Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

Dataene fra S1PRs-Gi-komplekset ble høstet ved West China Cryo-EM Center i Sichuan University og Cryo-EM Center ved Southern University of Science and Technology (SUSTech) og behandlet ved Duyu High-Performance Computing Center i Sichuan University. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China (32100965 til L.C., 32100988 til W.Y., 31972916 til Z.S.) og heltids postdoktorforskningsfondet ved Sichuan University (2021SCU12003 til L.C.)

1. Rensing av S1PRs-G proteinkompleks
<ol><li>For å rense det humane S1PRs-G-proteinkomplekset, kloner du cDNA-ene til S1PR1 som mangler C-terminale rester 338-382, villtypen S1PR3, S1PR5 avkortet med 345-398 ved C-terminalen, og villtypen Gi1 inn i pFastBac1-vektoren og cDNA-ene til villtypen Gβ1 og Gγ2 inn i pFastBacdual-vektoren (Table of Materials). MERK: Alle konstruksjoner for S1PRs inneholder også hemagglutinin (HA) signalsekvens etterfulgt av en Flag-epitop-tag ved N-ter...

Denne protokollen beskriver en primær rørledning for å bestemme strukturene til S1PR ved kryo-EM og måle aktiveringsstyrken til S1PR ved Gi-mediert cAMP-hemmingsanalyse. Noen trinn er avgjørende for eksperimentets suksess.
For å rense S1PRs-Gi-komplekset, bør kvaliteten på viruset og helsen til sf9-celler være mer oppmerksom på. Uttrykket av reseptoren reduseres dramatisk i dårlige sf9-celler . Helsen til sf9-celler ble vurdert ved å måle diameteren. Den...

