Name: a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

S1PRs-Gi kompleksinin verileri, Sichuan Üniversitesi'ndeki Batı Çin Cryo-EM Merkezi'nde ve Güney Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'ndeki (SUSTech) Cryo-EM Merkezi'nde toplandı ve Sichuan Üniversitesi'ndeki Duyu Yüksek Performanslı Bilgi İşlem Merkezi'nde işlendi. Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (32100965 L.C.'ye, 32100988 W.Y.'ye, 31972916 Z.S.'ye) ve Sichuan Üniversitesi tam zamanlı Doktora Sonrası Araştırma Fonu (2021SCU12003'ten L.C.'ye) tarafından desteklenmiştir.

1. S1PRs-G protein kompleksinin saflaştırılması
<ol><li>İnsan S1PR'leri-G protein kompleksini saflaştırmak için, C-terminal kalıntıları 338-382'den yoksun olan S1PR1'in cDNA'larını, C-terminus'ta 345-398 ile kesilmiş vahşi tip S1PR3, S1PR5'i ve vahşi tip Gi1'i pFastBac1 vektörüne ve vahşi tip Gβ1 ve Gγ2'nin cDNA'larını pFastBacdual vektörüne (Malzeme Tablosu) klonlayın. NOT: S1PR'ler için tüm yapılar ayrıca haemagglutinin (HA) sinyal dizisini ve ardınd...

Bu protokol, S1PR'lerin yapılarını kriyo-EM ile belirlemek ve Gi-aracılı cAMP inhibisyon testi ile S1PR'lerin aktivasyon gücünü ölçmek için birincil bir boru hattını açıklamaktadır. Bazı adımlar deneyin başarısı için çok önemlidir.
S1PRs-Gi kompleksini saflaştırmak için, virüsün kalitesine ve sf9 hücrelerinin sağlığına daha fazla dikkat edilmelidir. Reseptörün ekspresyonu, zayıf sf9 hücrelerinde önemli ölçüde azalır. Sf9 hü...

Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan Sfengosin-1-fosfat (S1P), lenfosit kaçakçılığı, vasküler gelişim, endotel bütünlüğü ve kalp atış hızı 1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktiviteleri içeren her yerde bulunan bir lizofosfatidik sinyal molekülüdür. S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini beş S1P reseptör alt tipi (S1PRs 1-5) aracılığıyla uygular; S1PR'ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri için benzersiz tercihler sergiler 4,5. S1PR1 öncelikle daha sonra cAMP üretimini inhibe eden Gi proteini ile birleştirilir; S1PR2 ve S1PR3, Gi, Gq ve G12/13 ile birleştirilir ve S1PR4 ve S1PR5, Gi ve G12/136 üzerinden sinyal dönüştürür.
S1P-S1PR sinyalizasyonu, otoimmün bozukluklar7, inflamasyon8, kanser 9 ve hatta COVID-1910 dahil olmak üzere birçok hastalık için kritik bir terapötik hedeftir. 2010 yılında, fingolimod (FTY720), nüks multipl sklerozu (MS) 11'i tedavi etmek için S1PR'leri hedefleyen birinci sınıf bir ilaç olarak lisanslanmıştır. Bununla birlikte, S1PR2 hariç tüm S1PR'lere bağlanabilirken, S1PR3'e spesifik olmayan bağlanma, serebral korteksin ödemi, vasküler ve bronşiyal daralma ve akciğer epitel sızıntısı12 ile sonuçlanır. Terapötik seçiciliği arttırmak için alternatif bir strateji olarak, reseptör için alt tipe özgü ligandlar üretilmiştir. Siponimod (BAF312) 2019 yılında nüks MS tedavisi için onaylanmıştır13; S1PR1 ve S1PR5'i etkili bir şekilde hedeflerken, S1PR3 için afinitesi yoktur, klinik uygulamada daha az yan etki gösterir14. 2020 yılında, ABD Gıda ve İlaç İdaresi, MS tedavisi için ozanimod'u yetkilendirdi15. Ozanimod'un S1PR1 için S1PR516'dan 25 kat daha fazla seçiciliğe sahip olduğu bildirilmiştir. Özellikle, mevcut COVID-19 pandemisi bağlamında, S1PR'leri hedef alan agonist ilaçların, immünomodülatör tedavi teknikleri kullanılarak COVID-19'u tedavi etmek için kullanılabileceği keşfedilmiştir17. Fingolimod ile karşılaştırıldığında, ozanimod COVID-19 hastalarında semptomları azaltmada üstünlük göstermiştir ve şimdi klinik çalışmalardan geçmektedir10. S1PR'lerin yapısal temelini ve işlevini anlamak, S1PR'ler18'i seçici olarak hedefleyen bir ilaç geliştirmek için önemli bir temel oluşturur.
X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve elektron mikroskobu (EM) dahil olmak üzere biyomakromoleküllerin yapısal bilgilerini araştırmak için birçok teknik kullanılmaktadır. Mart 2022 itibariyle, Protein Veri Bankası'na (PDB) yatırılan 180.000'den fazla yapı var ve bunların çoğu X-ışını kristalografisi ile çözüldü. Bununla birlikte, Yifan Cheng ve David Julius tarafından 201319'da bildirilen TPRV1'in ilk atomik çözünürlüğe yakın yapısı (3.4 şçözünürlük) ile, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) protein yapıları için ana akım bir teknik haline gelmiştir ve EM PDB yapılarının toplam sayısı 10.000'den fazlaydı. Kritik atılım alanları, doğrudan elektron algılama kameraları ve yeni görüntü işleme algoritmaları olarak bilinen görüntüleme için yeni kameraların geliştirilmesidir. Cryo-EM, son on yılda yapı biyolojisinde ve yapı tabanlı ilaç keşfinde devrim yarattı20. Makromoleküler komplekslerin canlı hücredeki karmaşık rollerini nasıl yerine getirdiklerini anlamak, biyolojik bilimlerde merkezi bir tema olduğundan, kriyo-EM, özellikle transmembran proteinleri için dinamik moleküler komplekslerin konformasyonlarını ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir21. G-protein eşleşmiş reseptörleri (GPCR'ler), transmembran proteinlerinin en büyük süper ailesidir ve şu anda pazarlanan ilaçların% 30'undan fazlasının hedefleridir22. Kriyo-EM'nin gelişimi, GPCR-G protein komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapılarının patlamasına katkıda bulunarak, ilaç tasarımında X-ışını kristalografik analizi için hala erişilemeyen 'inatçı' hedefler için yapısal belirlemeyi mümkün kılmıştır23. Bu nedenle, kriyo-EM uygulaması, GPCR'lerin üç boyutlu yapısını, atomik çözünürlük24'e yakın doğal koşullarda belirleme şansı sağlar. Kriyo-EM'deki ilerlemeler, GPCR stimülasyonunun veya inhibisyonunun mekanik temellerini görselleştirmeyi mümkün kılmakta ve GPCR hedefli ilaç üretimi için yeni bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasında daha fazla fayda sağlamaktadır25.
Kriyo-EM teknolojisinin muazzam adımlarına dayanarak, son zamanlarda26,27 olan acı çeken S1PR1-, S1PR3- ve S1PR5-Gi sinyal komplekslerinin yapılarını belirledik. İnsanlarda, S1PR'ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri 4,5 için benzersiz tercihler sergiler. S1PR1 öncelikle Gi proteini ile birleştirilir ve bu da daha sonra 3′,5′-siklik adenozin monofosfat (cAMP) üretimini inhibe eder. S1PR3 ve S1PR5 ayrıca Gi 6,28 ile birleşebilir. Gi-kuplajlı reseptör aktivasyonu cAMP29'un üretimini azalttığından, fonksiyonel değişiklikleri yakalamak için cAMP inhibisyon etkilerini ölçmek için bir Gi-inhibisyon cAMP testi tanıtıldı26,27. Bir cAMP bağlayıcı protein parçasının yerleştirildiği Photinus pyralis luciferase'in mutant bir versiyonunu kullanarak, bu cAMP testi, hücre içi cAMP konsantrasyonundaki değişiklikler yoluyla GPCR aktivitesini izlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sunar30. Hassas ve radyoaktif olmayan fonksiyonel bir testtir ve ilaç keşfi amacıyla çok çeşitli GPCR'lerin gerçek zamanlı aşağı akış sinyalizasyonunu izlemek için uygulanabilir31.
Burada, öncelikle kriyo-EM manipülasyonları ve bir Gi-inhibisyon cAMP testi dahil olmak üzere, S1PR'lerin aktivasyon ve ilaç tanıma modlarının çözümünde kritik yöntemlerin bir özeti verilmiştir. Bu makale, GPCR'lerin yapı ve işlevlerine yönelik daha ileri araştırmalar için kapsamlı deneysel rehberlik sağlamayı amaçlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;M filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 42213-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 kDa cut-off concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 43016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 3917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 9087-70-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# M0398S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baculovirus transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 10362100</td>
			<td>For the preparation of P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C6512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSPARC</td>
			<td>Punjani, A., et al.,2017</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent E.coli</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# EC0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin-Potassium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# 50227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF921 cell culture medium</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>Cat#&#160; 96-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 11765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Cell Box</td>
			<td>Cat# SAG-01U-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag resin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>Cat# B1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gctf</td>
			<td>Zhang, 2016</td>
			<td>&#160;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDN</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# GDN101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>Cat# 28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 3.11</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# L1312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor cAMP assay kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E1291</td>
			<td>Gi-inhibition cAMP assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloSensor plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Cat# E2301</td>
			<td>Sensor plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>Cat# 11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 88284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>Cat# H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPRIME Reagent</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>Cat# 114-15</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janamycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# K1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMNG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat# NG310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCor2</td>
			<td>(Zheng et al., 2017)</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoCab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 1121822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-G&#945;i</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBacdual-G&#946;1&#947;2</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# K210003</td>
			<td>For the preparation of plasmids and P0 baculovirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>Cat# E0554S</td>
			<td>For the preparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Cat# 251448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION-3.1</td>
			<td>(Zivanov et al., 2018)</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1PRs cDNA</td>
			<td>addgene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scFv16</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# 703976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siponimod</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>Cat# S7179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 microplate reader</td>
			<td>BIO-TEK</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic T4L DNA (sequence)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg 
			cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg 
			ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca 
			aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga 
			actggacaaagccattggtcgcaacaccaac 
			ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac 
			tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg 
			catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt 
			atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt 
			gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg 
			agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc 
			agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga 
			atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc 
			taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg 
			tactggaacttgggacgcttac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Cat# T8180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pipeline to investigate the structures and signaling pathways of sphingosine 1-phosphate receptors

