Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

Data från S1PRs-Gi-komplexet skördades vid West China Cryo-EM Center i Sichuan University och Cryo-EM Center vid Southern University of Science and Technology (SUSTech) och bearbetades vid Duyu High-Performance Computing Center i Sichuan University. Detta arbete stöddes av Natural Science Foundation of China (32100965 till L.C., 32100988 till W.Y., 31972916 till Z.S.) och heltidspostdoktorala forskningsfonden vid Sichuan University (2021SCU12003 till L.C.)

1. Rening av S1PRs-G-proteinkomplex
<ol><li>För att rena det mänskliga S1PRs-G-proteinkomplexet, klona cDNA: erna av S1PR1 som saknar C-terminala rester 338-382, vildtypen S1PR3, S1PR5 stympad med 345-398 vid C-terminalen och vildtypen Gi1 i pFastBac1-vektorn och cDNA: erna av vildtyp Gβ1 och Gγ2 till pFastBacdual-vektorn (materialtabell). OBS: Alla konstruktioner för S1PR innehåller också haemagglutinin (HA) signalsekvensen följt av en flaggepitoptagg vid N-terminalen och e...

Detta protokoll beskriver en primär pipeline för att bestämma strukturerna för S1PR genom kryo-EM och mäta aktiveringsstyrkan hos S1PR med Gi-medierad cAMP-hämningsanalys. Vissa steg är avgörande för experimentets framgång.
För att rena S1PRs-Gi-komplexet bör virusets kvalitet och hälsan hos sf9-celler ägnas mer uppmärksamhet åt. Uttrycket av receptorn reduceras dramatiskt i fattiga sf9-celler . Hälsan hos sf9-celler bedömdes genom att mäta deras d...