Sfingosin-1-fosfat (S1P), et metabolsk produkt av sfingolipider i cellemembranen, er et allestedsnærværende lysofosfatidisk signalmolekyl som involverer ulike biologiske aktiviteter, inkludert lymfocytthandel, vaskulær utvikling, endotelintegritet og hjertefrekvens 1,2,3. S1P utøver sine ulike fysiologiske effekter gjennom fem S1P-reseptorundertyper (S1PRs 1-5); S1PR finnes i en rekke vev og viser unike preferanser for nedstrøms G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært kombinert med Gi-proteinet, som senere hemmer cAMP-produksjonen; S1PR2 og S1PR3 er koblet sammen med Gi, Gq og G12/13, og S1PR4 og S1PR5 transduserer signal gjennom Gi og G12/136.
S1P-S1PR-signalering er et kritisk terapeutisk mål for flere sykdommer, inkludert autoimmune lidelser7, betennelse8, kreft9 og til og med COVID-1910. I 2010 ble fingolimod (FTY720) lisensiert som et førsteklasses legemiddel rettet mot S1PR for å behandle residiverende multippel sklerose (MS)11. Det er imidlertid i stand til å binde seg til alle S1PR unntatt S1PR2, mens ikke-spesifikk binding til S1PR3 resulterer i ødem i hjernebarken, vaskulær og bronkial innsnevring og lungeepitellekkasje12. Som en alternativ strategi for å øke terapeutisk selektivitet er det produsert subtypespesifikke ligander for reseptoren. Siponimod (BAF312) ble godkjent i 2019 for tilbakefall MS-behandling13; det retter seg effektivt mot S1PR1 og S1PR5, mens det ikke har noen affinitet for S1PR3, og viser færre bivirkninger i klinisk praksis14. I 2020 godkjente US Food and Drug Administration ozanimod for MS-terapi15. Det har blitt rapportert at ozanimod har en 25 ganger større selektivitet for S1PR1 enn for S1PR516. Spesielt i sammenheng med den nåværende COVID-19-pandemien har det blitt oppdaget at agonistmedisiner rettet mot S1PR kan brukes til å behandle COVID-19 ved å bruke immunmodulerende terapiteknikker17. Sammenlignet med fingolimod har ozanimod vist overlegenhet i å senke symptomene hos COVID-19-pasienter og gjennomgår nå kliniske studier10. Å forstå det strukturelle grunnlaget og funksjonen til S1PRs legger et betydelig grunnlag for å utvikle et stoff som selektivt retter seg mot S1PRs18.
Mange teknikker brukes til å undersøke strukturell informasjon om biomacromolecules, inkludert røntgenkrystallografi, kjernemagnetisk resonans (NMR) og elektronmikroskopi (EM). Fra mars 2022 er det mer enn 180 000 strukturer deponert på Protein Databank (PDB), og de fleste av dem er løst ved røntgenkrystallografi. Men med den første nær-atomiske oppløsningsstrukturen til TPRV1 (3.4 Å-oppløsning) rapportert av Yifan Cheng og David Julius i 201319, har kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) blitt en vanlig teknikk for proteinstrukturer, og det totale antallet EM PDB-strukturer var mer enn 10.000. De kritiske gjennombruddsområdene er utviklingen av nye kameraer for bildebehandling kjent som direkte elektrondeteksjonskameraer og nye bildebehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolusjonert strukturbiologi og strukturbasert legemiddeloppdagelse det siste tiåret20. Ettersom forståelse av hvordan makromolekylære komplekser oppfyller sine kompliserte roller i den levende cellen er et sentralt tema i biologiske, har cryo-EM potensial til å avsløre konformasjoner av dynamiske molekylære komplekser, spesielt for transmembranproteiner21. G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) er den største superfamilien av transmembranproteiner og målene for mer enn 30% av dagens markedsførte legemidler22. Utviklingen av cryo-EM har bidratt til et utbrudd av høyoppløselige strukturer av GPCR-G-proteinkomplekser, noe som muliggjør strukturell bestemmelse for "ugjennomtrengelige" mål som fortsatt ikke er tilgjengelige for røntgenkrystallografisk analyse i legemiddeldesign23. Derfor gir cryo-EM-applikasjonen en sjanse til å bestemme den tredimensjonale strukturen til GPCR under nær-innfødte forhold ved nær atomoppløsning24. Fremskritt i cryo-EM gjør det mulig å visualisere mekanistiske underlag av GPCR-stimulering eller inhibering, og ytterligere nytte i å avdekke de nye bindingsstedene for GPCR-målrettet narkotikaopprettelse25.
Ved å stole på de enorme fremskrittene med kryo-EM-teknologi, har vi identifisert strukturer av forpinte S1PR1-, S1PR3- og S1PR5-Gi-signalkomplekser nylig26,27. Hos mennesker finnes S1PR i forskjellige vev og utviser unike preferanser for nedstrøms G-proteiner 4,5. S1PR1 er primært kombinert med Gi protein, som senere hemmer 3′,5′-syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) produksjon. S1PR3 og S1PR5 er også i stand til å koble til Gi 6,28. Siden Gi-koblet reseptoraktivering reduserer produksjonen av cAMP29, ble en Gi-hemming cAMP-analyse introdusert for å måle cAMP-hemmingseffekter for å fange funksjonelle endringer26,27. Ved å bruke en mutert versjon av Photinus pyralis luciferase hvor en cAMP-bindende proteindel er satt inn, tilbyr denne cAMP-analysen en enkel og pålitelig metode for å overvåke GPCR-aktivitet gjennom endringer i intracellulær cAMP-konsentrasjon30. Det er en sensitiv og ikke-radioaktiv funksjonell analyse og kan brukes til å overvåke sanntids nedstrøms signalering av et bredt spekter av GPCR for narkotikaoppdagelsesformål31.
Her gis et sammendrag av de kritiske metodene for å løse aktiverings- og legemiddelgjenkjenningsmodusene til S1PR, primært inkludert kryo-EM-manipulasjoner og en Gi-hemming cAMP-analyse. Denne artikkelen tar sikte på å gi omfattende eksperimentell veiledning for videre utforskning av strukturer og funksjoner i GPCRs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

Lysofosfolipider (LPL) er bioaktive lipider som inkluderer sfingosin 1-fosfat (S1P), lysofosfatidinsyre, etc. S1P, et metabolsk produkt av sfingolipider i cellemembranen, er en av de best karakteriserte LPL-ene som regulerer en rekke cellulære fysiologiske responser via signalveier mediert av sfingosin 1-fosfatreseptorer (S1PRs). Dette impliserte at signalsystemet S1P-S1PRs er et bemerkelsesverdig potensielt terapeutisk mål for lidelser, inkludert multippel sklerose (MS), autoimmune lidelser, kreft, betennelse og til og med COVID-19. S1PRs, en liten delmengde av klasse A G-proteinkoblet reseptor (GPCR) familie, består av fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 og S1PR5. Mangelen på detaljert strukturell informasjon hindrer imidlertid narkotikaoppdagelsen rettet mot S1PR. Her brukte vi kryo-elektronmikroskopimetoden for å løse strukturen til S1P-S1PRs-komplekset, og belyste mekanismen for aktivering, selektiv legemiddelgjenkjenning og G-proteinkobling ved å bruke cellebaserte funksjonelle analyser. Andre lysofosfolipidreseptorer (LPLR) og GPCR kan også studeres ved hjelp av denne strategien.

