Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
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I dati del complesso S1PRs-Gi sono stati raccolti presso il West China Cryo-EM Center dell'Università del Sichuan e il Cryo-EM Center presso la Southern University of Science and Technology (SUSTech) ed elaborati presso il Duyu High-Performance Computing Center dell'Università del Sichuan. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation of China (32100965 a L.C., 32100988 a W.Y., 31972916 a Z.S.) e dal Fondo di ricerca post-dottorato a tempo pieno dell'Università del Sichuan (2021SCU12003 a L.C.)

1. Purificazione del complesso proteico S1PRs-G
<ol><li>Per purificare il complesso proteico umano S1PRs-G, clonare i cDNA di S1PR1 privi di residui C-terminali 338-382, il wild-type S1PR3, S1PR5 troncato con 345-398 al C-terminale, e il wild-type Gi1 nel vettore pFastBac1 e i cDNA del wild-type Gβ1 e Gγ2 nel vettore pFastBacdual (Table of Materials). NOTA: Tutti i costrutti per S1PR contengono anche la sequenza di segnali emoagglutinina (HA) seguita da un tag epitopo Flag al N-te...

Questo protocollo descrive una pipeline primaria per determinare le strutture degli S1PR mediante crio-EM e misurare la potenza di attivazione degli S1PR mediante il saggio di inibizione del cAMP mediato da Gi. Alcuni passaggi sono cruciali per il successo dell'esperimento.
Per purificare il complesso S1PRs-Gi, la qualità del virus e la salute delle cellule sf9 dovrebbero essere prestate maggiore attenzione. L'espressione del recettore è drasticamente ridotta nelle cellule sf9</...

