Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

S1PRs-Gi複合体のデータは、四川大学の華西クライオEMセンターと南方科技大学(SUSTech)のクライオEMセンターで収集され、四川大学のDuyu高性能コンピューティングセンターで処理されました。この研究は、中国自然科学財団(32100965からL.C.、32100988がW.Y.、31972916がZ.S.)と四川大学の専任ポスドク研究基金(2021SCU12003からL.C.)の支援を受けました。

1. S1PRs-Gタンパク質複合体の精製
<ol><li>ヒトS1PRs-Gタンパク質複合体を精製するには、C末端残基338~382を欠くS1PR1のcDNA、C末端に345~398で切り詰めた野生型S1PR3、S1PR5、および野生型Gi1をpFastBac1ベクターに、野生型Gβ1およびGγ2のcDNAをpFastBacdualベクターにクローニングする(材料表)。 注:S1PRのすべての構成物には、ヘマググルチニン(HA)シグナル配列とそれに続くN末端のFl...

このプロトコルは、クライオEMによってS1PRの構造を決定し、Gi媒介cAMP阻害アッセイによってS1PRの活性化効力を測定するための一次パイプラインを記述する。いくつかのステップは、実験の成功に不可欠です。
S1PRs-Gi複合体を精製するためには、ウイルスの質およびsf9細胞の健康状態にもっと注意を払うべきである。受容体の発現は、貧弱なsf9細胞において?...

細胞膜におけるスフィンゴ脂質の代謝産物であるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、リンパ球輸送、血管発達、内皮完全性、および心拍数1,2,3を含む様々な生物学的活性を含むユビキタスなリゾホスファチド性シグナル伝達分子である。S1Pは、5つのS1P受容体サブタイプ(S1PRs1〜5)を介して多様な生理学的効果を発揮する。S1PRは様々な組織に見られ、下流のGタンパク質に対して独特の嗜好を示す4,5。S1PR1は主にGiタンパク質と結合し、その後cAMP産生を阻害する。S1PR2 および S1PR3 は Gi、Gq、および G12/13 と結合され、S1PR4 および S1PR5 は Gi および G12/13 を介して信号を伝送します。
S1P-S1PRシグナル伝達は、自己免疫疾患7、炎症8、癌9、さらにはCOVID-1910を含む複数の疾患の重要な治療標的である。2010年、フィンゴリモド(FTY720)は、再発性多発性硬化症(MS)を治療するためのS1PRを標的とするクラス初の薬物として認可されました11。しかしながら、S1PR2を除く全てのS1PRsに結合することができるが、S1PR3への非特異的結合は、大脳皮質の浮腫、血管および気管支狭窄、ならびに肺上皮漏出をもたらす12。治療選択性を高めるための代替戦略として、受容体に対するサブタイプ特異的リガンドが産生されている。シポニモド(BAF312)は、再発MS治療のために2019年に承認されました13;S1PR1およびS1PR5を効果的に標的とするが、S1PR3に対する親和性はなく、臨床現場でより少ない副作用を示す14。2020年、米国食品医薬品局(FDA)はオザニモドをMS治療に承認しました15。オザニモドは、S1PR516よりもS1PR1に対して25倍大きい選択性を保持することが報告されている。特に、現在のCOVID-19パンデミックの文脈では、S1PRを標的とするアゴニスト薬が、免疫調節療法技術を使用してCOVID-19を治療するために利用され得ることが発見されている17。フィンゴリモドと比較して、オザニモドはCOVID-19患者の症状を軽減する上で優位性を示しており、現在臨床試験を受けています10。S1PRの構造的基礎と機能を理解することは、S1PRsを選択的に標的とする薬剤を開発するための重要な基盤を築く18。
生体高分子の構造情報を調べるには、X線結晶構造解析、核磁気共鳴(NMR)、電子顕微鏡(EM)など、多くの技術が用いられています。2022年3月現在、タンパク質データバンク(PDB)には18万以上の構造が堆積しており、そのほとんどはX線結晶構造解析によって解明されています。しかし、2013年にYifan ChengとDavid Juliusによって報告されたTPRV1の最初の原子分解能に近い分解能構造(3.4 Å分解能)19では、クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)がタンパク質構造の主流技術となり、EM PDB構造の総数は10,000を超えました。重要なブレークスルー分野は、直接電子検出カメラとして知られるイメージング用の新しいカメラと新しい画像処理アルゴリズムの開発です。Cryo-EMは、過去10年間で構造生物学と構造ベースの創薬に革命をもたらしました20。高分子複合体が生細胞内で複雑な役割を果たす方法を理解することは、生物科学の中心的なテーマであるため、クライオEMは、特に膜貫通タンパク質21について、動的分子複合体の立体構造を明らかにする可能性を秘めています。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、膜貫通タンパク質の最大のスーパーファミリーであり、現在市販されている医薬品の30%以上の標的である22。クライオEMの開発は、GPCR-Gタンパク質複合体の高分解能構造のバーストに貢献し、薬物設計におけるX線結晶学的解析にはまだアクセスできない「難治性」標的の構造決定を可能にした23。したがって、クライオEMアプリケーションは、原子分解能24に近いネイティブに近い条件下でGPCRの3次元構造を決定する機会を提供します。クライオEMの進歩により、GPCRの刺激または阻害の機構的基盤を視覚化することが可能になり、GPCR標的薬作成のための新規結合部位の解明にさらなる利益をもたらす25。
クライオEM技術の驚異的な進歩に依拠して、我々は最近、苦悶のS1PR1-、S1PR3-、およびS1PR5-Giシグナル伝達複合体の構造を特定した26,27。ヒトでは、S1PRは様々な組織に見出され、下流のGタンパク質に対して独特の嗜好を示す4,5。S1PR1は主にGiタンパク質と結合し、その後、3',5'-環状アデノシン一リン酸(cAMP)産生を阻害する。S1PR3およびS1PR5は、Gi 6,28との結合も可能である。Gi共役型受容体活性化はcAMP29の産生を減少させるので、機能的変化を捕捉するためのcAMP阻害効果を測定するためにGi阻害cAMPアッセイが導入された26、27。cAMP結合タンパク質部分が挿入されたPhotinus pyralis lucifereraseの変異バージョンを使用して、このcAMPアッセイは、細胞内cAMP濃度の変化を介してGPCR活性をモニタリングするための簡単で信頼性の高い方法を提供する30。これは、高感度で非放射性の機能アッセイであり、創薬目的で広範囲のGPCRのリアルタイムの下流シグナル伝達をモニターするために適用することができる31。
ここでは、S1PRの活性化モードと薬物認識モードを解決する上で重要な方法の概要が提供され、主にクライオ-EM操作とGi阻害cAMPアッセイが含まれます。本稿は、GPCRの構造と機能をさらに探求するための包括的な実験的ガイダンスを提供することを目的としている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