Sfingosin-1-fosfat (S1P), en metabolisk produkt av sfingolipider i cellmembranet, är en allestädes närvarande lysofosfatidisk signalmolekyl som involverar olika biologiska aktiviteter, inklusive lymfocythandel, vaskulär utveckling, endotelintegritet och hjärtfrekvens 1,2,3. S1P utövar sina olika fysiologiska effekter genom fem S1P-receptorsubtyper (S1PRs 1-5); S1PR finns i en mängd olika vävnader och uppvisar unika preferenser för nedströms G-proteiner 4,5. S1PR1 är främst kopplad till Gi-proteinet, som därefter hämmar cAMP-produktionen; S1PR2 och S1PR3 är kopplade till Gi, Gq och G12/13, och S1PR4 och S1PR5 transducerar signal genom Gi och G12/136.
S1P-S1PR-signalering är ett kritiskt terapeutiskt mål för flera sjukdomar, inklusive autoimmuna störningar7, inflammation8, cancer9 och till och med COVID-1910. År 2010 licensierades fingolimod (FTY720) som ett first-in-class-läkemedel riktat mot S1PR för att behandla skovvis multipel skleros (MS)11. Det kan emellertid binda till alla S1PR utom S1PR2, medan ospecifik bindning till S1PR3 resulterar i ödem i hjärnbarken, vaskulär och bronkial förträngning och lungepitelläckage12. Som en alternativ strategi för att öka terapeutisk selektivitet har subtypspecifika ligander för receptorn producerats. Siponimod (BAF312) godkändes 2019 för återfall MS-behandling13; det riktar sig effektivt till S1PR1 och S1PR5, medan det inte har någon affinitet för S1PR3, vilket uppvisar färre biverkningar i klinisk praxis14. År 2020 godkände US Food and Drug Administration ozanimod för MS-terapi15. Det har rapporterats att ozanimod har en 25-faldigt större selektivitet för S1PR1 än för S1PR516. I synnerhet i samband med den nuvarande COVID-19-pandemin har det upptäckts att agonistläkemedel riktade mot S1PR kan användas för att behandla COVID-19 genom att använda immunmodulerande terapitekniker17. I jämförelse med fingolimod har ozanimod visat överlägsenhet när det gäller att sänka symtomen hos COVID-19-patienter och genomgår nu kliniska prövningar10. Att förstå den strukturella grunden och funktionen hos S1PR lägger en viktig grund för att utveckla ett läkemedel som selektivt riktar sig motS1PRs 18.
Många tekniker används för att undersöka den strukturella informationen om biomakromolekyler, inklusive röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) och elektronmikroskopi (EM). Från och med mars 2022 finns det mer än 180 000 strukturer deponerade på Protein Databank (PDB), och de flesta av dem har lösts genom röntgenkristallografi. Men med den första nästan atomära upplösningsstrukturen för TPRV1 (3.4 Å-upplösning) rapporterad av Yifan Cheng och David Julius 2013 19, har kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) blivit en vanlig teknik för proteinstrukturer, och det totala antalet EM PDB-strukturer var mer än10 000. De kritiska genombrottsområdena är utvecklingen av nya kameror för avbildning som kallas direkta elektrondetekteringskameror och nya bildbehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolutionerat strukturbiologi och strukturbaserad läkemedelsupptäckt under det senaste decenniet20. Eftersom förståelse för hur makromolekylära komplex uppfyller sina komplicerade roller i den levande cellen är ett centralt tema inom biologiska vetenskaper, har kryo-EM potential att avslöja konformationer av dynamiska molekylära komplex, särskilt för transmembranproteiner21. G-proteinkopplade receptorer (GPCR) är den största superfamiljen av transmembranproteiner och målen för mer än 30% av de för närvarande marknadsförda läkemedlen22. Utvecklingen av kryo-EM har bidragit till en explosion av högupplösta strukturer av GPCR-G-proteinkomplex, vilket möjliggör strukturell bestämning för "svårhanterliga" mål som fortfarande inte är tillgängliga för röntgenkristallografisk analys i läkemedelsdesign23. Därför ger kryo-EM-applikationen en chans att bestämma den tredimensionella strukturen hos GPCR i nästan inbyggda förhållanden vid nära atomupplösning24. Framsteg inom kryo-EM gör det möjligt att visualisera mekanistiska underlag för GPCR-stimulering eller hämning, och ytterligare fördelar med att avslöja de nya bindningsställena för GPCR-riktad läkemedelsskapande25.
Genom att förlita oss på de enorma framstegen med kryo-EM-teknik har vi identifierat strukturer av agoniserade S1PR1-, S1PR3- och S1PR5-Gi-signalkomplex nyligen26,27. Hos människor finns S1PR i olika vävnader och uppvisar unika preferenser för nedströms G-proteiner 4,5. S1PR1 är främst kopplad till Gi-proteinet, som därefter hämmar 3′,5′-cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) produktion. S1PR3 och S1PR5 kan också kopplas till Gi 6,28. Eftersom Gi-kopplad receptoraktivering minskar produktionen av cAMP29 introducerades en Gi-hämning cAMP-analys för att mäta cAMP-hämningseffekter för att fånga funktionella förändringar26,27. Med hjälp av en mutantversion av Photinus pyralis luciferas där en cAMP-bindande proteindel har infogats, erbjuder denna cAMP-analys en enkel och pålitlig metod för att övervaka GPCR-aktivitet genom förändringar i intracellulär cAMP-koncentration30. Det är en känslig och icke-radioaktiv funktionell analys och kan tillämpas för att övervaka realtidssignalering nedströms av ett brett spektrum av GPCR för läkemedelsupptäcktsändamål31.
Här ges en sammanfattning av de kritiska metoderna för att lösa aktiverings- och läkemedelsigenkänningslägena för S1PR, främst inklusive kryo-EM-manipulationer och en Gi-hämning cAMP-analys. Denna artikel syftar till att ge omfattande experimentell vägledning för ytterligare utforskningar av GPCR: s strukturer och funktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

Lysofosfolipider (LPL) är bioaktiva lipider som inkluderar sfingosin 1-fosfat (S1P), lysofosfatidinsyra etc. S1P, en metabolisk produkt av sfingolipider i cellmembranet, är en av de bäst karakteriserade LPL: erna som reglerar en mängd olika cellulära fysiologiska svar via signalvägar medierade av sfingosin 1-fosfatreceptorer (S1PRs). Detta innebar att S1P-S1PRs signalsystem är ett anmärkningsvärt potentiellt terapeutiskt mål för störningar, inklusive multipel skleros (MS), autoimmuna störningar, cancer, inflammation och till och med COVID-19. S1PR, en liten delmängd av klass A G-proteinkopplad receptor (GPCR) -familjen, består av fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 och S1PR5. Bristen på detaljerad strukturell information hindrar dock läkemedelsupptäckten riktad mot S1PR. Här tillämpade vi kryoelektronmikroskopimetoden för att lösa strukturen hos S1P-S1PRs-komplexet och belyste aktiveringsmekanismen, selektiv läkemedelsigenkänning och G-proteinkoppling genom att använda cellbaserade funktionella analyser. Andra lysofosfolipidreceptorer (LPLR) och GPCR kan också studeras med hjälp av denna strategi.

Innan provet av S1PRs-Gi-komplexet fryses måste det renade provet separeras med storleksuteslutningskromatografi (SEC) och analyseras med gelfiltreringskromatografi. Figur 2 visar S1PR3-Gi-komplexet som ett exempel. Den maximala fraktionen av det homogena GPCR-G-proteinkomplexet var vanligtvis belägen vid ~ 10,5 ml av storleksuteslutningskromatografin (figur 2A). SDS-sidanalys av S1PR3-Gi-komplexet (figur 2B) avslöjar fyra band s...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P utövar sina olika fysiologiska effekter genom underfamiljen S1P-receptorer (S1PR). Här beskrivs en pipeline för att förklara strukturerna och funktionen hos S1PR.

