Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

एस 1 पीआर-जीआई कॉम्प्लेक्स के डेटा को सिचुआन विश्वविद्यालय में वेस्ट चाइना क्रायो-ईएम सेंटर और दक्षिणी विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय (एसयूएसटेक) में क्रायो-ईएम सेंटर में काटा गया था और सिचुआन विश्वविद्यालय में डुयू हाई-परफॉर्मेंस कंप्यूटिंग सेंटर में संसाधित किया गया था। इस काम को चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एलसी के 32100965, डब्ल्यूवाई के 32100988, जेडएस के 31972916) और सिचुआन विश्वविद्यालय के पूर्णकालिक पोस्टडॉक्टरल रिसर्च फंड (2021 एससीयू 12003 से एलसी) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का शुद्धिकरण
<ol><li>मानव एस 1 पीआर-जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को शुद्ध करने के लिए, सी-टर्मिनल अवशेषों 338-382 की कमी वाले एस 1 पीआर 1 के सीडीएनए को क्लोन करें, सी-टर्मिनस पर 345-398 ?...

यह प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम द्वारा एस 1 पीआर की संरचनाओं का निर्धारण करने और जीआई-मध्यस्थता सीएमपी निषेध परख द्वारा एस 1 पीआर की सक्रियण शक्ति को मापने के लिए एक प्राथमिक पाइपलाइन का वर्णन करता है। प्रयोग क...

