Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

S1PRs-Gi 복합체의 데이터는 쓰촨 대학의 서중국 Cryo-EM 센터와 남부 과학 기술 대학 (SUSTech)의 Cryo-EM 센터에서 수확되었으며 쓰촨 대학의 Duyu 고성능 컴퓨팅 센터에서 처리되었습니다. 이 연구는 중국 자연 과학 재단 (32100965 L.C., W.Y.에서 32100988, 31972916에서 Z.S.까지)과 쓰촨 대학의 전임 박사후 연구 기금 (2021SCU12003에서 L.C.까지)의 지원을 받았습니다.

1. S1PRs-G 단백질 복합체의 정제
<ol><li>인간 S1PRs-G 단백질 복합체를 정제하기 위해, C 말단 잔기 338-382가 결여된 S1PR1의 cDNA를 복제하고, 야생형 S1PR3, C-말단에서 345-398로 잘린 S1PR5, 야생형 Gi1을 pFastBac1 벡터 및 야생형 Gβ1 및 Gγ2의 cDNA를 pFastBacdual 벡터로 복제한다(표 of Materials). 참고: S1PR에 대한 모든 구축물은 또한 해마글루티닌(HA) 신호 서열 다음에 N-말단에 플래그 에피?...

이 프로토콜은 cryo-EM에 의한 S1PR의 구조를 결정하고 Gi 매개 cAMP 억제 분석법에 의해 S1PR의 활성화 효능을 측정하기 위한 1차 파이프라인을 기술한다. 일부 단계는 실험의 성공에 매우 중요합니다.
S1PRs-Gi 복합체를 정제하려면 바이러스의 품질과 sf9 세포의 건강에 더 많은주의를 기울여야합니다. 수용체의 발현은 불량한 sf9 세포에서 극적으로 감소된다. sf9 ?...

