Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

Данные комплекса S1PRs-Gi были собраны в Западно-Китайском крио-ЭМ-центре в Сычуаньском университете и Центре крио-ЭМ в Южном университете науки и техники (SUSTech) и обработаны в Центре высокопроизводительных вычислений Duyu в Сычуаньском университете. Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Китая (32100965 в Лос-Анджелесе, 32100988 в W.Y., 31972916 в Z.S.) и Фондом постдокторских исследований Сычуаньского университета (2021SCU12003 в Лос-Анджелесе).

1. Очистка белкового комплекса S1PRs-G
<ol><li>Чтобы очистить человеческий белковый комплекс S1PRs-G, клонируют cDNAs S1PR1, лишенные C-концевых остатков 338-382, S1PR3 дикого типа S1PR3, S1PR5, усеченные с 345-398 на C-конце, и Дикий тип Gi1 в вектор pFastBac1 и cDNAs дикого типа Gβ1 и Gγ2 в вектор pFastBacdual (Таблица мат...

Этот протокол описывает первичный конвейер для определения структур S1RR с помощью крио-ЭМ и измерения эффективности активации S1RR с помощью Gi-опосредованного анализа ингибирования цАМФ. Некоторые шаги имеют решающее значение для успеха эксперимента.
Для очистки комплек?...

Сфингозин-1-фосфат (S1P), метаболический продукт сфинголипидов в клеточной мембране, представляет собой вездесущую лизофосфатидную сигнальную молекулу, которая включает в себя различные биологические активности, включая торговлю лимфоцитами, развитие сосудов, эндотелиальную целостность и частоту сердечных сокращений 1,2,3. S1P оказывает свое разнообразное физиологическое воздействие через пять подтипов рецепторов S1P (S1PRs 1-5); S1PR встречаются в различных тканях и демонстрируют уникальные предпочтения для последующих G-белков 4,5. S1PR1 в первую очередь связан с белком Gi, который впоследствии ингибирует выработку цАМФ; S1PR2 и S1PR3 соединены с Gi, Gq и G12/13, а S1PR4 и S1PR5 передают сигнал через Gi и G12/136.
Передача сигналов S1P-S1PR является критически важной терапевтической мишенью для нескольких заболеваний, включая аутоиммунные расстройства7, воспаление8, рак9 и даже COVID-1910. В 2010 году финголимод (FTY720) был лицензирован как первый в своем классе препарат, нацеленный на S1PR для лечения рецидивирующего рассеянного склероза (РС)11. Тем не менее, он способен связываться со всеми S1PR, кроме S1PR2, в то время как неспецифическое связывание с S1PR3 приводит к отеку коры головного мозга, сужению сосудов и бронхов и утечке эпителия легких12. В качестве альтернативной стратегии повышения терапевтической селективности были получены подтип-специфические лиганды для рецептора. Сипонимод (BAF312) был одобрен в 2019 году для лечения рецидивирующего рассеянного склероза13; он эффективно нацелен на S1PR1 и S1PR5, тогда как он не имеет сродства к S1PR3, проявляя меньше побочных эффектов в клинической практике14. В 2020 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США разрешило озанимод для терапииРС 15. Сообщалось, что озанимод обладает в 25 раз большей селективностью для S1PR1, чем для S1PR516. Примечательно, что в контексте нынешней пандемии COVID-19 было обнаружено, что агонистические препараты, нацеленные на S1PR, могут быть использованы для лечения COVID-19 с использованием методов иммуномодулирующей терапии17. По сравнению с финголимодом, озанимод показал превосходство в снижении симптомов у пациентов с COVID-19 и в настоящее время проходит клинические испытания10. Понимание структурной основы и функции S1PR закладывает значительную основу для разработки препарата, который избирательно нацелен на S1PRs18.
Многие методы используются для исследования структурной информации биомакромолекул, включая рентгеновскую кристаллографию, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и электронную микроскопию (ЭМ). По состоянию на март 2022 года в банке данных белка (PDB) хранится более 180 000 структур, и большинство из них были разрешены с помощью рентгеновской кристаллографии. Тем не менее, с первой структурой TPRV1 с почти атомным разрешением (разрешение 3,4 Å), о которой сообщили Ифань Чэн и Дэвид Джулиус в 2013году 19, криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) стала основным методом для белковых структур, и общее количество структур EM PDB составило более 10 000. Важнейшими областями прорыва являются разработка новых камер для визуализации, известных как камеры прямого обнаружения электронов, и новые алгоритмы обработки изображений. Крио-ЭМ произвел революцию в структурной биологии и структурно-ориентированном открытии лекарств за последнее десятилетие20. Поскольку понимание того, как макромолекулярные комплексы выполняют свои сложные роли в живой клетке, является центральной темой в биологических науках, крио-ЭМ имеет потенциал для выявления конформаций динамических молекулярных комплексов, особенно для трансмембранных белков21. Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются крупнейшим надсемейством трансмембранных белков и мишенью для более чем 30% продаваемых в настоящее время фармацевтических препаратов22. Разработка крио-ЭМ способствовала всплеску структур с высоким разрешением белковых комплексов GPCR-G, что позволяет определять структуры для «трудноизлечимых» мишеней, которые все еще недоступны для рентгеновского кристаллографического анализа в конструкции лекарственного средства23. Следовательно, крио-ЭМ-приложение дает возможность определить трехмерную структуру GPCR в почти нативных условиях при близком к атомному разрешению24. Достижения в области крио-ЭМ позволяют визуализировать механистические основы стимуляции или ингибирования GPCR, а также дополнительную пользу в раскрытии новых сайтов связывания для создания GPCR-таргетных лекарств25.
Опираясь на огромные успехи крио-ЭМ технологии, мы недавно идентифицировали структуры агонизированных сигнальных комплексов S1PR1-, S1PR3- и S1PR5-Gi26,27. У людей S1PR обнаруживаются в различных тканях и демонстрируют уникальные предпочтения в отношении последующих G-белков 4,5. S1PR1 в основном связан с белком Gi, который впоследствии ингибирует выработку 3',5'-циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). S1PR3 и S1PR5 также способны сцепляться с Gi 6,28. Поскольку активация Gi-связанных рецепторов снижает выработку цАМФ29, был введен анализ Ги-ингибирования цАМФ для измерения эффектов ингибирования цАМФ для захвата функциональных изменений 26,27. Используя мутантную версию люциферазы Photinus pyralis, в которую был вставлен цАМФ-связывающий фрагмент белка, этот анализ цАМФ предлагает простой и надежный метод мониторинга активности GPCR через изменения внутриклеточной концентрации цАМФ30. Он представляет собой чувствительный и нерадиоактивный функциональный анализ и может применяться для мониторинга нисходящей сигнализации в режиме реального времени широкого спектра GPCR для целей обнаружения лекарств31.
Здесь приводится краткое изложение критических методов разрешения режимов активации и распознавания лекарств S1PR, в первую очередь включая крио-ЭМ-манипуляции и анализ Ги-ингибирования цАМФ. Целью этой статьи является предоставление всестороннего экспериментального руководства для дальнейших исследований структур и функций GPCR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