La sfingosina-1-fosfato (S1P), un prodotto metabolico degli sfingolipidi nella membrana cellulare, è una molecola di segnalazione lisofosfatidica ubiquitaria che coinvolge varie attività biologiche, tra cui il traffico linfocitario, lo sviluppo vascolare, l'integrità endoteliale e la frequenza cardiaca 1,2,3. S1P esercita i suoi diversi effetti fisiologici attraverso cinque sottotipi di recettori S1P (S1PRs 1-5); Le S1PR si trovano in una varietà di tessuti e mostrano preferenze uniche per le proteine G a valle 4,5. S1PR1 è principalmente accoppiato con la proteina Gi, che successivamente inibisce la produzione di cAMP; S1PR2 e S1PR3 sono accoppiati con Gi, Gq e G12/13, e S1PR4 e S1PR5 trasducono il segnale attraverso Gi e G12/136.
La segnalazione S1P-S1PR è un bersaglio terapeutico critico per molteplici malattie, tra cui i disturbi autoimmuni7, l'infiammazione8, il cancro9 e persino COVID-1910. Nel 2010, fingolimod (FTY720) è stato autorizzato come farmaco di prima classe mirato agli S1PR per il trattamento della sclerosi multipla recidivante (SM)11. Tuttavia, è in grado di legarsi a tutti gli S1PR tranne S1PR2, mentre il legame non specifico a S1PR3 provoca edema della corteccia cerebrale, costrizione vascolare e bronchiale e perdita epiteliale polmonare12. Come strategia alternativa per aumentare la selettività terapeutica, sono stati prodotti ligandi sottotipo-specifici per il recettore. Siponimod (BAF312) è stato approvato nel 2019 per il trattamento della SM recidivante13; si rivolge efficacemente a S1PR1 e S1PR5, mentre non ha affinità per S1PR3, mostrando meno effetti collaterali nella pratica clinica14. Nel 2020, la Food and Drug Administration degli Stati Uniti ha autorizzato ozanimod per la terapia della SM15. È stato riportato che ozanimod detiene una selettività 25 volte maggiore per S1PR1 rispetto a S1PR516. In particolare, nel contesto dell'attuale pandemia di COVID-19, è stato scoperto che i farmaci agonisti che hanno come bersaglio le S1PR possono essere utilizzati per trattare COVID-19 utilizzando tecniche di terapia immunomodulatoria17. Rispetto a fingolimod, ozanimod ha mostrato superiorità nel ridurre i sintomi nei pazienti COVID-19 ed è ora in fase di sperimentazione clinica10. La comprensione delle basi strutturali e della funzione delle S1PR pone una base significativa per lo sviluppo di un farmaco che colpisca selettivamente le S1PR18.
Molte tecniche sono utilizzate per studiare le informazioni strutturali delle biomacromolecole, tra cui la cristallografia a raggi X, la risonanza magnetica nucleare (NMR) e la microscopia elettronica (EM). A partire da marzo 2022, ci sono più di 180.000 strutture depositate sulla Protein Databank (PDB) e la maggior parte di esse è stata risolta dalla cristallografia a raggi X. Tuttavia, con la prima struttura di risoluzione quasi atomica di TPRV1 (risoluzione 3,4 Å) riportata da Yifan Cheng e David Julius nel 201319, la microscopia crioelettronica (crio-EM) è diventata una tecnica mainstream per le strutture proteiche e il numero totale di strutture PDB EM era superiore a 10.000. Le aree critiche di svolta sono lo sviluppo di nuove telecamere per l'imaging note come telecamere a rilevamento diretto di elettroni e nuovi algoritmi di elaborazione delle immagini. Cryo-EM ha rivoluzionato la biologia della struttura e la scoperta di farmaci basati sulla struttura nell'ultimo decennio20. Poiché comprendere come i complessi macromolecolari svolgono i loro complicati ruoli nella cellula vivente è un tema centrale nelle scienze biologiche, la crio-EM ha il potenziale per rivelare conformazioni di complessi molecolari dinamici, in particolare per le proteine transmembrana21. I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) sono la più grande superfamiglia di proteine transmembrana e il bersaglio di oltre il 30% dei farmaci attualmente commercializzati22. Lo sviluppo della crio-EM ha contribuito a un'esplosione di strutture ad alta risoluzione di complessi proteici GPCR-G, consentendo la determinazione strutturale di bersagli "intrattabili" che non sono ancora accessibili all'analisi cristallografica a raggi X nella progettazione di farmaci23. Quindi, l'applicazione crio-EM offre la possibilità di determinare la struttura tridimensionale dei GPCR in condizioni quasi native a una risoluzione atomica vicina a24. I progressi nella crio-EM rendono possibile visualizzare le basi meccanicistiche della stimolazione o dell'inibizione della GPCR e ulteriori benefici nello scoprire i nuovi siti di legame per la creazione di farmaci mirati al GPCR25.
Basandosi sugli enormi progressi della tecnologia crio-EM, abbiamo identificato strutture di complessi di segnalazione agonizzati S1PR1-, S1PR3- e S1PR5-Gi recentemente26,27. Nell'uomo, gli S1PR si trovano in vari tessuti e mostrano preferenze uniche per le proteine G a valle 4,5. S1PR1 è principalmente accoppiato con la proteina Gi, che successivamente inibisce la produzione di 3′,5′-adenosina monofosfato ciclico (cAMP). S1PR3 e S1PR5 sono anche in grado di accoppiarsi con Gi 6,28. Poiché l'attivazione del recettore accoppiato a Gi diminuisce la produzione di cAMP29, è stato introdotto un test di inibizione del cAMP per misurare gli effetti di inibizione del cAMP per catturare le alterazioni funzionali26,27. Utilizzando una versione mutante di Photinus pyralis luciferasi in cui è stata inserita una porzione proteica legante il cAMP, questo test cAMP offre un metodo semplice e affidabile per monitorare l'attività GPCR attraverso cambiamenti nella concentrazione intracellulare di cAMP30. Si tratta di un saggio funzionale sensibile e non radioattivo e può essere applicato per monitorare la segnalazione a valle in tempo reale di un'ampia gamma di GPCR ai fini della scoperta di farmaci31.
Qui, viene fornito un riepilogo dei metodi critici per risolvere le modalità di attivazione e riconoscimento dei farmaci di S1PR, includendo principalmente manipolazioni crio-EM e un test di inibizione Gi-cAMP. Questo articolo ha lo scopo di fornire una guida sperimentale completa per ulteriori esplorazioni nelle strutture e nelle funzioni dei GPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