En pipeline för att undersöka strukturer och signalvägar för sfingosin 1-fosfatreceptorer

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Vi tog upp aktiverings- och läkemedelsomräkningsstämningarna för S1PRS av besättning, EM-manipulationer och GI inhab-tillstånd A M P A och mindre betydande grund för att utveckla ett läkemedel som solidt riktar sig mot S1PRS-framsteg i gör det möjligt att virulisera magnistiska undermålningar av GP ZR-stimulering eller bebyggelse och ytterligare fördelar med att avslöja de normala bindningsställena för T BCR-riktad läkemedelsskapande. Kvaliteten på provet är grunden för allt I rätt EM-experiment. De väsentliga faktorerna för enkel beredning inkluderar olika produkttillstånd för SF-linjeförsäljning och en N g-koncentration Att demonstrera proceduren kommer att vara Heli Wang en doktorand från min nivå.För proteinreningsbelastning denna fingerscen en fosfatreceptorer eller S en P R S G proteinkomplexlösning till en storleksuteslutningskromatografi eller S E C-gelfiltreringskolonn som är förbalanserad med S E C-buffert vid en flödeshastighet på 0,5 ml per minut vid fyra grader Celsius. För att använda de uppsamlade fraktionerna för kryoelektronmikroskopi koncentrera dem med en 100 kilodalton cutoff-koncentrator vid 1 300 XG vid fyra grader Celsius. Under databehandling för 2D-klassificering i den preliminära klassificeringen av partiklar väljer du 2D-klassificeringsfunktionen i Rely On-programvaran och klickar på bläddra till höger om stjärnfilen för indatabilder i IO-alternativet.Välj sedan partiklarna.stjärna. Ställ sedan in antalet klasser i optimeringsalternativet till 100 och maskdiametern A till 140. I beräkningsalternativet anger du antalet poolade partiklar till 10 och anger katalogen från en snabb, snabb lokal enhet i fältet kopiera partikel till scratch-katalog.För snabbare bearbetning väljer du ja för använd GPU-acceleration. För delmängdsval av bra 2D-resultat som mallar, gå till IO-alternativet för delmängdsvalsfunktion och klicka på bläddra till höger om välj klasser från model.star. Välj sedan run_it025_model.stjärna som ingång och klicka på kör i popup-fönstret kontrollera sortera bilder på och omvänd sortering. Klicka sedan på displayen. Efter att ha valt bra representativa 2D-resultat som referens för autoplockningsfunktionen, högerklicka och välj spara valda klasser.Om du vill använda mallen för den andra omgången av automatisk plockning går du till alternativet IO för automatisk plockning. Klicka på bläddra till höger om inmatningsmikrografer för automatisk plockning och välj micrographs.star. Klicka sedan på bläddra till höger om 2D-referenser och välj class_averages.star.Välj också nej för eller använd leplossian i av Gaussian. Utför sedan partikelextraktion med sladdunderstrecksuffix understreck auto pick.star. Utför 2D-klassificering med partiklar.stjärna, följt av delmängdsval med run understreck det noll 20 five_optimizer. stjärna För partikelextraktion, efter att ha klickat på bläddra till höger om mikrografstjärnfilen i IO-alternativet, välj mikrografer. stjärna och välj ja för eller extrahera raffinerade partiklar.När du har klickat på bläddra till höger om den raffinerade partikelstjärnfilen väljer du partiklar. stjärna för att generera en initial 3D-modell och en referenskarta, klicka på bläddra i 3D-initialmodellen till höger om stjärnfilen för ingångsbilder i IO-alternativet och välj föregående particles.star. I optimeringsalternativet ställer du sedan in antalet klasser till en och maskdiametern A till 140.För 3D-klassificering och generering av en preliminär 3D-karta efter val av partiklar. stjärna Som visats tidigare, klicka på Bläddra till höger om referenskartan och välj Initial Underscore Model Dot MRC. I optimeringsalternativet ställer du sedan in antalet klasser till fyra till sex och maskdiametern A till 140.För maskgenerering, efter att ha valt en bra 3D-mappning som indata i I/O-alternativet, ställer du in den ursprungliga binariseringströskeln till 0,05 och utökar binär mappning till så många pixlar till tre. Gå sedan till maskalternativet och ställ in. Lägg till mjuk kant till så många pixlar till åtta.För nästa bearbetning öppnar du Trino Spark-programvaran, skapar en ny arbetsyta och klickar på jobbbyggare för det första jobbet. Om du vill importera partikelstacken anger du partikelsökvägen i fältet partikelmetasökväg och filmsökvägen i fältet partikeldatasökväg. Importera sedan 3D-volymer genom att ange sökvägen för den bästa 3D-volymen som genererats tidigare i volymdatavägen och välja mask för den typ av volym