स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट (एस 1 पी), कोशिका झिल्ली में स्फिंगोलिपिड्स का एक चयापचय उत्पाद, एक सर्वव्यापी लाइसोफॉस्फेटिडिक सिग्नलिंग अणु है जिसमें लिम्फोसाइट तस्करी, संवहनी विकास, एंडोथेलियल अखंडता और हृदय गति 1,2,3 सहित विभिन्न जैविक गतिविधियां शामिल हैं। एस 1 पी पांच एस 1 पी रिसेप्टर उपप्रकारों (एस 1 पीआर 1-5) के माध्यम से अपने विविध शारीरिक प्रभाव डालता है; एस 1 पीआर विभिन्न प्रकार के ऊतकों में पाए जाते हैं और डाउनस्ट्रीम जी प्रोटीन 4,5 के लिए अद्वितीय प्राथमिकताएं प्रदर्शित करते हैं। एस 1 पीआर 1 मुख्य रूप से जीआई प्रोटीन के साथ युग्मित है, जो बाद में सीएमपी उत्पादन को रोकता है; एस 1 पीआर 2 और एस 1 पीआर 3 जीआई, जीक्यू और जी 12/13 के साथ युग्मित हैं, और एस 1 पीआर 4 और एस 1 पीआर 5 जीआई और जी 12/136 के माध्यम से सिग्नल को स्थानांतरित करते हैं।
एस 1 पी-एस 1 पीआर सिग्नलिंग ऑटोइम्यून विकार7, सूजन8, कैंसर 9 और यहां तक कि सीओवीआईडी -19 10 सहित कई बीमारियों के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य है। 2010 में, फिंगोलिमोड (एफटीवाई 720) को रिलैप्स मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) 11 के इलाज के लिए एस 1 पीआर को लक्षित करने वाली प्रथम श्रेणी की दवा के रूप में लाइसेंस दिया गया था। हालांकि, यह एस 1 पीआर 2 को छोड़कर सभी एस 1 पीआर को बांधने में सक्षम है, जबकि एस 1 पीआर 3 के लिए निरर्थक बाध्यकारी के परिणामस्वरूप सेरेब्रल कॉर्टेक्स, संवहनी और ब्रोन्कियल कसना, और फेफड़ों के उपकला रिसाव12 की सूजन होती है। चिकित्सीय चयनात्मकता बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में, रिसेप्टर के लिए उपप्रकार-विशिष्ट लिगेंड का उत्पादन किया गया है। सिपोनिमोड (बीएएफ 312) को 2019 में रिलैप्स एमएस उपचार13 के लिए अनुमोदित किया गया था; यह प्रभावी रूप से एस 1 पीआर 1 और एस 1 पीआर 5 को लक्षित करता है, जबकि इसका एस 1 पीआर 3 के लिए कोई संबंध नहीं है, नैदानिक अभ्यास14 में कम दुष्प्रभाव प्रदर्शित करता है। 2020 में, यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन ने एमएस थेरेपी15 के लिए ओज़ानिमोड को अधिकृत किया। यह बताया गया है कि ओज़ानिमोड एस 1 पीआर 516 की तुलना में एस 1 पीआर 1 के लिए 25 गुना अधिक चयनात्मकता रखता है। विशेष रूप से, वर्तमान कोविड-19 महामारी के संदर्भ में, यह पता चला है कि एस 1 पीआर को लक्षित करने वाली एगोनिस्ट दवाओं का उपयोग इम्यूनोमॉड्यूलेटरी थेरेपी तकनीकों 17 का उपयोग करकेकोविड-19 के इलाज के लिए किया जा सकता है। फिंगोलिमोड की तुलना में, ओज़ानिमोड ने कोविड-19 रोगियों में लक्षणों को कम करने में श्रेष्ठता दिखाई है और अब नैदानिकपरीक्षणों से गुजर रहा है। एस 1 पीआर के संरचनात्मक आधार और कार्य को समझना एक दवा विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण नींव रखता है जो चुनिंदा एस 1 पीआर18 को लक्षित करता है।
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) सहित बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचनात्मक जानकारी की जांच के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। मार्च 2022 तक, प्रोटीन डेटाबैंक (पीडीबी) पर 180,000 से अधिक संरचनाएं जमा हैं, और उनमें से अधिकांश को एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा हल किया गया है। हालांकि, 201319 में यिफान चेंग और डेविड जूलियस द्वारा रिपोर्ट किए गए टीपीआरवी 1 (3.4 ए रिज़ॉल्यूशन) की पहली निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचना के साथ, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) प्रोटीन संरचनाओं के लिए एक मुख्यधारा की तकनीक बन गई है, और ईएम पीडीबी संरचनाओं की कुल संख्या 10,000 से अधिक थी। महत्वपूर्ण सफलता क्षेत्र इमेजिंग के लिए नए कैमरों का विकास हैं जिन्हें प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्शन कैमरे और नई छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के रूप में जाना जाता है। क्रायो-ईएम ने पिछले एक दशक में संरचना जीव विज्ञान और संरचना-आधारित दवा की खोज में क्रांतिला दी है। यह समझने के रूप में कि मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स जीवित कोशिका में अपनी जटिल भूमिकाओं को कैसे पूरा करते हैं, जैविक विज्ञान में एक केंद्रीय विषय है, क्रायो-ईएम में गतिशील आणविक परिसरों के विरूपण को प्रकट करने की क्षमता है, विशेष रूप से ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन21 के लिए। जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन का सबसे बड़ा सुपरफैमिली है और वर्तमान में विपणन किए गए फार्मास्यूटिकल्स22 के 30% से अधिक के लक्ष्य हैं। क्रायो-ईएम के विकास ने जीपीसीआर-जी प्रोटीन परिसरों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं के फटने में योगदान दिया है, जो 'असभ्य' लक्ष्यों के लिए संरचनात्मक निर्धारण को सक्षम करता है जो अभी भी दवा डिजाइन23 में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफिक विश्लेषण के लिए सुलभ नहीं हैं। इसलिए, क्रायो-ईएम एप्लिकेशन परमाणु रिज़ॉल्यूशन24 के करीब निकट-देशी स्थितियों में जीपीसीआर की त्रि-आयामी संरचना को निर्धारित करने का मौका प्रदान करता है। क्रायो-ईएम में प्रगति जीपीसीआर उत्तेजना या निषेध के यंत्रवत आधार की कल्पना करना संभव बनाती है, और जीपीसीआर-लक्षित दवा निर्माण25 के लिए उपन्यास बाध्यकारी साइटों को उजागर करने में और लाभ उठाती है।
क्रायो-ईएम प्रौद्योगिकी की जबरदस्त प्रगति पर भरोसा करते हुए, हमने हाल ही में26,27 एस 1 पीआर 1-, एस 1 पीआर 3-, और एस 1 पीआर 5-जीआई सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं की पहचान की है। मनुष्यों में, एस 1 पीआर विभिन्न ऊतकों में पाए जाते हैं और डाउनस्ट्रीम जी प्रोटीन 4,5 के लिए अद्वितीय प्राथमिकताएं प्रदर्शित करते हैं। एस 1 पीआर 1 मुख्य रूप से जीआई प्रोटीन के साथ युग्मित है, जो बाद में 3', 5'-चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) उत्पादन को रोकता है। एस 1 पीआर 3 और एस 1 पीआर 5 जीआई 6,28 के साथ युग्मन करने में भी सक्षम हैं। चूंकि जीआई-युग्मित रिसेप्टर सक्रियण सीएमपी29 के उत्पादन को कम करता है, इसलिए कार्यात्मक परिवर्तन26,27 पर कब्जा करने के लिए सीएमपी निषेध प्रभावों को मापने के लिए एक जीआई-निषेध सीएमपी परख पेश की गई थी। फोटिनस पाइरालिस ल्यूसिफेरेज़ के एक उत्परिवर्ती संस्करण का उपयोग करना जिसमें एक सीएमपी-बाध्यकारी प्रोटीन मॉइटी डाला गया है, यह सीएमपी परख इंट्रासेल्युलर सीएमपी एकाग्रता30 में परिवर्तन के माध्यम से जीपीसीआर गतिविधि की निगरानी के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। यह एक संवेदनशील और गैर रेडियोधर्मी कार्यात्मक परख है और दवा की खोज प्रयोजनों के लिए जीपीसीआर की एक विस्तृत श्रृंखला के वास्तविक समय डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग की निगरानी के लिए लागू किया जा सकताहै।
यहां, एस 1 पीआर के सक्रियण और दवा मान्यता मोड को हल करने में महत्वपूर्ण तरीकों का सारांश प्रदान किया गया है, जिसमें मुख्य रूप से क्रायो-ईएम जोड़तोड़ और जीआई-निषेध सीएमपी परख शामिल हैं। इस लेख का उद्देश्य जीपीसीआर की संरचनाओं और कार्यों में आगे के अन्वेषणों के लिए व्यापक प्रयोगात्मक मार्गदर्शन प्रदान करना है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