세포막에서 스핑고지질의 대사 산물인 스핑고신-1-포스페이트(S1P)는 림프구 밀매, 혈관 발달, 내피 완전성, 심박수1,2,3을 포함한 다양한 생물학적 활동을 수반하는 유비쿼터스 리소포스파티드 신호전달 분자이다. S1P는 5개의 S1P 수용체 아류형(S1PRs 1-5)을 통해 다양한 생리적 효과를 발휘한다. S1PR은 다양한 조직에서 발견되며 하류 G 단백질 4,5에 대한 독특한 선호도를 나타냅니다. S1PR1은 주로 Gi 단백질과 결합하며, 이는 후속적으로 cAMP 생산을 억제합니다. S1PR2 및 S1PR3은 Gi, Gq 및 G12/13과 결합되고, S1PR4 및 S1PR5는 Gi 및 G12/136을 통해 신호를 트랜스듀스한다.
S1P-S1PR 신호전달은 자가면역 장애7, 염증8, 암 9, 심지어 COVID-19 10을 포함한 다수의 질환에 대한 중요한 치료 표적이다. 2010년, 핀골리모드(FTY720)는 재발성 다발성 경화증(MS)11을 치료하기 위해 S1PR을 표적으로 하는 동급 최초의 약물로 허가되었습니다. 그러나, S1PR2를 제외한 모든 S1PR에 결합할 수 있는 반면, S1PR3에 대한 비특이적 결합은 대뇌 피질의 부종, 혈관 및 기관지 수축, 폐 상피 누출(12)을 초래한다. 치료 선택성을 증가시키기 위한 대안적인 전략으로서, 수용체에 대한 아류형 특이적 리간드가 생성되었다. 시포니모드 (BAF312)는 재발 MS 치료13에 대해 2019 년에 승인되었다; S1PR1 및 S1PR5를 효과적으로 타겟팅하는 반면, S1PR3에 대한 친화력은 없으므로 임상 실습14에서 부작용이 적습니다. 2020 년 미국 식품의 약국 (Food and Drug Administration)은 MS 요법15에 대한 ozanimod를 승인했습니다. ozanimod는 S1PR516보다 S1PR1에 대해 25 배 더 큰 선택성을 보유하고있다고보고되었습니다. 특히, 현재의 COVID-19 전염병의 맥락에서, S1PR을 표적으로 하는 작용제 약물이 면역조절 요법 기술(17)을 사용하여 COVID-19를 치료하는데 이용될 수 있다는 것이 발견되었다. 핀골리모드와 비교했을 때, 오자니모드는 COVID-19 환자의 증상을 낮추는 데 우월성을 보였으며, 현재 임상시험10을 진행 중이다. S1PR의 구조적 기초와 기능을 이해하는 것은 S1PRs(18)를 선택적으로 표적으로 하는 약물을 개발하기 위한 중요한 토대를 마련한다.
X선 결정학, 핵 자기 공명(NMR) 및 전자 현미경(EM)을 포함한 생체 거대분자의 구조 정보를 조사하기 위해 많은 기술이 사용됩니다. 2022년 3월 현재, 단백질 데이터뱅크(PDB)에 180,000개 이상의 구조물이 기탁되어 있으며, 대부분은 X선 결정학에 의해 해결되었다. 그러나 2013 년 Yifan Cheng과 David Julius가 201319 년에보고 한 TPRV1 (3.4 Å 해상도)의 첫 번째 근원자 분해능 구조로 인해 냉동 전자 현미경 (cryo-EM)은 단백질 구조의 주류 기술이되었으며 EM PDB 구조의 총 수는 10,000 개가 넘었습니다. 중요한 획기적인 분야는 직접 전자 감지 카메라 및 새로운 이미지 처리 알고리즘으로 알려진 이미징을위한 새로운 카메라 개발입니다. Cryo-EM은 지난20 년 동안 구조 생물학 및 구조 기반 약물 발견에 혁명을 일으켰습니다. 거대 분자 복합체가 살아있는 세포에서 복잡한 역할을 수행하는 방법을 이해하는 것이 생물 과학의 중심 주제이기 때문에 cryo-EM은 특히 막횡단 단백질21에 대한 동적 분자 복합체의 형태를 밝힐 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. G-단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 막횡단 단백질의 가장 큰 수퍼 패밀리이며 현재 시판되는 의약품22의 30 % 이상을 대상으로합니다. cryo-EM의 개발은 GPCR-G 단백질 복합체의 고해상도 구조의 파열에 기여하여 약물 설계23에서 X 선 결정 학적 분석에 여전히 접근 할 수없는 '난치성'표적에 대한 구조적 결정을 가능하게했습니다. 따라서, cryo-EM 애플리케이션은 원자 분해능(24)에 가까운 거의 네이티브 조건에서 GPCR의 입체 구조를 결정할 기회를 제공한다. cryo-EM의 발전은 GPCR 자극 또는 억제의 기계론적 토대를 시각화하는 것을 가능하게 하고, GPCR 표적 약물 생성(25)을 위한 신규한 결합 부위를 밝히는데 더 많은 이익을 가져온다.
cryo-EM 기술의 엄청난 진보에 의지하여, 우리는 최근26,27 개의 고뇌하는 S1PR1-, S1PR3- 및 S1PR5-Gi 신호 복합체의 구조를 확인했습니다. 인간에서, S1PR은 다양한 조직에서 발견되며 하류 G 단백질 4,5에 대한 독특한 선호도를 나타낸다. S1PR1은 주로 Gi 단백질과 결합하며, 이후 3',5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 생산을 억제합니다. S1PR3 및 S1PR5는 Gi 6,28과도 결합할 수 있습니다. Gi 결합 수용체 활성화가 cAMP 29의 생산을 감소시키기 때문에, 기능적 변화를 포착하기 위한 cAMP 억제 효과를 측정하기 위해 Gi-억제 cAMP 분석법이 도입되었다26,27. cAMP 결합 단백질 모이어티가 삽입된 포티누스 피랄리스 루시퍼라제의 돌연변이 버전을 사용하여, 이 cAMP 분석은 세포내 cAMP 농도30의 변화를 통해 GPCR 활성을 모니터링하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 이는 민감하고 비방사성 기능성 분석법이며, 약물 발견 목적을 위해 광범위한 GPCRs의 실시간 다운스트림 신호전달을 모니터링하는데 적용될 수 있다(31).
여기서, S1PRs의 활성화 및 약물 인식 모드를 해결하는데 있어서 중요한 방법들에 대한 요약이 제공되며, 주로 cryo-EM 조작 및 Gi-억제 cAMP 분석을 포함한다. 이 기사는 GPCR의 구조와 기능에 대한 추가 탐구를위한 포괄적 인 실험 지침을 제공하는 것을 목표로합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