Лизофосфолипиды (LPL) являются биологически активными липидами, которые включают сфингозин-1-фосфат (S1P), лизофосфатидную кислоту и т. Д. S1P, метаболический продукт сфинголипидов в клеточной мембране, является одним из наиболее характерных LPL, который регулирует различные клеточные физиологические реакции через сигнальные пути, опосредованные рецепторами сфингозин-1-фосфата (S1PR). Это означает, что сигнальная система S1P-S1PR является замечательной потенциальной терапевтической мишенью для расстройств, включая рассеянный склероз (РС), аутоиммунные расстройства, рак, воспаление и даже COVID-19. S1PR, небольшое подмножество семейства рецепторов, связанных с G-белком класса A (GPCR), состоит из пяти подтипов: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 и S1PR5. Однако отсутствие подробной структурной информации препятствует открытию лекарств, нацеленных на S1PR. Здесь мы применили метод криоэлектронной микроскопии для решения структуры комплекса S1P-S1PR и выяснили механизм активации, селективного распознавания лекарств и связи G-белка с помощью клеточных функциональных анализов. Другие лизофосфолипидные рецепторы (LPLR) и GPCR также могут быть изучены с использованием этой стратегии.

Перед замораживанием образца комплекса S1PRs-Gi очищенный образец необходимо отделить с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии (SEC) и проанализировать с помощью гель-фильтрационной хроматографии. На рисунке 2 показан комплекс S1PR3-Gi в качестве примера. Пиковая фракци...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P оказывает свое разнообразное физиологическое воздействие через подсемейство рецепторов S1P (S1PR). Здесь описан конвейер для объяснения структур и функций S1PR.