लाइसोफॉस्फोलिपिड्स (एलपीएल) बायोएक्टिव लिपिड हैं जिनमें स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट (एस 1 पी), लाइसोफॉस्फेटिडिक एसिड आदि शामिल हैं। एस 1 पी, कोशिका झिल्ली में स्फिंगोलिपिड्स का एक चयापचय उत्पाद, सबसे अच्छी विशेषता वाले एलपीएल में से एक है जो स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट रिसेप्टर्स (एस 1 पीआर) द्वारा मध्यस्थता वाले सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से विभिन्न प्रकार की सेलुलर शारीरिक प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है। इससे पता चलता है कि एस 1 पी-एस 1 पीआर सिग्नलिंग सिस्टम मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस), ऑटोइम्यून विकार, कैंसर, सूजन और यहां तक कि सीओवीआईडी -19 सहित विकारों के लिए एक उल्लेखनीय संभावित चिकित्सीय लक्ष्य है। एस 1 पीआर, वर्ग ए जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) परिवार का एक छोटा सबसेट, पांच उपप्रकारों से बना है: एस 1 पीआर 1, एस 1 पीआर 2, एस 1 पीआर 3, एस 1 पीआर 4 और एस 1 पीआर 5। विस्तृत संरचनात्मक जानकारी की कमी, हालांकि, एस 1 पीआर को लक्षित करने वाली दवा की खोज में बाधा डालती है। यहां, हमने एस 1 पी-एस 1 पीआर कॉम्प्लेक्स की संरचना को हल करने के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधि लागू की, और सेल-आधारित कार्यात्मक परख का उपयोग करके सक्रियण, चयनात्मक दवा मान्यता और जी-प्रोटीन युग्मन के तंत्र को स्पष्ट किया। इस रणनीति का उपयोग करके अन्य लाइसोफॉस्फोलिपिड रिसेप्टर्स (एलपीएलआर) और जीपीसीआर का भी अध्ययन किया जा सकता है।

एस 1 पीआर-जीआई कॉम्प्लेक्स के नमूने को ठंडा करने से पहले, शुद्ध नमूने को आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा अलग करने और जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी के साथ विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है। <stro...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

एस 1 पी एस 1 पी रिसेप्टर्स (एस 1 पीआर) उपपरिवार के माध्यम से अपने विविध शारीरिक प्रभाव डालता है। यहां, एस 1 पीआर की संरचनाओं और कार्य पर विस्तार करने के लिए एक पाइपलाइन का वर्णन किया गया है।

स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट रिसेप्टर्स की संरचनाओं और सिग्नलिंग मार्गों की जांच करने के लिए एक पाइपलाइन

