלאי של 10 מילימולאר של סיפונימוד ב- D M S O.ואז בצעו דילול סדרתי במאגר H B S S המכיל 25 מיקרומולר פורסקלין ועוררו את התאים עם 10 מיקרוליטרים של ריכוזים שונים של תמיסה אגוניסטית זו למשך 30 דקות.לאחר מכן, לספור את אות luminescence בקורא microplate על ידי בחירת luminescence עבור שיטת זיהוי. נקודת קצה עבור סוג קריאה, וסיבי זוהר עבור סוג אופטיקה בתוכנה המשויכת. כמו כן, הגדר את רווח האופטיקה ל -255.לאחר מכן ייבא את ערכי האות הפלואורסצנטי המתקבלים לתוכנית גיליון אלקטרוני, ועבד את הנתונים באמצעות פונקציית התגובה של עקומת הרגרסיה הלא ליניארית המתאימה למנה. קומפלקס S1PRS GI יכול להיות מטוהר בהצלחה על ידי כרומטוגרפיה אי הכללת גודל, אשר אומת על ידי דף SDS. יתר על כן, פרוטוקול מיקרוסקופיית האלקטרונים שנערך במחקר זה היה יעיל בהבחנה בין חלקיקי S1PRSGI עם מחלקות דו-ממדיות ברורות ומוגדרות היטב וחלקיקים באיכות ירודה.יתר על כן, מפת מיקרוסקופיית אלקטרונים של S1PR3 GI עם רזולוציה טובה יכולה להיווצר על ידי קורלציה פרוותית יותר באמצעות עידון לא אחיד. לאחר ניתוח מבני, בדיקות פונקציונליות עבור S One P R שלוש נעשו על ידי טרנספקציה של C H O K תא אחד עם קולטן ופלסמידים חיישן, אשר גילה כי פלסמיד קולטן חיישן יחס פלסמיד של אחד לשלושה מייצר תוצאות אופטימליות. עם זאת, התוצאות היו פחות מציאותיות ב- heck 2 93 תאים בעיבוד זה, בחירת האלגוריתמים בסעיף החלקיקים והקטע של סיווג דו-ממדי ותלת-ממדי חשובה לפתרון קומפלקסי החלבון MPS G במיוחד עבור מידול הדליפות וה- ecfs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

מחק את תפקודם של חלבוני איתות: לקראת תרפים התמר איתותים מלאכותיות

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

טיטור אליסה כשיטה לקבוע את קבוע דיסוציאציה של קולטן ליגנד אינטראקציה

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

הקרנה אסטרטגית ואפיון של הקומפלקס החזותי של החלבון GPCR-mini-G של התגבשות מוצלחת

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

ניצול שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על-ידי חלבון בזמן כדי לזהות קונפורמציות מקומיות יציבות אחת α-Synuclein Monomer בכל פעם

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...