Før frysing av prøven av S1PRs-Gi-komplekset, må den rensede prøven separeres ved størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og analyseres med gelfiltreringskromatografi. Figur 2 viser S1PR3-Gi-komplekset som et eksempel. Toppfraksjonen av det homogene GPCR-G-proteinkomplekset var vanligvis lokalisert ved ~10,5 ml av størrelseseksklusjonskromatografien (figur 2A). SDS-sideanalyse av S1PR3-Gi-komplekset (figur 2B) avslører fire b...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P utøver sine forskjellige fysiologiske effekter gjennom underfamilien S1P-reseptorer (S1PRs). Her beskrives en rørledning for å forklare strukturene og funksjonen til S1PRs.

En rørledning for å undersøke strukturer og signalveier for sfingosin 1-fosfatreseptorer

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Vi adresserte aktiverings- og stoffberegningsstemningene til S1PRS av mannskap, EM-manipulasjoner og GI-inhab-tilstand A M P A og mindre signifikant grunnlag for å utvikle et stoff som solid retter seg mot S1PRS-fremskritt for å gjøre det mulig å virulere magnistiske undermalinger av GP ZR-stimulering eller beboelse og ytterligere fordeler ved å avdekke de normale bindingsstedene for T BCR-målrettet narkotikaopprettelse. Kvaliteten på prøven er grunnlaget for alt i riktig EM-eksperiment. De viktigste faktorene for enkel forberedelse inkluderer ulike produkt tilstand SF linje salg og en N g konsentrasjon Demonstrere prosedyren vil være Heli Wang en kandidatstudent fra mitt nivå.For proteinrensing last denne fingerscenen en fosfatreseptorer eller S en P R S G proteinkompleksløsning til en størrelseseksklusjonskromatografi eller S E C gelfiltreringskolonne pre likevektet med S E C-buffer ved en strømningshastighet på 0,5 milliliter per minutt ved fire grader Celsius. For å bruke de oppsamlede fraksjonene for kryoelektronmikroskopi, konsentrer dem ved hjelp av en 100 kilodalton cutoff-konsentrator ved 1.300 XG ved fire grader Celsius. Under databehandling for 2D-klassifisering i den foreløpige klassifiseringen av partikler, velg 2D-klassifiseringsfunksjonen i Rely On-programvaren og klikk bla til høyre for stjernefilen for inndatabilder i IO-alternativet.Velg deretter particles.star. Deretter angir du antall klasser til 100 og maskediameteren A til 140 i optimaliseringsalternativet. I databehandlingsalternativet setter du antall samlede partikler til 10 og går inn i katalogen fra en rask, rask lokal stasjon i feltet kopier partikkel til riper.Hvis du vil ha raskere behandling, velger du Ja for brukt GPU-akselerasjon. For delmengdevalg av gode 2D-resultater som maler, gå til IO-alternativet for delmengdevalgfunksjon og klikk på bla til høyre for utvalgte klasser fra model.star. Velg deretter run_it025_model.stjerne som inngang og klikk på Kjør i popup-vinduet, sjekk sorter bilder på og omvendt sortering. Klikk deretter på skjermen. Etter å ha valgt gode representative 2D-resultater som referanse for referanse til funksjonen for automatisk plukking, høyreklikk og velg lagre valgte klasser.For å bruke malen for den andre runden med automatisk plukking, gå til IO-alternativet for automatisk plukkfunksjon. Klikk bla til høyre for inndatamikrografer for automatisk valg, og velg micrographs.star. Klikk deretter på bla til høyre for 2D-referanser og velg class_averages.star.Velg også nei for eller bruk leplossian i av Gaussian. Deretter utfører du partikkelutvinning ved hjelp av ledningsunderstrekingssuffiks understrek auto pick.star. Utfør 2D-klassifisering ved hjelp av partikler.stjerne, etterfulgt av valg av delmengde ved hjelp av kjør, understreker det null 20 five_optimizer. stjerne For partikkelutvinning, etter å ha klikket bla til høyre for mikrografstjernefilen i IO-alternativet, velg mikrografer. stjerne og velg ja for eller trekke ut raffinerte partikler.Etter å ha klikket bla til høyre for stjernefilen for raffinerte partikler, velg partikler. stjerne for å generere en innledende 3D-modell og et referansekart, klikk på bla gjennom den første 3D-modellen til høyre for inndatabildene stjernefil i IO-alternativet og velg forrige particles.star. I optimaliseringsalternativet setter du deretter antall klasser til en og maskediameteren A til 140.For 3D-klassifisering og generering av et foreløpig 3D-kart, etter å ha valgt partikler. Stjerne Som vist tidligere, klikk på Bla til høyre for referansekartet og velg Initial Underscore Model dot MRC. Deretter, i optimaliseringsalternativet, sett antall klasser til fire til seks og maskediameteren A til 140.For maskegenerering, etter å ha valgt et godt 3D-kart som inngang i IO-alternativet, sett den første binariseringsterskelen til 0,05, og utvid binært kart til så mange piksler til tre. Deretter går du til