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

हमने चालक दल, ईएम जोड़तोड़ और जीआई इनहैब राज्य ए एम पी ए द्वारा एस 1 पीआरएस के सक्रियण और दवा पुनर्गणना मूड को संबोधित किया और एक दवा विकसित करने के लिए कम महत्वपूर्ण नींव जो ठोस रूप से एस 1 पीआरएस प्रगति को लक्षित करती है ताकि जीपी जेडआर उत्तेजना या निवास के मैग्निस्टिक अंडरपेंटिंग को वायरुलाइज करना संभव हो सके और टी बीसीआर लक्षित दवा निर्माण के लिए सामान्य बाध्यकारी साइटों को उजागर करने में और लाभ हो। नमूने की गुणवत्ता सही ईएम प्रयोग में सब कुछ के लिए नींव है। सरल तैयारी के लिए आवश्यक कारकों में एसएफ लाइन बिक्री के विभिन्न उत्पाद राज्य और एक एन जी एकाग्रता शामिल है प्रक्रिया का प्रदर्शन हेली वांग मेरे स्तर से स्नातक छात्र होगा।प्रोटीन शोधन के लिए इस उंगली दृश्य को लोड करें एक फॉस्फेट रिसेप्टर्स या एस एक पी आर एस जी प्रोटीन जटिल समाधान एक आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी या एस ई सी जेल निस्पंदन स्तंभ के लिए एस ई सी बफर के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर पूर्व संतुलित। क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एकत्रित अंशों का उपयोग करने के लिए उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर 1, 300 एक्सजी पर 100 किलोडाल्टन कटऑफ कंसंट्रेटर का उपयोग करके ध्यान केंद्रित करें। कणों के प्रारंभिक वर्गीकरण में 2 डी वर्गीकरण के लिए डेटा प्रोसेसिंग के दौरान सॉफ्टवेयर पर भरोसा करें में 2 डी वर्गीकरण फ़ंक्शन चुनें और आईओ विकल्प में इनपुट छवियों स्टार फ़ाइल के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें।फिर कणों.स्टार का चयन करें। इसके बाद, अनुकूलन विकल्प में, कक्षाओं की संख्या 100 और मुखौटा व्यास ए को 140 पर सेट करें। गणना विकल्प में, पूल किए गए कणों की संख्या 10 पर सेट करें और निर्देशिका क्षेत्र को खरोंचने के लिए कॉपी कण में तेज, तेज़ स्थानीय ड्राइव से निर्देशिका दर्ज करें।तेजी से प्रसंस्करण के लिए, उपयोग किए गए जीपीयू त्वरण के लिए हाँ का चयन करें। टेम्पलेट्स के रूप में अच्छे 2 डी परिणामों के सबसेट चयन के लिए, सबसेट चयन फ़ंक्शन के आईओ विकल्प पर जाएं और मॉडल.स्टार से चुनिंदा कक्षाओं के दाईं ओर ब्राउज़ पर क्लिक करें। इसके बाद, run_it025_model चुनें।इनपुट के रूप में स्टार और पॉप-अप विंडो चेक सॉर्ट छवियों में रन पर क्लिक करें और रिवर्स सॉर्ट करें। इसके बाद डिस्प्ले पर क्लिक करें। ऑटो-पिकिंग फ़ंक्शन के संदर्भ के लिए संदर्भ के रूप में अच्छे प्रतिनिधि 2 डी परिणाम चुनने के बाद, राइट क्लिक करें और चयनित कक्षाओं को सहेजें का चयन करें।ऑटो पिकिंग के दूसरे दौर के लिए टेम्पलेट का उपयोग करने के लिए, ऑटो पिकिंग फ़ंक्शन के आईओ विकल्प पर जाएं। ऑटो पिक के लिए इनपुट माइक्रोग्राफ के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें, और माइक्रोग्राफ.स्टार चुनें। फिर 2 डी संदर्भों के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और class_averages.स्टार चुनें।इसके अलावा, गाऊसी के लिए या लेप्लोसियन का उपयोग न करें। अगला, कॉर्ड अंडरस्कोर प्रत्यय का उपयोग करके कण निष्कर्षण करें ऑटो पिक.स्टार को रेखांकित करें। कणों का उपयोग करके 2 डी वर्गीकरण करें।स्टार, रन का उपयोग करके सबसेट चयन के बाद इसे शून्य 20 five_optimizer रेखांकित करता है। स्टार कण निष्कर्षण के लिए, आईओ विकल्प में माइक्रोग्राफ स्टार फ़ाइल के दाईं ओर ब्राउज़ करने के बाद, माइक्रोग्राफ चुनें। स्टार और परिष्कृत कणों के लिए हाँ का चयन करें या फिर से निकालें।परिष्कृत कण स्टार फ़ाइल के दाईं ओर ब्राउज़ करने पर क्लिक करने के बाद, कणों का चयन करें। एक प्रारंभिक 3 डी मॉडल और एक संदर्भ मानचित्र उत्पन्न करने के लिए स्टार, आईओ विकल्प में इनपुट छवियों स्टार फ़ाइल के दाईं ओर 3 डी प्रारंभिक मॉडल के ब्राउज़ पर क्लिक करें और पिछले कणों.स्टार चुनें। फिर अनुकूलन विकल्प में, कक्षाओं की संख्या को एक और मुखौटा व्यास ए को 140 पर सेट करें।3 डी वर्गीकरण के लिए और कणों का चयन करने के बाद प्रारंभिक 3 डी मानचित्र उत्पन्न करना। स्टार जैसा कि पहले दिखाया गया है, संदर्भ मानचित्र के दाईं ओर ब्राउज़ करें पर क्लिक करें और प्रारंभिक अंडरस्कोर मॉडल डॉट एमआरसी चुनें। फिर, अनुकूलन विकल्प में, कक्षाओं की संख्या को चार से छह और मुखौटा व्यास ए को 140 पर सेट करें।मास्क पीढ़ी के लिए, आईओ विकल्प में इनपुट के रूप में एक अच्छा 3 डी मानचित्र चुनने के बाद, प्रारंभिक बिनाराइजेशन थ्रेसहोल्ड को 0.05 पर सेट करें, और बाइनरी मैप को कई पिक्सेल में तीन तक बढ़ाएं। इसके बाद, मास्क विकल्प पर जाएं और सेट करें। इस कई पिक्सेल को आठ में नरम किनारे जोड़ें।