som importeras.För ojämn förfining, dra de tidigare genererade importerade understrykningspartiklarna som indata för ojämna förfiningspartiklar partikel. Importerad understrecksvolym, understrykning ett som indata för ojämn förfiningsvolymvolym och importerad understrecksmask understryker ett som indata för ojämn förfiningsmask. Mask. Klicka sedan på Q för att börja bearbeta och upprepa proceduren för att få en bra upplösning.S1PRGI 3D-karta. Efter plasmidkonstruktion och förberedelse för övergående transfektion, tillsätt två mikrogram framställt DNA i 200 mikroliter transfektionsreagensbuffert. Blanda genom att virvla i 10 sekunder och snurra blandningen kort före användning.Tillsätt fyra mikroliter transfektionsreagens och blanda det genom att virvla och snurra som visats tidigare. Efter inkubation av röret vid rumstemperatur i 15 minuter, släpp långsamt 200 mikroliter av transfektionsblandningen i varje brunn i en sexbrunnsplatta innehållande CHOK en celler och skaka försiktigt plattan eller noggrann blandning. Efter fyra till sex timmars inkubation, byt ut transfektionsmediet med celltillväxtmediet bestående av F 12-medium och 10% fbs innan du återför plattan till inkubatorn.24 till 48 timmar efter transsektionsskörd av cellerna, suspendera cellerna i tre milliliter av en SA-buffert med D-luciferiskt kaliumsalt. Använd sedan en flerkanalig pipett, tillsätt 90 mikroliter av cellsuspensionen till varje brunn i en 96-brunnsplatta blandad försiktigt och inkubera vid rumstemperatur i 40 minuter. För bestämning av fluorescenssignal, Bered först 10 millimolära stamlösningar av siponimod i D M S O.Gör sedan en seriell utspädning i H B S S-buffert innehållande 25 mikromolar forskalin och stimulera cellerna med 10 mikroliter olika koncentrationer av denna agonistlösning i 30 minuter.Räkna sedan luminiscenssignalen i en mikroplattläsare genom att välja luminescens för detektionsmetod. Slutpunkt för lästyp och luminiscensfiber för optiktyp i tillhörande programvara. Ställ också in optikförstärkningen till 255.Importera sedan de erhållna fluorescenssignalvärdena till ett kalkylprogram och bearbeta data med hjälp av den icke-linjära regressionskurvan passar dosresponsfunktionen. S1PRS GI-komplexet kunde framgångsrikt renas genom storleksuteslutningskromatografi, vilket verifierades av SDS-sidan. Dessutom var elektronmikroskopiprotokollet som följdes i denna studie effektivt för att skilja mellan S1PRSGI-partiklar med tydliga och väldefinierade 2D-klasser och partiklar av dålig kvalitet.Dessutom kan en elektronmikroskopikarta över S1PR3 GI med god upplösning genereras av furrier skalkorrelation genom ojämn förfining. Efter strukturell analys gjordes funktionella analyser för S en P R tre genom transfektion av C H O K en celler med receptor- och sensorplasmider, vilket avslöjade att receptorplasmid till sensorplasmidförhållande på en till tre ger optimala resultat. Resultaten var dock mindre realistiska i heck 2 93 celler I den bearbetningen är valet av algoritmer i partikelsektionen och sektionen för 2D- och 3D-klassificering viktigt för att lösa so MPS G-proteinkomplexen, särskilt för modellering av läckor och ecfs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Imitera funktionen av signalproteiner: Toward Artificial Signaltransduktion Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Mätning av G-proteinkopplad receptorreceptor via radiomärkt GTP-bindning

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Lysa upp vägarna till kaspas aktiveringen med Bimolecular fluorescens komplettering

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som en metod för att bestämma konstanten Dissociation av Receptor Ligand interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Med öppen källkod MALDI TOF-MS IDBac pipeline för analys av mikrobiellt protein och specialiserade Metabolitdata

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Identifiering av Orexin och Endocannabinoid receptorer hos vuxna zebra fiskar med Immunoperoxidas och immunofluorescens metoder

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening och karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex för framgångsrik kristallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Fluorescerande läckageanalys för att undersöka membranstabilisering av cellgenomträngande peptid

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Använda tidsupplöst proteininducerad fluorescensförbättring för att identifiera stabila lokala konformationer en α-synukleinmonomer i taget

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...