리소포스포지질(LPLs)은 스핑고신 1-포스페이트(S1P), 리소포스파티드산 등을 포함하는 생리활성 지질이다. 세포막에서 스핑고지질의 대사 산물인 S1P는 스핑고신 1-인산염 수용체(S1PRs)에 의해 매개되는 신호전달 경로를 통해 다양한 세포 생리적 반응을 조절하는 가장 특징적인 LPL 중 하나이다. 이것은 S1P-S1PRs 신호 전달 시스템이 다발성 경화증 (MS), 자가면역 장애, 암, 염증 및 심지어 COVID-19를 포함한 장애에 대한 주목할만한 잠재적 치료 표적임을 암시했다. 클래스 A G 단백질 결합 수용체 (GPCR) 패밀리의 작은 서브세트인 S1PRs는 S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 및 S1PR5의 다섯 가지 서브타입으로 구성된다. 그러나 상세한 구조 정보의 부족은 S1PR을 겨냥한 약물 발견을 방해합니다. 여기서는 S1P-S1PRs 복합체의 구조를 해결하기 위해 한전자현미경 방법을 적용하고, 세포 기반 기능성 분석법을 이용하여 활성화, 선택적 약물 인식 및 G-단백질 결합의 메카니즘을 해명하였다. 다른 lysophospholipid receptors (LPLRs) 및 GPCRs도 이 전략을 사용하여 연구될 수 있다.

S1PRs-Gi 복합체의 샘플을 동결시키기 전에, 정제된 샘플은 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분리되고 겔 여과 크로마토그래피로 분석될 필요가 있다. 도 2 는 S1PR3-Gi 복합체를 예로 들어 나타낸 것이다. 균질한 GPCR-G 단백질 복합체의 피크 분획은 보통 크기-배제 크로마토그래피의 ∼10.5 mL에 위치하였다(도 2A). S1PR3-Gi 복합체의 SDS-page 분석(<strong class="...

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A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P는 S1P 수용체(S1PRs) 서브패밀리를 통해 다양한 생리적 효과를 발휘한다. 여기에서는 S1PR의 구조와 기능에 대해 설명하기 위해 파이프 라인에 대해 설명합니다.