Lizofosfolipitler (LPL'ler), sfengozin 1-fosfat (S1P), lizofosfatidik asit vb. İçeren biyoaktif lipitlerdir. Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan S1P, sfengozin 1-fosfat reseptörlerinin (S1PR'ler) aracılık ettiği sinyal yolları aracılığıyla çeşitli hücresel fizyolojik yanıtları düzenleyen en iyi karakterize LPL'lerden biridir. Bu, S1P-S1PR sinyal sisteminin, multipl skleroz (MS), otoimmün bozukluklar, kanser, inflamasyon ve hatta COVID-19 dahil olmak üzere bozukluklar için dikkate değer bir potansiyel terapötik hedef olduğunu göstermektedir. A sınıfı G-protein eşleşmiş reseptör (GPCR) ailesinin küçük bir alt kümesi olan S1PR'ler beş alt tipten oluşur: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 ve S1PR5. Bununla birlikte, ayrıntılı yapısal bilgi eksikliği, S1PR'leri hedef alan ilaç keşfini engellemektedir. Burada, S1P-S1PR kompleksinin yapısını çözmek için kriyo-elektron mikroskobu yöntemini uyguladık ve hücre bazlı fonksiyonel tahliller kullanarak aktivasyon, seçici ilaç tanıma ve G-protein eşleşmesi mekanizmasını aydınlattık. Diğer lizofosfolipid reseptörleri (LPLR'ler) ve GPCR'ler de bu strateji kullanılarak incelenebilir.

S1PRs-Gi kompleksinin numunesini dondurmadan önce, saflaştırılmış numunenin boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrılması ve jel filtrasyon kromatografisi ile analiz edilmesi gerekir. Şekil 2 , örnek olarak S1PR3-Gi kompleksini göstermektedir. Homojen GPCR-G protein kompleksinin tepe fraksiyonu genellikle boyut dışlama kromatografisinin ~ 10.5 mL'sinde bulunuyordu (Şekil 2A). S1PR3-Gi kompleksinin SDS sayfası analizi (Şe...

Watch this Scientific Journal Video about A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors at JoVE.com

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini S1P reseptörleri (S1PR'ler) alt ailesi aracılığıyla uygular. Burada, S1PR'lerin yapılarını ve işlevlerini açıklamak için bir boru hattı açıklanmaktadır.

Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

S1PRS'nin mürettebat, EM manipülasyonları ve GI inhab durumu A M P A tarafından aktivasyonu ve ilaç yeniden hesaplama ruh hallerini ele aldık ve S1PRS'yi sağlam bir şekilde hedefleyen bir ilaç geliştirmek için daha az önemli bir temel oluşturduk GP ZR stimülasyonu veya yerleşiminin magnisistik alt resimlerini virülize etmeyi mümkün kılan ilerlemeler ve T BCR hedefli ilaç üretimi için normal bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasında daha fazla fayda sağladık. Numunenin kalitesi, doğru EM deneyindeki her şeyin temelidir. Basit hazırlık için gerekli faktörler arasında SF hattı satışının çeşitli ürün durumu ve bir N g konsantrasyonu Prosedürün gösterilmesi, benim seviyemden bir yüksek lisans öğrencisi olan Heli Wang olacaktır.Protein saflaştırma için bu parmak sahnesini bir fosfat reseptörü veya S bir P R S G protein kompleksi çözeltisini, dört santigrat derecede dakikada 0,5 mililitrelik bir akış hızında S E C tamponu ile önceden dengelenmiş bir boyut dışlama kromatografisine veya S E C jel filtrasyon kolonuna yükler. Toplanan fraksiyonları kriyo elektron mikroskobu için kullanmak için, dört santigrat derecede 1.300 XG'de 100 kilodaltonluk bir kesme yoğunlaştırıcısı kullanarak konsantre edin. Parçacıkların ön sınıflandırmasında 2B sınıflandırma için veri işleme sırasında, Güvene Güvenin yazılımındaki 2B sınıflandırma işlevini seçin ve G/Ç seçeneğindeki giriş görüntüleri yıldız dosyasının sağına göz at'ı tıklatın.Ardından particles.star'ı seçin. Ardından, optimizasyon seçeneğinde, sınıf sayısını 100 ve maske çapı A'yı 140 olarak ayarlayın. Hesaplama seçeneğinde, havuza alınmış parçacık sayısını 10 olarak ayarlayın ve parçacığı çizik kopyalama dizini alanına hızlı, hızlı bir yerel sürücüden dizini girin.Daha hızlı işleme için, kullanılmış GPU hızlandırma için evet'i seçin. İyi 2B sonuçların şablon olarak alt küme seçimi için, alt küme seçim işlevinin GÇ seçeneğine gidin ve model.star'dan seçilen sınıfların sağına göz atın. Ardından, run_it025_model'yi seçin.giriş olarak yıldız verin ve açılır pencerede çalıştır'a tıklayın, görüntüleri sıralayın ve ters sıralayın. Ardından ekrana tıklayın. Otomatik toplama işlevinin referansı için referans olarak iyi temsili 2D sonuçları seçtikten sonra, Sağ tıklayın ve seçilen sınıfları kaydet'i seçin.Şablonu otomatik toplamanın ikinci turunda kullanmak için, otomatik toplama işlevinin GÇ seçeneğine gidin. Otomatik seçim için giriş mikrograflarının sağına göz at'ı tıklatın ve micrographs.star'ı seçin. Ardından 2D referansların sağına göz atın ve class_averages.star'ı seçin.Ayrıca, Gaussian'da leplossian için hayır'ı seçin veya kullanın. Ardından, kablo alt çizgi sonekini kullanarak parçacık çıkarma işlemini gerçekleştirin auto pick.star alt çizgisini kullanın. Parçacıkları kullanarak 2B sınıflandırma gerçekleştirin.yıldız, ardından alt küme seçimi kullanılarak çalıştırma alt çizgisi sıfır 20 five_optimizer. star Parçacık çıkarma için, IO seçeneğinde mikrograf yıldız dosyasının sağına gözat'ı tıkladıktan sonra mikrografları seçin. yıldız ekleyin ve rafine edilmiş parçacıklar için evet'i seçin veya yeniden ayıklayın.Rafine parçacıklar yıldız dosyasının sağına göz at'ı tıklattıktan sonra, parçacıkları seçin. İlk 3B model ve referans haritası oluşturmak için yıldız, G/Ç seçeneğindeki giriş görüntüleri yıldız dosyasının sağındaki 3B başlangıç modeline göz atmayı tıklayın ve önceki particles.star'ı seçin. Ardından optimizasyon seçeneğinde, sınıf sayısını bire ve maske çapı A'yı 140 olarak ayarlayın.3B sınıflandırma ve parçacıkları seçtikten sonra bir ön 3B harita oluşturmak için. daha önce gösterildiği gibi yıldız, referans haritasının sağına göz atın ve ilk alt çizgi modeli nokta mrc'yi seçin. Ardından, en iyileştirme seçeneğinde, sınıf sayısını dört ila altı ve maske çapı A'yı 140 olarak ayarlayın.Maske oluşturmak için, GÇ seçeneğinde giriş olarak iyi bir 3B eşleme seçtikten sonra, ilk ikili eşleme eşiğini 0,05 olarak ayarlayın ve ikili eşlemeyi bu kadar piksele üç