リゾリン脂質(LPL)は、スフィンゴシン1-リン酸(S1P)、リゾホスファチジン酸などを含む生理活性脂質である。細胞膜におけるスフィンゴ脂質の代謝産物であるS1Pは、スフィンゴシン1-リン酸受容体(S1PR)によって媒介されるシグナル伝達経路 を介して 様々な細胞生理学的応答を調節する最も特徴的なLPLの1つである。これは、S1P-S1PRsシグナル伝達系が、多発性硬化症(MS)、自己免疫障害、癌、炎症、さらにはCOVID-19を含む障害の顕著な潜在的な治療標的であることを示唆した。クラスAのGタンパク質共役型受容体(GPCR)ファミリーの小さなサブセットであるS1PRは、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、およびS1PR5の5つのサブタイプで構成されています。しかし、詳細な構造情報の欠如は、S1PRを標的とする創薬を妨げる。ここでは、S1P-S1PRs複合体の構造を解明するためにクライオ電子顕微鏡法を適用し、細胞ベースの機能アッセイを用いて、活性化、選択的薬物認識、Gタンパク質結合のメカニズムを解明しました。他のリゾリン脂質受容体(LPLR)およびGPCRも、この戦略を用いて研究することができる。

S1PRs-Gi複合体のサンプルを凍結する前に、精製サンプルをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で分離し、ゲルろ過クロマトグラフィーで分析する必要があります。 図2 は、S1PR3-Gi複合体を例に示している。均質なGPCR−Gタンパク質複合体のピーク画分は、通常、サイズ排除クロマトグラフィーの〜10.5mLに位置していた(図2A)。S1PR3-Gi複合体のSDSページ?...