스핑고신 1-인산염 수용체의 구조와 신호전달 경로를 조사하는 파이프라인

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

우리는 승무원에 의한 S1PRS의 활성화 및 약물 재계산 기분, EM 조작 및 GI 인하 상태 A M P A 및 S1PRS를 견고하게 표적으로 하는 약물 개발을 위한 덜 중요한 기반을 다루었습니다. GP ZR 자극 또는 거주의 마그니스틱 언더페인팅을 독성화할 수 있는 발전과 T BCR 표적 약물 생성을 위한 정상 결합 부위를 밝히는 데 있어 추가적인 이점이 있습니다. 샘플의 품질은 올바른 EM 실험에서 모든 것의 기초입니다. 간단한 준비를위한 필수 요소는 SF 라인 판매의 다양한 제품 상태와 N g 농도를 포함하며 절차를 시연하는 것은 내 수준의 대학원생 Heli Wang이 될 것입니다.단백질 정제를 위해 이러한 핑거씬원 포스페이트 수용체 또는 S하나의 PRS G 단백질 복합체 용액을 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC 겔 여과 컬럼에 로딩하여 섭씨 4도에서 분당 0.5 밀리리터의 유속으로 SEC 완충액과 미리 평형화시켰다. 수집 된 분획을 초저온 전자 현미경 검사에 사용하려면 섭씨 4도에서 1, 300 XG에서 100 킬로 달톤 컷오프 농축기를 사용하여 농축하십시오. 파티클의 예비 분류에서 2D 분류를 위한 데이터 처리 중에 Reli On 소프트웨어에서 2D 분류 기능을 선택하고 IO 옵션에서 입력 이미지 스타 파일 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭합니다.그런 다음 입자.별을 선택합니다. 그런 다음 최적화 옵션에서 클래스 수를 100으로 설정하고 마스크 지름 A를 140으로 설정합니다. compute 옵션에서 풀링된 파티클 수를 10으로 설정하고 빠르고 빠른 로컬 드라이브의 디렉터리를 스크래치로 파티클 복사 필드에 입력합니다.더 빠른 처리를 위해 사용된 GPU 가속에 대해 예를 선택합니다. 템플릿으로 좋은 2D 결과의 하위 집합을 선택하려면 하위 집합 선택 기능의 IO 옵션으로 이동하여 model.star에서 선택한 클래스의 오른쪽에있는 찾아보기를 클릭하십시오. 그런 다음 run_it025_model 선택합니다.입력으로 별표를 표시하고 팝업 창에서 실행을 클릭하여 이미지 정렬 및 역 정렬을 선택합니다. 그런 다음 디스플레이를 클릭하십시오. 자동 선택 기능의 참조를 위한 참조로 좋은 대표 2D 결과를 선택한 후 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 선택한 클래스 저장을 선택합니다.자동 피킹의 두 번째 라운드에 템플릿을 사용하려면 자동 피킹 기능의 IO 옵션으로 이동하십시오. 자동 선택을 위해 입력 현미경 사진 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭하고 micrographs.star를 선택합니다. 그런 다음 2D 참조 오른쪽에있는 찾아보기를 클릭하고 class_averages.star를 선택하십시오.또한 가우스의 경우 아니오를 선택하거나 leplossian을 사용하십시오. 다음으로, 코드 밑줄 접미사 밑줄 autopick.star를 사용하여 입자 추출을 수행합니다. 입자를 사용하여 2D 분류를 수행합니다.별표, run을 사용하여 하위 집합 선택 밑줄을 긋고 20 five_optimizer 0으로 표시합니다. 별 입자 추출의 경우 IO 옵션에서 현미경 사진 별 파일 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭한 후 현미경 사진을 선택합니다. 별표를 표시하고 정제된 입자에 대해 예 또는 다시 추출을 선택합니다.정제된 입자 별 파일의 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭한 후 입자를 선택합니다. 스타 초기 3D 모델 및 참조 맵을 생성하려면 IO 옵션에서 입력 이미지 스타 파일의 오른쪽에있는 3D 초기 모델 찾아보기를 클릭하고 이전 particles.star를 선택합니다. 그런 다음 최적화 옵션에서 클래스 수를 1로 설정하고 마스크 지름 A를 140으로 설정합니다.3D 분류 및 예비 3D 맵 생성의 경우, 입자를 선택한 후. 별표 앞에서 설명한 대로 참조 맵의 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭하고 초기 밑줄 모델 dot MRC를 선택합니다. 그런 다음 최적화 옵션에서 클래스 수를 4-6으로 설정하고 마스크 지름 A를 140으로 설정합니다.마스크 생성의 경우 IO 옵션에서 입력으로 좋은 3D 맵을 선택한 후 초기 이진화 임계값을 0.05로 설정하고 이 픽셀 수로 이진 맵을 확장하는 것을 3으로 설정합니다. 다음으로 마스크 옵션으로 이동하여 설정하십시오. 이 많은 픽셀에 부드러운 가장자리를 8로 추가합니다.