I lisofosfolipidi (LPL) sono lipidi bioattivi che includono sfingosina 1-fosfato (S1P), acido lisofosfatidico, ecc. S1P, un prodotto metabolico degli sfingolipidi nella membrana cellulare, è uno degli LPL meglio caratterizzati che regola una varietà di risposte fisiologiche cellulari tramite vie di segnalazione mediate dai recettori della sfingosina 1-fosfato (S1PR). Ciò implicava che il sistema di segnalazione S1P-S1PRs è un notevole potenziale bersaglio terapeutico per disturbi, tra cui la sclerosi multipla (SM), i disturbi autoimmuni, il cancro, l'infiammazione e persino COVID-19. Gli S1PR, un piccolo sottoinsieme della famiglia dei recettori accoppiati alla proteina G di classe A (GPCR), sono composti da cinque sottotipi: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 e S1PR5. La mancanza di informazioni strutturali dettagliate, tuttavia, impedisce la scoperta di farmaci mirati agli S1PR. Qui, abbiamo applicato il metodo della microscopia crioelettronica per risolvere la struttura del complesso S1P-S1PRs e abbiamo chiarito il meccanismo di attivazione, riconoscimento selettivo dei farmaci e accoppiamento della proteina G utilizzando saggi funzionali basati su cellule. Altri recettori lisofosfolipidi (LPLR) e GPCR possono anche essere studiati utilizzando questa strategia.

Prima di congelare il campione del complesso S1PRs-Gi, il campione purificato deve essere separato mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e analizzato con cromatografia a filtrazione su gel. La Figura 2 mostra il complesso S1PR3-Gi come esempio. La frazione di picco del complesso proteico omogeneo GPCR-G era solitamente localizzata a ~ 10,5 ml della cromatografia di esclusione dimensionale (Figura 2A). L'analisi della pagina SDS del complesso S1...

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A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P esercita i suoi diversi effetti fisiologici attraverso la sottofamiglia dei recettori S1P (S1PR). Qui viene descritta una pipeline per illustrare le strutture e la funzione degli S1PR.

Una pipeline per studiare le strutture e le vie di segnalazione dei recettori della sfingosina 1-fosfato