maskealternativet og angir. Legg til myk kant til så mange piksler til åtte.For neste behandling, åpne Trino Spark-programvaren, opprett et nytt arbeidsområde og klikk på jobbbygger for den første jobben. Hvis du vil importere partikkelstakken, skriver du inn partikkelbanen i partikkelmetabanefeltet og filmbanen i feltet for partikkeldatabane. Deretter importerer du 3D-volumer ved å angi banen til det beste 3D-volumet som er generert før i volumdatabanen, og velge maske for typen volum som importeres.For ujevn raffinering drar du de tidligere genererte importerte understrekingspartiklene som inndata for ikke-uniform raffinementspartikkelpartikkel. Importert understrekingsvolum, understrek ett som input av ikke-uniform raffinementsvolumvolum og importert understrekingsmaske understreker en som input av ikke-uniform raffinementsmaske. Maske. Klikk deretter Q for å starte behandlingen og gjenta prosedyren for å få en god oppløsning.S1PRGI 3D-kart. Etter plasmidkonstruksjon og forberedelse for forbigående transfeksjon, tilsett to mikrogram forberedt DNA i 200 mikroliter transfeksjonsreagensbuffer. Bland ved vortexing i 10 sekunder og spinn blandingen kort før bruk.Tilsett fire mikroliter transfeksjonsreagens og bland det ved vortexing og spinning som demonstrert tidligere. Etter å ha inkubert røret ved romtemperatur i 15 minutter, slipp sakte 200 mikroliter av transfeksjonsblandingen i hver brønn av en seks brønnplate som inneholder CHOK en celle og rist forsiktig platen eller grundig blanding. Etter fire til seks timers inkubasjon, erstatt transfeksjonsmediet med cellevekstmediet bestående av F 12 medium og 10% fbs før du returnerer platen til inkubatoren.24 til 48 timer etter transeksjonshøsting av cellene, suspendere cellene i tre milliliter av en SA-buffer med D luciferian kaliumsalt. Deretter bruker du en flerkanals pipette, tilsett 90 mikroliter av cellesuspensjonen til hver brønn av en 96-brønnplate blandet forsiktig og inkuber ved romtemperatur i 40 minutter. For fluorescenssignalbestemmelse fremstilles først 10 millimolare stamløsninger av siponimod i D M S O.Lag deretter en seriell fortynning i H B S S-buffer som inneholder 25 mikromolar forskalin og stimuler cellene med 10 mikroliter av forskjellige konsentrasjoner av denne agonistoppløsningen i 30 minutter.Deretter teller du luminescenssignalet i en mikroplateleser ved å velge luminescens for deteksjonsmetode. Endepunkt for lesetype, og luminescensfiber for optikktype i tilhørende programvare. Sett også optikkforsterkningen til 255.Importer deretter de oppnådde fluorescenssignalverdiene til et regnearkprogram, og behandle dataene ved hjelp av den ikke-lineære regresjonskurvetilpasningsdoseresponsfunksjonen. S1PRS GI-komplekset kunne vellykket renses ved størrelseseksklusjonskromatografi, som ble verifisert av SDS-siden. Videre var elektronmikroskopiprotokollen som ble fulgt i denne studien effektiv til å skille mellom S1PRSGI-partikler med klare og veldefinerte 2D-klasser og partikler av dårlig kvalitet.Videre kan et elektronmikroskopikart over S1PR3 GI med god oppløsning genereres ved furrier skallkorrelasjon gjennom ujevn raffinement. Etter strukturell analyse ble funksjonelle analyser for S en P R tre gjort ved transfeksjon av C H O K en celler med reseptor- og sensorplasmider, noe som viste at reseptorplasmid til sensorplasmidforhold på en til tre gir optimale resultater. Resultatene var imidlertid mindre realistiske i pokker 2 93 celler I den behandlingen er valget av algoritmer i partikkelseksjonen og delen av 2D- og 3D-klassifisering viktig for å løse de såkalte MPS G-proteinkompleksene spesielt for modellering av lekkasjer og ecfs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Ligne Funksjon Melde Proteiner: Mot Kunstig signaltransduksjon Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling av G-proteinkoblet reseptor-signalering via radiomerket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Belysning opp veier å Caspase aktivisering med resultatet av dette fluorescens Complementation

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som metode for å bestemme dissosiasjon konstant reseptor Ligand interaksjon

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifisering av orexin og Endocannabinoid reseptorer i Adult sebrafisk bruke Immunoperoxidase og Immunofluorescence metoder

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Fluorescerende lekkasjeanalyse for å undersøke membranstabilisering ved cell-gjennomtrengende peptid

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Bruke tidsbestemt proteinindusert fluorescensforbedring for å identifisere stabile lokale konformasjoner En α-Synuclein Monomer om gangen

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...