अगले प्रसंस्करण के लिए, ट्रिनो स्पार्क सॉफ़्टवेयर खोलें, एक नया कार्यक्षेत्र बनाएं, और पहली नौकरी के लिए जॉब बिल्डर पर क्लिक करें। कण स्टैक आयात करने के लिए, कण मेटा पथ क्षेत्र में कण पथ और कण डेटा पथ क्षेत्र में फिल्म पथ दर्ज करें। अगला, वॉल्यूम डेटा पथ में पहले उत्पन्न सर्वोत्तम 3 डी वॉल्यूम का पथ दर्ज करके और आयात किए जा रहे वॉल्यूम के प्रकार के लिए मास्क का चयन करके 3 डी वॉल्यूम आयात करें।गैर-समान शोधन के लिए, गैर-समान शोधन कण के इनपुट के रूप में पहले से उत्पन्न आयातित अंडरस्कोर कणों को खींचें। आयातित अंडरस्कोर वॉल्यूम, गैर-समान शोधन वॉल्यूम वॉल्यूम वॉल्यूम के इनपुट के रूप में एक को रेखांकित करें और आयातित अंडरस्कोर मास्क एक को गैर-समान शोधन मास्क के इनपुट के रूप में रेखांकित करता है। नकाब। अगला, संसाधित करना प्रारंभ करने के लिए Q क्लिक करें और एक अच्छा रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ।एस 1 पीआरजीआई 3 डी मानचित्र। प्लास्मिड निर्माण और क्षणिक अभिकर्मक की तैयारी के बाद, अभिकर्मक अभिकर्मक बफर के 200 माइक्रोलीटर में तैयार डीएनए के दो माइक्रोग्राम जोड़ें। 10 सेकंड के लिए भंवर द्वारा मिलाएं और उपयोग करने से पहले मिश्रण को संक्षेप में कताई करें।अभिकर्मक अभिकर्मक के चार माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे भंवर और कताई द्वारा मिलाएं जैसा कि पहले दिखाया गया है। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब सेते हैं के बाद, धीरे धीरे अभिकर्मक मिश्रण के 200 माइक्रोलीटर चोक एक कोशिकाओं युक्त एक छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में ड्रॉप और धीरे प्लेट या पूरी तरह से मिश्रण हिला। इनक्यूबेशन के चार से छह घंटे के बाद, इनक्यूबेटर को प्लेट वापस करने से पहले एफ 12 मध्यम और 10% एफबीएस से युक्त सेल विकास माध्यम के साथ अभिकर्मक माध्यम को प्रतिस्थापित करें।कोशिकाओं की ट्रांससेक्शन कटाई के 24 से 48 घंटे बाद, डी लूसिफेरियन पोटेशियम नमक के साथ एसए बफर के तीन मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित करें। फिर एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे मिश्रित 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 90 माइक्रोलीटर जोड़ें और 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। प्रतिदीप्ति संकेत निर्धारण के लिए, सबसे पहले, डीएमएस ओ में सिपोनिमोड के 10 मिलीमोलर स्टॉक समाधान तैयार करें फिर 25 माइक्रोमोलर फोर्स्केलिन युक्त एचबीएस बफर में एक धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाएं और 30 मिनट के लिए इस एगोनिस्ट समाधान के विभिन्न सांद्रता के 10 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें।अगला, पता लगाने की विधि के लिए ल्यूमिनेसेंस का चयन करके माइक्रोप्लेट रीडर में ल्यूमिनेसेंस सिग्नल की गणना करें। पढ़ने के प्रकार के लिए समापन बिंदु, और संबंधित सॉफ़्टवेयर में प्रकाशिकी प्रकार के लिए ल्यूमिनेसेंस फाइबर। इसके अलावा, प्रकाशिकी लाभ को 255 पर सेट करें।फिर प्राप्त प्रतिदीप्ति संकेत मूल्यों को स्प्रेडशीट प्रोग्राम में आयात करें, और गैर-रैखिक प्रतिगमन वक्र फिट खुराक प्रतिक्रिया फ़ंक्शन का उपयोग करके डेटा को संसाधित करें। एस 1 पीआरएस जीआई कॉम्प्लेक्स को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा सफलतापूर्वक शुद्ध किया जा सकता है, जिसे एसडीएस पृष्ठ द्वारा सत्यापित किया गया था। इसके अलावा, इस अध्ययन में पीछा किया गया इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल स्पष्ट और अच्छी तरह से परिभाषित 2 डी वर्गों और खराब गुणवत्ता वाले कणों के साथ एस 1 पीआरएसजीआई कणों के बीच अंतर करने में प्रभावी था।इसके अलावा, एक अच्छे रिज़ॉल्यूशन के साथ एस 1 पीआर 3 जीआई का एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी मानचित्र गैर-समान शोधन के माध्यम से फ्यूरियर शेल सहसंबंध द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। संरचनात्मक विश्लेषण के बाद, एस एक पीआर तीन के लिए कार्यात्मक परख रिसेप्टर और सेंसर प्लास्मिड के साथ सी एच ओ के एक कोशिकाओं के अभिकर्मक द्वारा किया गया था, जिससे पता चला कि एक से तीन के सेंसर प्लास्मिड अनुपात के लिए रिसेप्टर प्लास्मिड इष्टतम परिणाम उत्पन्न करता है। हालांकि, परिणाम बिल्ली 2 93 कोशिकाओं में कम यथार्थवादी थे उस प्रसंस्करण में, कण अनुभाग में एल्गोरिदम की पसंद और 2 डी और 3 डी वर्गीकरण का खंड विशेष रूप से लीक और ईसीएफ मॉडलिंग के लिए एमपीएस जी प्रोटीन परिसरों को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