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Abbiamo affrontato gli stati d'animo di attivazione e ricalcolo del farmaco di S1PRS da parte dell'equipaggio, le manipolazioni EM e lo stato di inhab GI A M P A e basi meno significative per lo sviluppo di un farmaco che mira solidamente a S1PRS I progressi rendono possibile virulizzare i sottodipinti ingranditi della stimolazione o dell'abitazione di GP ZR e ulteriori benefici nello scoprire i normali siti di legame per la creazione di farmaci mirati a T BCR. La qualità del campione è la base per tutto Nell'esperimento EM corretto. I fattori essenziali per una preparazione semplice includono vari stati del prodotto della vendita della linea SF e una concentrazione N g A dimostrare la procedura sarà Heli Wang uno studente laureato dal mio livello.Per il carico di purificazione delle proteine questa scena del dito uno recettori fosfato o S uno P R S G soluzione complessa proteica ad una cromatografia di esclusione dimensionale o colonna di filtrazione gel S E C pre equilibrata con tampone S E C ad una portata di 0,5 millilitri al minuto a quattro gradi Celsius. Per utilizzare le frazioni raccolte per la microscopia crioelettronica, concentrarle usando un concentratore di taglio da 100 kilodalton a 1.300 XG a quattro gradi Celsius. Durante l'elaborazione dei dati per la classificazione 2D nella classificazione preliminare delle particelle, scegliere la funzione di classificazione 2D nel software Rely On e fare clic su Sfoglia a destra del file stella delle immagini di input nell'opzione IO.Quindi scegli particles.star. Quindi, nell'opzione di ottimizzazione, impostare il numero di classi su 100 e il diametro della maschera A su 140. Nell'opzione di calcolo, impostare il numero di particelle raggruppate su 10 e immettere la directory da un'unità locale veloce e veloce nel campo della directory copia particella a scratch.Per un'elaborazione più rapida, selezionare sì per l'accelerazione GPU utilizzata. Per la selezione di sottoinsiemi di buoni risultati 2D come modelli, vai all'opzione IO della funzione di selezione dei sottoinsiemi e fai clic su sfoglia a destra delle classi selezionate da model.star. Quindi, scegli run_it025_model.Stella come input e fare clic su Esegui nella finestra pop-up Seleziona ordina immagini su e invertire l'ordinamento. Quindi fare clic su display. Dopo aver scelto buoni risultati 2D rappresentativi come riferimento per la funzione di selezione automatica, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Salva classi selezionate.Per utilizzare il modello per il secondo round di prelievo automatico, vai all'opzione IO della funzione di prelievo automatico. Fare clic su Sfoglia a destra delle micrografie di input per il prelievo automatico e scegliere micrographs.star. Quindi fare clic su Sfoglia a destra dei riferimenti 2D e scegliere class_averages.star.Inoltre, selezionare no per o utilizzare leplossian in di Gaussian. Quindi, eseguire l'estrazione delle particelle utilizzando il suffisso underscore del cordone underscore auto pick.star. Eseguire la classificazione 2D utilizzando le particelle.stella, seguita dalla selezione del sottoinsieme utilizzando run sottolineano zero 20 five_optimizer. stella Per l'estrazione delle particelle, dopo aver fatto clic su Sfoglia a destra del file a stella della micrografia nell'opzione IO, scegliere micrografie. Stella e selezionare Sì per o Estrai nuovamente particelle raffinate.Dopo aver fatto clic su Sfoglia a destra del file a stella delle particelle raffinate, selezionare le particelle. stella per generare un modello 3D iniziale e una mappa di riferimento, fare clic su sfoglia del modello iniziale 3D a destra del file stella delle immagini di input nell'opzione IO e scegliere il particles.star precedente. Quindi, nell'opzione di ottimizzazione, impostare il numero di classi su uno e il diametro della maschera A su 140.Per la classificazione 3D e la generazione di una mappa 3D preliminare, dopo aver selezionato le particelle. Come illustrato in precedenza, fare clic su Sfoglia a destra della mappa di riferimento e scegliere Initial Underscore Model dot MRC. Quindi, nell'opzione di ottimizzazione, impostare il numero di classi da quattro a sei e il diametro della maschera A su 140.Per la generazione della maschera, dopo aver selezionato una buona mappa 3D come input nell'opzione IO, impostare la soglia di binarizzazione iniziale su 0,05 e la mappa binaria estesa a questo numero di pixel su tre. Quindi, vai all'opzione maschera e imposta. Aggiungi un bordo morbido a questo numero di pixel fino a otto.Per l'elaborazione successiva, apri il software Trino Spark, crea una nuova area di lavoro e fai clic su job builder per il primo lavoro. Per importare la pila di particelle, immettere il percorso della