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A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1Pは、S1P受容体(S1PR)サブファミリーを介して多様な生理効果を発揮する。ここでは、S1PR の構造と機能を説明するためのパイプラインについて説明します。

スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

乗組員、EM操作、消化管インハブ状態A M P AによるS1PRSの活性化と薬物再計算の気分と、S1PRSをしっかりと標的とする薬剤を開発するためのそれほど重要ではない基盤に取り組みました。 進歩により、GP ZR刺激または居住の壮大な下絵を可視化することが可能になり、T BCR標的薬物作成の正常な結合部位を明らかにする上でさらに利益が得られます。サンプルの品質は、正しいEM実験のすべての基盤です。簡単な準備に不可欠な要素には、SFライン販売のさまざまな製品状態とNg濃度が含まれます 手順のデモンストレーションは、私のレベルの大学院生であるHeli Wangになります。タンパク質精製のために、このフィンガーシーン一リン酸受容体またはS一P R SGタンパク質複合体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーまたはSECゲル濾過カラムに負荷し、摂氏4度で毎分0.5ミリリットルの流速でSEC緩衝液で予め平衡化した。収集した画分をクライオ電子顕微鏡に使用するには、摂氏4度で1, 300 XGの100キロダルトンカットオフ濃縮器を使用してそれらを濃縮します。粒子の予備分類での2D分類のデータ処理中に、Rely Onソフトウェアで2D分類機能を選択し、[IO]オプションで入力画像のスターファイルの右側にある[参照]をクリックします。次に、パーティクルスターを選択します。次に、最適化オプションで、クラス数を100に設定し、マスク直径Aを140に設定します。コンピューティング オプションで、プールされたパーティクルの数を 10 に設定し、高速のローカル ドライブから [パーティクルをスクラッチ ディレクトリにコピー] フィールドにディレクトリを入力します。処理を高速化するには、使用するGPUアクセラレーションに対して[はい]を選択します。良好な2D結果をテンプレートとしてサブセット選択するには、サブセット選択関数のIOオプションに移動し、model.starから選択したクラスの右側にある参照をクリックします。次に、[run_it025_model] を選択します。入力としてスターを付け、ポップアップウィンドウで[実行]をクリックして、[画像の並べ替え]と[逆並べ替え]をオンにします。次に、ディスプレイをクリックします。自動ピッキング機能の参照の参照として適切な代表的な2D結果を選択した後、右クリックして選択したクラスを保存を選択します。自動ピッキングの2回目のラウンドにテンプレートを使用するには、自動ピッキング機能のIOオプションに移動します。自動ピックの入力顕微鏡写真の右側にある参照をクリックし、micrographs.starを選択します。次に、2D参照の右側にある[参照]をクリックし、[class_averages.star]を選択します。また、ガウス分布の no を選択するか、レプロシアンを使用します。次に、コードアンダースコアサフィックスアンダースコアautopick.starを使用してパーティクル抽出を実行します。パーティクルを使用して 2D 分類を実行します。スター、続いて実行アンダースコアを使用してサブセットを選択し、ゼロ20 five_optimizerします。星 粒子抽出の場合は、[IO]オプションで顕微鏡写真の星形のファイルの右側にある[参照]をクリックした後、[顕微鏡写真]を選択します。スターを付けて、[はい]を選択するか、精製されたパーティクルを再抽出します。[リファインされたパーティクル]スター ファイルの右側にある[参照]をクリックした後、[パーティクル]を選択します。星初期3Dモデルと参照マップを生成するには、IOオプションで入力画像の星ファイルの右側にある3D初期モデルの参照をクリックし、前のparticles.starを選択します。次に、最適化オプションで、クラスの数を1に設定し、マスクの直径Aを140に設定します。3D分類と予備的な3Dマップの生成のために、粒子を選択した後。スター 前に示したように、参照マップの右側にある [参照] をクリックし、[初期アンダースコア モデル ドット MRC] を選択します。次に、最適化オプションで、クラスの数を4〜6に設定し、マスク直径Aを140に設定します。マスク生成では、IOオプションで入力として適切な3Dマップを選択した後、初期二値化しきい値を0.05に設定し、このピクセル数への拡張バイナリマップを3に設定します。次に、マスクオプションに移動して設定します。この多くのピクセルにソフトエッジを8に追加します。次の処理では、Trino Sparkソフトウェアを開き、新しいワークスペースを作成して、最初のジョブのジョブビルダーをクリックします。