Конвейер для исследования структур и сигнальных путей рецепторов сфингозин-1-фосфата

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Мы рассмотрели настроения активации и пересчета лекарств S1PRS экипажем, эм-манипуляции и состояние ЖКТ A M P A и менее значимую основу для разработки препарата, который твердо нацелен на S1PRS Достижения в том, чтобы позволить вирулизировать магнистическое подкрашивание стимуляции GP ZR или жилья и дополнительные преимущества в выявлении нормальных сайтов связывания для создания таргетных препаратов T BCR. Качество образца является основой для всего в правильном ЭМ-эксперименте. Существенными факторами для простой подготовки являются различные состояния продукта продажи линии SF и концентрация N g Демонстрацией процедуры будет Хели Ванг, аспирант моего уровня.Для нагрузки на очистку белка этот палец сцены одним фосфатным рецептором или S одним P R S G белкового комплексного раствора с исключением размера хроматографии или S E C гелевой фильтрационной колонки предварительно уравновешенной буфером S E C при скорости потока 0,5 миллилитра в минуту при четырех градусах Цельсия. Чтобы использовать собранные фракции для криоэлектронной микроскопии, концентрируйте их с помощью отсечного концентратора мощностью 100 килодалтон при 1 300 XG при четырех градусах Цельсия. Во время обработки данных для 2D-классификации при предварительной классификации частиц выберите функцию 2D-классификации в программном обеспечении Rely On и нажмите кнопку обзора справа от файла звезды входных изображений в опции IO.Затем выберите particles.star. Далее в опции оптимизации задайте количество классов равным 100, а диаметр маски A — 140. В параметре вычисления установите число частиц в пуле равным 10 и введите каталог с быстрого и быстрого локального диска в поле копирования частицы в рабочий каталог.Для более быстрой обработки выберите Да для используемого ускорения графического процессора. Для выбора подмножества хороших 2D-результатов в качестве шаблонов перейдите к опции ввода-вывода функции выбора подмножества и нажмите на кнопку обзора справа от выбранных классов из model.star. Затем выберите run_it025_model.отметьте в качестве входных данных и нажмите на запуск во всплывающем окне, проверьте сортировку изображений и обратную сортировку. Затем нажмите на дисплей. После выбора хороших репрезентативных 2D-результатов в качестве ссылки на функцию автоматического выбора, щелкните правой кнопкой мыши и выберите сохранить выбранные классы.Чтобы использовать шаблон для второго раунда автоподбора, перейдите к опции ввода-вывода функции автоподбора. Нажмите кнопку обзора справа от входных микроснимков для автоматического выбора и выберите micrographs.star. Затем нажмите на обзор справа от 2D-ссылок и выберите class_averages.star.Кроме того, выберите no для или используйте leplossian в Gaussian. Затем выполните извлечение частиц с помощью суффикса подчеркивания шнура, подчеркивания auto pick.star. Выполните 2D-классификацию с использованием частиц.star, с последующим выделением подмножества с помощью run подчеркивание его ноль 20 five_optimizer. star Для извлечения частиц после нажатия кнопки «Обзор» справа от файла звезды микрофотографии в параметре «Ввод-вывод» выберите «Микроснимки». и выберите да или повторно извлеките очищенные частицы.После нажатия кнопки «Обзор» справа от файла звезды «Очищенные частицы» выберите «Частицы». star для генерации начальной 3D-модели и эталонной карты, нажмите на просмотр 3D начальной модели справа от входного файла звезды изображений в опции IO и выберите предыдущую particles.star. Затем в опции оптимизации установите количество классов равным одному, а диаметр маски A — 140.Для 3D классификации и генерации предварительной 3D карты, после выбора частиц. как показано ранее, нажмите на обзор справа от справочной карты и выберите начальную точку подчеркивания модели mrc. Затем в параметре оптимизации установите число классов от четырех до шести, а диаметр маски A — 140.Для генерации маски, выбрав хорошую 3D-карту в качестве входных данных в параметре ввода-вывода, установите начальный порог бинаризации равным 0,05, а двоичную карту расширить до этого количества пикселей до трех. Далее перейдите к параметру маски и установите. Добавьте мягкий край к этому количеству пикселей до восьми.Для следующей обработки откройте программное обеспечение Trino Spark, создайте новую рабочую область и щелкните конструктор заданий для первого задания. Чтобы импортировать стек частиц, введите путь частицы в поле мета-пути частицы и путь к фильмам в поле пути данных частицы. Затем импортируйте 3D-тома, введя путь к лучшему 3D-тому, сгенерированному ранее, в путь к данным тома и выбрав маску для типа импортируемого тома.