piksele genişletin. Ardından, maske seçeneğine gidin ve ayarlayın. Bu kadar piksele sekize yumuşak kenar ekleyin.Sonraki işlemler için Trino Spark yazılımını açın, yeni bir çalışma alanı oluşturun ve ilk iş için iş oluşturucuya tıklayın. Parçacık yığınını içe aktarmak için, parçacık meta yolu alanına parçacık yolunu ve parçacık veri yolu alanına film yolunu girin. Ardından, birim veri yolunda daha önce oluşturulan en iyi 3B birimin yolunu girerek ve içe aktarılan birimin türü için maskeyi seçerek 3B birimleri içe aktarın.Düzgün olmayan arıtma için, daha önce oluşturulmuş içe aktarılan alt çizgi parçacıklarını, düzgün olmayan arıtmalar parçacıkları parçacığının girdisi olarak sürükleyin. İçe aktarılan alt çizgi hacmi, tekdüze olmayan iyileştirmeler hacmi hacminin girdisi olarak birinin altını çizin ve içe aktarılan alt çizgi maskesi, tekdüze olmayan iyileştirmeler maskesinin girdisi olarak bir alt çizgi maskesinin altını çizer. Maske. Ardından, işlemeye başlamak için Q'yu tıklatın ve iyi bir çözüm elde etmek için yordamı tekrarlayın.S1PRGI 3D harita. Plazmid yapımı ve geçici transfeksiyon için hazırlıktan sonra, 200 mikrolitre transfeksiyon reaktif tamponuna iki mikrogram hazırlanmış DNA ekleyin. 10 saniye boyunca vorteks yaparak karıştırın ve kullanmadan önce karışımı kısa bir süre döndürün.Dört mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi vorteks ve eğirme ile karıştırın. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ettikten sonra, 200 mikrolitre transfeksiyon karışımını CHOK bir hücre içeren altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna yavaşça bırakın ve plakayı veya iyice karıştırın. Dört ila altı saatlik inkübasyondan sonra, plakayı inkübatöre geri döndürmeden önce transfeksiyon ortamını F 12 ortamı ve% 10 fbs'den oluşan hücre büyüme ortamı ile değiştirin.Hücrelerin transeksiyon hasadından 24 ila 48 saat sonra, hücreleri D lusiferyen potasyum tuzu ile bir SA tamponunun üç mililitresinde askıya alın. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, hafifçe karıştırılmış 96 kuyucuklu bir plakanın her bir oyuğuna 90 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika boyunca inkübe edin. Floresan sinyal tayini için, İlk olarak, D M S O.'da siponimod'un 10 milimolar stok çözeltilerini hazırlayın.Daha sonra 25 mikromolar forskalin içeren H B S S tamponunda seri seyreltme yapın ve hücreleri 30 dakika boyunca bu agonist çözeltinin çeşitli konsantrasyonlarında 10 mikrolitre ile uyarın.Ardından, algılama yöntemi için lüminesansı seçerek bir mikroplaka okuyucudaki lüminesans sinyalini sayın. Okuma türü için uç nokta ve ilgili yazılımdaki optik türü için lüminesans fiber. Ayrıca, optik kazancını 255 olarak ayarlayın.Ardından, elde edilen floresan sinyal değerlerini bir elektronik tablo programına aktarın ve doğrusal olmayan regresyon eğrisi uygun doz yanıtı işlevini kullanarak verileri işleyin. S1PRS GI kompleksi, SDS sayfası tarafından doğrulanan boyut dışlama kromatografisi ile başarıyla saflaştırılabilir. Ayrıca, bu çalışmada izlenen elektron mikroskobu protokolü, açık ve iyi tanımlanmış 2D sınıfları ve düşük kaliteli parçacıkları olan S1PRSGI parçacıkları arasında ayrım yapmada etkili olmuştur.Ayrıca, iyi bir çözünürlüğe sahip S1PR3 GI'nin elektron mikroskobu haritası, düzgün olmayan arıtma yoluyla kürk kabuğu korelasyonu ile üretilebilir. Yapısal analizden sonra, S bir P R üç için fonksiyonel testler, C H O K bir hücrenin reseptör ve sensör plazmidleri ile transfeksiyonu ile yapıldı, bu da reseptör plazmidinin sensör plazmidine oranının bir ila üç arasında optimum sonuçlar verdiğini ortaya koydu. Bununla birlikte, sonuçlar heck 2 93 hücrelerinde daha az gerçekçiydi Bu işlemede, parçacık bölümündeki algoritmaların seçimi ve 2B ve 3B sınıflandırma bölümü, özellikle sızıntıları ve ecf'leri modellemek için MPS G protein komplekslerini çözmek için önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Sinyal Proteinlerin Fonksiyonu taklit: Yapay Sinyal İletimi Tedavisi Doğru

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...