パーティクルスタックを読み込むには、「パーティクル」メタパスフィールドにパーティクルパスを入力し、「パーティクルデータパス」フィールドにムービーパスを入力します。次に、以前に生成された最適な 3D ボリュームのパスをボリュームデータパスに入力し、インポートするボリュームの種類のマスクを選択して、3D ボリュームをインポートします。不均一な細分化を行うには、以前に生成されたインポートされたアンダースコア パーティクルを、不均一な細分化パーティクルの入力としてドラッグします。インポートされたアンダースコアボリューム、不均一な細分化ボリュームの入力としてアンダースコア1、およびインポートされたアンダースコアマスクは、不均一な細分化マスクの入力として1を下線します。マスク。次に、Qをクリックして処理を開始し、手順を繰り返して良好な解像度を取得します。S1PRGI 3Dマップ。プラスミドを構築し、一過性トランスフェクションの準備をした後、調製したDNAを200マイクロリットルのトランスフェクション試薬バッファーに加えます。使用前に10秒間ボルテックスし、混合物を短時間回転させて混合します。4マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、前述のようにボルテックスとスピニングによって混合します。チューブを室温で15分間インキュベートした後、CHOK 1細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルのトランスフェクションミックスをゆっくりと滴下し、プレートを静かに振るか、完全に混合します。4〜6時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターに戻す前に、トランスフェクション培地をF 12培地と10%fbsからなる細胞増殖培地と交換します。細胞の切断採取後24〜48時間に、Dルシフェリアンカリウム塩を含む3ミリリットルのSA緩衝液中に細胞を懸濁する。次いで、マルチチャンネルピペットを用いて、穏やかに混合した96ウェルプレートの各ウェルに90マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、室温で40分間インキュベートする。蛍光シグナル測定のために、まず、DMS O中のシポニモドの10ミリモルストック溶液を調製し、次に25マイクロモルのフォルスカリンを含むH B S Sバッファーで段階希釈を行い、このアゴニスト溶液の10マイクロリットルの様々な濃度で細胞を30分間刺激します。次に、検出方法のために発光を選択してマイクロプレートリーダーで発光信号をカウントする。読み取りタイプのエンドポイント、および関連付けられたソフトウェアの光学タイプの発光ファイバー。また、光学ゲインを255に設定します。次に、得られた蛍光シグナル値をスプレッドシートプログラムにインポートし、非線形回帰曲線フィット線量反応関数を使用してデータを処理します。S1PRS GI複合体は、SDSページで検証されたサイズ排除クロマトグラフィーによって正常に精製できました。さらに、この研究で従った電子顕微鏡プロトコルは、明確で明確に定義された2Dクラスを持つS1PRSGI粒子と低品質の粒子を区別するのに効果的でした。さらに、S1PR3 GIの電子顕微鏡マップは、不均一な微細化によるフリアーシェル相関によって良好な分解能で生成できる可能性があります。構造解析後、受容体とセンサープラスミドを用いたC H O K 1細胞のトランスフェクションにより、S one P R 3の機能アッセイを行い、受容体プラスミドとセンサープラスミドの比率が1対3で最適な結果が得られることが明らかになりました。しかし、結果は、その処理において、粒子セクションおよび2Dおよび3D分類のセクションでのアルゴリズムの選択は、特にリークおよびECFをモデル化するためにMPS Gタンパク質複合体を解決するために重要である。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

受容体リガンドの相互作用の解離定数の決定法として elisa 法の滴定

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

微生物タンパク質および特殊代謝産物データの分析にオープンソースのMALDI TOF-MS IDBacパイプラインを使用

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光法を用いて成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の同定

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

結晶化を成功させるための視覚的GPCR-mini-Gタンパク質シグナル伝達複合体の戦略的スクリーニングと特性評価

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXmビームラインにおける微結晶のサンプル調製パイプライン

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...