다음 처리를 위해 Trino Spark 소프트웨어를 열고 새 작업 영역을 만든 다음 첫 번째 작업에 대해 작업 빌더를 클릭합니다. 파티클 스택을 가져오려면 파티클 메타 경로 필드에 파티클 경로를 입력하고 파티클 데이터 경로 필드에 동영상 경로를 입력합니다. 다음으로, 볼륨 데이터 경로에 이전에 생성된 최상의 3D 볼륨의 경로를 입력하고 가져올 볼륨 유형에 대한 마스크를 선택하여 3D 볼륨을 가져옵니다.불균일 미세 조정의 경우 이전에 생성된 가져온 밑줄 입자를 불균일 미세 조정 입자 입자의 입력으로 드래그합니다. 가져온 밑줄 볼륨은 불균일 구체화 볼륨 볼륨의 입력으로 밑줄 하나를 강조하고 가져온 밑줄 마스크는 균일하지 않은 미세 조정 마스크의 입력으로 하나를 밑줄입니다. 마스크. 그런 다음 Q를 클릭하여 처리를 시작하고 절차를 반복하여 좋은 해상도를 얻습니다.S1PRGI 3D 지도. 플라스미드 구축 및 일시적 형질주입을 위한 준비 후, 200 마이크로리터의 형질주입 시약 완충액 내로 2 마이크로그램의 준비된 DNA를 첨가한다. 10 초 동안 볼텍싱하고 사용하기 전에 혼합물을 잠시 회전시켜 혼합하십시오.4 마이크로 리터의 형질 주입 시약을 추가하고 이전에 시연 된대로 와류 및 회전으로 혼합하십시오. 튜브를 실온에서 15분 동안 배양한 후, CHOK 하나의 세포를 함유하는 6웰 플레이트의 각 웰에 형질주입 믹스 200 마이크로리터를 천천히 떨어뜨리고 플레이트를 부드럽게 흔들거나 완전히 혼합한다. 4 내지 6시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 인큐베이터로 복귀시키기 전에 형질주입 배지를 F12 배지 및 10%fbs로 구성된 세포 성장 배지로 교체한다.세포의 절편 수확 후 24 내지 48시간에, 세포를 D 루시퍼 칼륨 염과 함께 3 밀리리터의 SA 완충액에 현탁시킨다. 이어서 멀티채널 피펫을 사용하여, 90 마이크로리터의 세포 현탁액을 부드럽게 혼합된 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 40분 동안 인큐베이션한다. 형광 신호 측정을 위해, 첫째로, DM S O.그런 다음 25 마이크로몰 포스칼린을 포함하는 H B S S 완충액에 있는 연속적인 희석을 만들고 30 분 동안 이 작용제 해결책의 각종 농도의 10 마이크로리터로 세포를 자극하십시오.다음으로, 검출 방법을 위해 발광을 선택하여 마이크로플레이트 판독기에서 발광 신호를 계수한다. 판독 유형에 대한 엔드포인트 및 연관된 소프트웨어의 광학 유형에 대한 발광 광섬유. 또한 광학 게인을 255로 설정합니다.그런 다음 얻은 형광 신호 값을 스프레드시트 프로그램으로 가져오고 비선형 회귀 곡선 적합 선량 반응 함수를 사용하여 데이터를 처리합니다. S1PRS GI 복합체는 크기 배제 크로마토그래피로 성공적으로 정제될 수 있었고, 이는 SDS 페이지에 의해 검증되었다. 또한, 이 연구에서 따랐던 전자 현미경 프로토콜은 명확하고 잘 정의된 2D 등급의 S1PRSGI 입자와 품질이 낮은 입자를 구별하는 데 효과적이었습니다.또한, 우수한 해상도를 가진 S1PR3 GI의 전자 현미경 맵은 불균일 한 정제를 통한 더 많은 껍질 상관 관계에 의해 생성 될 수 있습니다. 구조 분석 후, S 1 PR3에 대한 기능 분석은 CHO K 하나의 세포를 수용체 및 센서 플라스미드로 형질감염시킴으로써 수행되었으며, 이는 1 대 3의 수용체 플라스미드 대 센서 플라스미드 비가 최적의 결과를 생성한다는 것을 밝혀냈다. 그러나, 그 처리에 있어서는 도대체 2 93 세포에서 결과가 덜 현실적이었고, 입자 절편과 2D 및 3D 분류의 단면에서의 알고리즘 선택은 특히 유출 및 ecfs를 모델링하기 위한 MPS G 단백질 복합체를 해결하는 데 중요하다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

신호 전달 단백질의 기능을 흉내 낸 : 인공 신호 전달 요법을 향해

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

연구

생화학

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

무선 표지 된 GTP 결합을 통한 G- 단백질 결합 수용체 신호 측정

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

적정 수용 체 Ligand 상호 작용의 분리 상수를 결정 하는 방법으로 ELISA

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

면역페록시다아제 및 면역형광방법을 이용한 성인용 제브라피시의 오렉스신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

성공적인 결정화를 위한 시각적 GPCR-mini-G 단백질 신호 복합체의 전략적 스크리닝 및 특성화

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...