particella nel campo del meta percorso delle particelle e il percorso dei filmati nel campo del percorso dei dati delle particelle. Quindi, importare i volumi 3D immettendo il percorso del miglior volume 3D generato in precedenza nel percorso dati del volume e selezionando la maschera per il tipo di volume da importare.Per un perfezionamento non uniforme, trascinate le particelle di sottolineatura importate generate in precedenza come input della particella delle particelle di perfezionamento non uniforme. Volume di sottolineatura importato, sottolineatura uno come input del volume di perfezionamenti non uniforme e maschera di sottolineatura importata sottolineano uno come input della maschera di perfezionamento non uniforme. Maschera. Quindi, fare clic su Q per avviare l'elaborazione e ripetere la procedura per ottenere una buona risoluzione.S1PRGI 3D mappa. Dopo la costruzione del plasmide e la preparazione per la trasfezione transitoria, aggiungere due microgrammi di DNA preparato in 200 microlitri di tampone reagente di trasfezione. Mescolare vorticando per 10 secondi e girando brevemente il composto prima dell'uso.Aggiungere quattro microlitri di reagente di trasfezione e mescolare per vortice e rotazione come dimostrato in precedenza. Dopo aver incubato il tubo a temperatura ambiente per 15 minuti, far cadere lentamente 200 microlitri della miscela di trasfezione in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente CHOK una cella e agitare delicatamente la piastra o la miscelazione accurata. Dopo quattro-sei ore di incubazione, sostituire il mezzo di trasfezione con il mezzo di crescita cellulare costituito da F 12 medio e 10% fbs prima di restituire la piastra all'incubatore.Da 24 a 48 ore dopo la raccolta delle cellule in transezione, sospendere le cellule in tre millilitri di un tampone SA con sale di potassio luciferino D. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 90 microlitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti mescolata delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti. Per la determinazione del segnale di fluorescenza, in primo luogo, preparare 10 millimolari di soluzioni madre di siponimod in D M S O.Quindi effettuare una diluizione seriale in tampone H B S S contenente 25 micromolari forscalina e stimolare le cellule con 10 microlitri di varie concentrazioni di questa soluzione agonista per 30 minuti.Quindi, contare il segnale di luminescenza in un lettore di micropiastre selezionando la luminescenza per il metodo di rilevamento. Endpoint per il tipo di lettura e fibra di luminescenza per il tipo di ottica nel software associato. Inoltre, impostare il guadagno ottico su 255.Quindi importare i valori del segnale di fluorescenza ottenuti in un programma di foglio di calcolo ed elaborare i dati utilizzando la funzione di risposta alla dose di adattamento della curva di regressione non lineare. Il complesso S1PRS GI potrebbe essere purificato con successo mediante cromatografia ad esclusione dimensionale, che è stata verificata dalla pagina SDS. Inoltre, il protocollo di microscopia elettronica seguito in questo studio è stato efficace nel differenziare tra particelle S1PRSGI con classi 2D chiare e ben definite e particelle di scarsa qualità.Inoltre, una mappa al microscopio elettronico di S1PR3 GI con una buona risoluzione potrebbe essere generata dalla correlazione del guscio più peloso attraverso un raffinamento non uniforme. Dopo l'analisi strutturale, sono stati eseguiti saggi funzionali per S uno P R tre mediante trasfezione di cellule C H O K one con plasmidi recettore e sensore, che hanno rivelato che il rapporto plasmide recettore/plasmide sensore di uno a tre produce risultati ottimali. Tuttavia, i risultati sono stati meno realistici in heck 2 93 cellule In tale elaborazione, la scelta degli algoritmi nella sezione delle particelle e nella sezione della classificazione 2D e 3D è importante per risolvere i complessi proteici così MPS G, in particolare per modellare le perdite e gli ecfs.

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Titolazione ELISA come un metodo per determinare la costante di dissociazione dell'interazione ligando del recettore

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Screening strategico e caratterizzazione del complesso di segnalazione delle proteine Visual GPCR-mini-G per una cristallizzazione di successo

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una pipeline di preparazione del campione per microcristalli presso la linea di fascio VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Utilizzo del miglioramento della fluorescenza indotta da proteine risolte nel tempo per identificare le conformazioni locali stabili un monomero α-sinucleina alla volta

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...