संकेतन प्रोटीन के समारोह की नक़ल करना: की ओर कृत्रिम संकेत पारगमन थेरेपी

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

रेडियो-लेबल वाली जीटीपी बाइंडिंग के माध्यम से जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर सिग्नलिंग को मापना

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Caspase सक्रियण Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता का उपयोग करने के लिए रास्ते प्रकाश

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

एक विधि के रूप में अनुमापन एलिसा रिसेप्टर Ligand बातचीत के पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित करने के लिए

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

माइक्रोबायल प्रोटीन और विशेष मेटाबोलाइट डेटा के विश्लेषण के लिए ओपन-स्रोत MALDI TOF-MS IDBac पाइपलाइन का उपयोग करना

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

वयस्क ज़ेब्राफ़िश में Orexin और Endocannabinoid रिसेप्टर्स की पहचान इम्यूनोपर्क्सीडेज और इम्यूनोफ्लोरेसींस तरीकों का उपयोग

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

सफल क्रिस्टलीकरण के लिए विजुअल जीपीसीआर-मिनी-जी प्रोटीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की रणनीतिक स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

फ्लोरोसेंट रिसाव परख सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड द्वारा झिल्ली अस्थिरता की जांच करने के लिए

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

वीएमएक्सएम बीमलाइन में माइक्रोक्रिस्टल के लिए एक नमूना तैयारी पाइपलाइन

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

एक समय में स्थिर स्थानीय संरचना एक α-सिन्यूक्लिन मोनोमर की पहचान करने के लिए समय-संकल्पित प्रोटीन-प्रेरित फ्लोरेसेंस एन्हांसमेंट का उपयोग करना

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...