Для неоднородной очистки перетащите ранее сгенерированные импортированные частицы подчеркивания в качестве входных частиц частиц неоднородных уточнений частиц. Импортированное подчеркивание громкости, подчеркивание единицы как ввод неоднородных уточнений объема объема и импортированная маска подчеркивания подчеркивает один как ввод неоднородной маски уточнений. Маска. Затем щелкните Q, чтобы начать обработку, и повторите процедуру, чтобы получить хорошее разрешение.S1PRGI 3D карта. После построения плазмиды и подготовки к транзиторной трансфекции добавляют два микрограмма подготовленной ДНК в 200 микролитров трансфектного реагентного буфера. Перемешайте путем вихря в течение 10 секунд и ненадолго вращая смесь перед использованием.Добавьте четыре микролитра трансфекционного реагента и перемешайте его путем вихря и вращения, как показано ранее. После инкубации трубки при комнатной температуре в течение 15 минут медленно опустите 200 микролитров трансфекционной смеси в каждую лунку из шести лунок пластины, содержащей CHOK one cells и осторожно встряхните пластину или тщательно перемешайте. После четырех-шести часов инкубации замените трансфекционную среду средой роста клеток, состоящей из среды F 12 и 10% fbs, прежде чем возвращать пластину в инкубатор.Через 24-48 часов после трансекционного сбора клеток приостанавливают клетки в трех миллилитрах sa-буфера с D-люциферианской калиевой солью. Затем, используя многоканальную пипетку, добавьте 90 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку из 96 лунок, аккуратно перемешанную и инкубируем при комнатной температуре в течение 40 минут. Для определения флуоресцентного сигнала сначала готовят 10 растворов миллимолярного запаса сипонимода в D M S O. Затем производят последовательное разбавление в буфере H B S S, содержащем 25 микромолярного форскалина и стимулируют клетки 10 микролитрами различных концентраций этого раствора агониста в течение 30 минут.Затем подсчитайте сигнал люминесценции в считывателе микропластин, выбрав люминесценцию для метода обнаружения. Конечная точка для типа считывания и люминесцентное волокно для типа оптики в соответствующем программном обеспечении. Кроме того, установите коэффициент усиления оптики на 255.Затем импортируйте полученные значения флуоресцентного сигнала в программу электронных таблиц и обработайте данные с помощью функции нелинейной регрессионной кривой соответствия дозы. Комплекс S1PRS GI может быть успешно очищен с помощью хроматографии с исключением размера, которая была проверена страницей SDS. Более того, протокол электронной микроскопии, используемый в этом исследовании, был эффективен в дифференциации между частицами S1PRSGI с четкими и четко определенными 2D-классами и частицами низкого качества.Кроме того, электронная микроскопическая карта S1PR3 GI с хорошим разрешением может быть сгенерирована корреляцией скорняжной оболочки путем неравномерной очистки. После структурного анализа функциональные анализы для S one P R three проводили путем трансфекции C H O K одной клетки с рецепторными и сенсорными плазмидами, что показало, что отношение плазмиды рецептора к плазмиде датчика от одного к трем дает оптимальные результаты. Однако результаты были менее реалистичными в чертовски 2 93 клетках В этой обработке выбор алгоритмов в секции частиц и секции 2D и 3D классификации важен для решения белковых комплексов MPS G, особенно для моделирования утечек и ЭКФ.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Подражая функции сигнальных белков: на пути к искусственному трансдукции сигнала терапии

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Измерение сигнальной связи рецептора с G-белком с помощью радиомаркированного связывания GTP

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Освещение пути к Caspase активации с помощью Bimolecular флуоресценции дополнения

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Титрование ELISA как метод, чтобы определить константу диссоциации взаимодействия лигандов рецепторов

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Выявление ортексин и эндоканнабиноидных рецепторов у взрослых зебрафиш с использованием иммунопероксидаза и иммунофлуоресценции Методы

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Стратегический скрининг и характеристика визуального GPCR-мини-G Белковый сигнальный комплекс для успешной кристаллизации

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Анализ флуоресцентных утечек для исследования дестабилизации мембраны проникающим в клетки пептидом

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Использование флуоресценции с временным разрешением, вызванного белком, для идентификации стабильных локальных конформаций по одному мономеру синуклеина α за раз

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...